Indica lo studio dell ereditarietà e della variazione tra generazioni di organismi. geni cromosomi Batteri :1 cromosoma batterico 5000 geni.

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1 Genetica dei batteri Indica lo studio dell ereditarietà e della variazione tra generazioni di organismi. Le unità fondamentali dell ereditarietà sono i geni. I geni sono disposti lungo filamenti di materiale genetico che sono detti cromosomi. 46 cromosomi uomo (23 coppie) che codificano per 1milione di geni. Batteri :1 cromosoma batterico 5000 geni.

2 L importanza dei batteri in genetica: a) Replica rapida. b) Omogeneità genetica. c) Trasferimento di materiale genetico tra 2 batteri. d) Coltivare, manipolare in spazi ridotti. e) Le funzioni geniche sono la base delle funzioni cellulari. f) Biotecnologie: utilizzazione dei batteri in Microbiologia Industriale. g) I geni codificano anche per fattori di virulenza. h) Lo scambio genetico permette nuove proprietà ai batteri (R agli antibiotici, tossine, R ai disinfettanti, adesine).

3 Divisione per scissione binaria Genetica dei batteri DNA circolare con 1-5 milioni di coppie di basi. E legato alla membrana citoplasmatica. La divisione avviene per scissione binaria

4 La crescita batterica La crescita batterica consiste in uno sviluppo coordinato di tutti i componenti strutturali della cellula ed è in relazione alla capacità della cellula di sintetizzare i metaboliti necessari per l accrescimento. La crescita implica: a) un aumento della massa cellulare e del n di ribosomi b) duplicazione del cromosoma batterico c) sintesi di nuova parete cellulare d) sintesi della membrana citoplasmatica e) ripartizione dei due cromosomi f) formazione di un setto g) divisione cellulare h) crescita e separazione delle due cellule figlie

5 Genetica dei batteri a) Un unico cromosoma. b) Assenza di istoni. Genoma batterico c) Tendenza dei geni batterici a legarsi in unità trascrizionali detti operon. d) Presenza di plasmidi. e) Replica semiconservativa del DNA.

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7 Il genoma batterico Cromosoma Plasmidi Batteriofagi Sequenze d inserzione Trasposoni

8 Genetica dei batteri Scambio genetico tra batteri: Trasformazione. Trasduzione. Coniugazione.

9 Caratteristiche comuni dei 3 processi di scambio genetico: a) Solo una parte del cromosoma viene trasferita. b) La trasmissione è unidirezionale. c) Non si forma mai un vero zigote. d) La parte trasferita non è dotata di replica autonoma (tranne nel caso il cui il trasferimento interessa un plasmide coniugativo).

10 Trasformazione: E il trasferimento di informazioni genetiche per mezzo di DNA extracellulare. Morte cellulare --> rilascio di DNA --> DNA che penetra nella cellula ricevente --> Sintesi proteica--> Adsorbimento--> Incorporazione--> Ricombinazione nel cromosoma della cellula--> Acquisizione di nuovi caratteri da parte della cellula ricevente.

11 Trasformazione: Esperimento di Griffith : 1928 Streptococcus pneumoniae Patogenicità legata alla capsula polisaccaridica. - Colonie liscie presenza di capsula S. - Colonie rugose assenza di capsula R.

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13 Genetica dei batteri Trasformazione: I batteri morti di tipo S contengono una sostanza che Griffith chiamò principio trasformante capace di trasformare in virulenti e di tipo S i batteri di tipo R. 1944: Avery, Mac leod in vitro in provetta dimostrarono che il principio trasformante non era altro che il DNA.

14 1953:James Watson e Francis Crick scoprono la struttura del DNA

15 Genetica dei batteri Trasformazione: La cellula ricevente è in grado di ricevere il DNA in uno stato fisiologico detto competenza. a) Interazione con un recettore. b) Adsorbimento, incorporazione. c) Integrazione del DNA.

16 Genetica dei batteri 1) Sviluppo dello stato di competenza: La cellula libera nell ambiente la proteina detta fattore di competenza. a) Interazione con appositi recettori di superficie della cellula che produce il fattore. b) Sintesi di un autolisina che digerisce parte della parete cellulare esponendo la membrana in cui si espongono alcune proteine come: la proteina DNA- binding ed una nucleasi specifica.

17 Genetica dei batteri a) Frammenti di DNA bicatenario presenti nell ambiente si legano alle proteine DNAbinding. b) Un filamento viene digerito dalla nucleasi specifica. c) Il filamento residuo, complessato ad alcune proteine specifiche ed introdotto nella cellula dove per analogia di basi si integra nel genoma batterico, spiazzando un parte dei due filamenti della molecola originaria.

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19 Genetica dei batteri : Trasduzione Il trasferimento genetico di DNA tra batteri mediato da fagi (virus batterici). I fagi possono essere: Fagi temperati (Ciclo lisogeno). Fagi litici (Ciclo litico). I fagi trasducenti sono difettivi, perché il pezzo di DNA batterico ha preso il posto del pezzo di DNA fagico.

20 Genetica dei batteri La trasduzione può avvenire secondo 2 modalità Trasduzione generalizzata, Trasduzione specializzata. Trasduzione generalizzata: Quando il fago include e trasferisce qualunque regione del cromosoma batterico donatore alla cellula ricevente.

21 Trasduzione generalizzata: Avviene durante il ciclo litico di fagi virulenti e temperati e può trasferire qualsiasi parte del genoma batterico. Durante la fase di assemblaggio, frammenti casuali del cromosoma batterico possono essere impacchettati per errore al posto del genoma virale. Le particelle virali che ne derivano spesso iniettano il DNA in altre cellule batteriche, ma non sono capaci di iniziare da sole un ciclo litico. E un semplice trasportatore dell informazione genetica da un batterio all altro. Una volta che il DNA è stato iniettato deve essere incorporato nel cromosoma della cellula ricevente e la cellula acquisisce la nuova informazione.

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24 Trasduzione specializzata: Il profago si può distaccare dal genoma batterico, iniziare la sua replica e dare origine al ciclo litico. Distacco del DNA virale dal DNA batterico può avvenire in modo errato con asportazione di porzioni adiacenti di DNA batterico, lasciando porzioni della stessa lunghezza di genoma fagico.

25 Trasduzione specializzata: I fagi della progenie virale conterranno una porzione di DNA batterico che verrà trasportata passivamente in una nuova cellula quando il batterio vi si trasferisce. Comparsa di un nuovo carattere del batterio donatore. Sono trasferiti i frammenti del cromosoma batterico sempre derivanti da regioni adiacenti al sito d inserzione tipico del profago

26 Coniugazione La Coniugazione è un processo che avviene attraverso una particolare struttura anatomica (pilo sessuale) posseduto dal batterio donatore, che unisce le due cellule in accoppiamento. La cellula donatrice ha un plasmide che porta l informazione genetica che codifica la sintesi del pilo.

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28 Coniugazione Possibili ricombinazioni : F+ x F > da F+. Hfr x F- ---->da molte copie di geni del loro cromosoma. F x F > da molti geni che codificano per il fattore F.

29 Durante l incrocio F+ X F- il fattore F si replica mediante il meccanismo del cerchio rotante e una sua copia viene trasferita alla cellula ricevente. Il filamento che entra viene copiato per produrre una molecola di DNA bicatenario.

30 Plasmide F+ (Fertilità). Plasmide F- (non presenta fattore F). Il fattore F può esistere libero nel citoplasma, replica autonoma o si integra nel cromosoma batterico (Hfr) e replicarsi ogni volta che il batterio produce una copia del suo cromosoma (episoma).

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32 Incrocio Hfr X F- : Hfr: Alta frequenza di ricombinazione. Perché mostra una alta efficienza a trasferire mat. cromosomico del donatore a una cellula ricevente F- Il trasferimento del DNA inizia quando il fattore F integrato viene inciso a livello del suo sito di origine della replicazione. Solo una parte del fattore F viene trasferito, il ricevente F- non diventa F+ a meno che non viene trasferito l intero cromosoma. Tale evento è molto raro.

33 Plasmidi: Elementi genetici extracromosomiali. I plasmidi oltre a venir trasmessi verticalmente da cellula madre a cellula figlia, possono trasferirsi orizzontalmente tra cellule diverse. Replica autonoma. DNA bicatenario circolare. Pm da 1 milione -100 milioni. Sono suddivisi in 2 tipi: coniugativi e metabolici.

34 Struttura del plasmide R RTF = fattore di trasferimento (geni tra) determinanti R Geni resistenza Trasposoni

35 Plasmidi coniugativi Partecipano nel processo di Coniugazione. Trasmissione attraverso il pilo sessuale. Un singolo batterio può contenere numerosi plasmidi differenti e di diverse dimensioni.

36 Plasmidi metabolici: Codificano per enzimi che catalizzano reazioni cataboliche: Resistenza agli antibiotici, R, RTF. Produzione di colicine. Produzione di enterotossine. Produzione di adesine. Produzione siderofori. Degradazione della canfora, toluene, salicilati, lattosio, ureasi.

37 Principali funzioni dei plasmidi di interesse medico Coniugazione : Plasmide F, meccanismo di trasferimento genico Resistenza agli antibiotici: Plasmidi R Degradazione enzimatica (e.g. penicillina) Modificazioni enzimatiche (e.g. cloramfenicolo) Alterata permeabilità (e.g. tetracicline) Alterazione del target (e.g. streptomicine) Via metabolica alternativa (e.g. sulfamidici)

38 Principali funzioni dei plasmidi di interesse medico Virulenza: Produzione di enterotossine. Produzione di adesine. Metabolismo e Catabolismo: produzione di siderofori Altre funzioni: Degradazione della canfora, toluene, salicilati, lattosio, ureasi.

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40 Tecnologia del DNA ricombinante

41 ESEMPI DI PRODOTTI FARMACEUTICI OTTENUTI MEDIANTE LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE Prodotto genico Utilizzazione ed anno di approvazione Ormoni Insulina Trattamento del diabete (1985) Ormone umano della crescita (somatotropina) Deficit di crescita (1985) Eritropoietina Anemia associata a insufficienza renale (1989)

42 Proteine del sangue Attivatore tissutale del plasminogeno Utilizzazione ed anno di approvazione Infarto miocardio acuto (1987) Fattore VIII di coagulazione Emofilia A (1992) Enzimi DNasi umana Vaccini Epatite B Immunomodulatori Interferone alfa-2a Interferone alfa-2b Interferone beta-1a Fibrosi cistica (1993) (1986) Leucemia (1986) Sarcoma Kaposi (1988) Leucemia (1986) Sarcoma Kaposi (1988) Epatite C (1991) Sclerosi (1996)

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44 Elementi Genetici Trasponibili Sequenze di Inserzione (IS) Trasposoni (Tn)

45 Gli elementi IS Le IS sono unità autonome e codificano solo per le proteine necessarie alla propria trasposizione. Sono costituenti comuni di cromosomi e plasmidi IR 210 bp 273 bp IR { E.coli 3-12 InsA InsB IS1 Shigella Serratia bp IR Trasposasi IR IS2, IS3, IS4, IS5 lunghezza media sequenze IS: bp lunghezza media IR: bp

46 Sequenze di Inserzione (IS) Definizione: elementi genici che possiedono soli i geni per la propria traslocazione, bp, codificano per le trasposasi (Tnp), sequenze palindromiche ABCDEFG Struttura Transposase GFEDCBA

47 Trasposoni Definizione: Segmenti di DNA mobili in grado di traslocare nell ambito della stessa cellula. Presenti nei cromosomi batterici, fagici, plasmidici. Frequenza di trasposizione da Possono alterare l organizzazione dei geni. Capacità d inserire un segmento di Dna uguale a se stesso in altro sito. Duplicazione del Tn associata alla trasposizione. I siti d inserimento dei Tn non sono causali. L estremità di ogni Tn presentano sequenze IS. I Tn trasportano geni accessori.

48 Trasposoni Proprietà Movimento a Random Non è capace di autoreplicazione La trasposizione è mediata dalla ricombinazione del sito-specifico Transposase La trasposizione può essere accompagnata dalla duplicazione

49 Elementi trasponibili Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all altro del cromosoma sito donatore sito accettore Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione genomica, per la trasposizione non c è nessuna omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore

50 Trasposoni Elementi che contengono altri geni (resistenza, virulenza) oltre quelli della traslocazione Nomenclatura- Tn10 Struttura IS IS Resistance Gene(s) Toxicity Gene(s) IS IS

51 Trasposoni composti altri geni IR IR IR IR sequenza IS sequenza IS trasposone lunghezza modulo marcatori genetici (bp) terminale Tn Amp Tn Hg Tn Utilizzazione lattosio Tn IS50 Kc Tn IS1 Cm Tn IS10 Tet Tn IS1 Enterotossina stabile al calore

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53 Trasposoni Importanza Veicolano geni che codificano: a) Antibiotico resistenza. b) Insensibilità ai metalli pesanti. c) Produzione di esotossine. d) Legano geni legati al metabolismo degli zuccheri.