Giulio Pisani, Biologo Istituto Superiore di Sanità
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- Gianpiero Vitale
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1 Giulio Pisani, Biologo Istituto Superiore di Sanità Il sottoscritto dichiara di non aver avuto negli ultimi 12 mesi conflitto d interesse in relazione a questa presentazione e che la presentazione non contiene discussione di farmaci in studio o ad uso off-label
2 Sessione Metodologica I Fisiopatologia Clinica e Analisi di Laboratorio Controllo di qualità nelle tecniche di biologia molecolare e immunometriche Giulio Pisani CRIVIB, ISS Roma Personalizzazione della Cura in Epatologia Pisa ottobre 2013
3 Dal Laboratorio al Medico Test utilizzati per la diagnosi di epatite C (HCV) e la gestione del paziente: Saggi sierologici: rilevano anticorpi specifici per HCV (anti-hcv) nel siero o plasma con risultati qualitativi (positivo o negativo) Saggi molecolari: individuano l acido nucleico virale nel siero o plasma con risultati qualitativi (positivo o negativo) o quantitativa (UI / ml). Saggi di genotipizzazione: impiegati in studi epidemiologici e sono clinicamente utilizzati per prevedere la probabilità di risposta e la durata della terapia
4 Dal Laboratorio al Medico Test utilizzati per la diagnosi di epatite B (HBV) e la gestione del paziente: Saggi sierologici: rilevano antigeni/anticorpi specifici nel siero o plasma con risultati qualitativi (positivo o negativo) o quantitativi Antigeni HBsAge HBeAg Anticorpi anti-hbc(igm e IgG), anti-hbe Saggi molecolari: individuano l acido nucleico virale nel siero o plasma con risultati qualitativi (positivo o negativo) o quantitativa (UI / ml). Saggi di genotipizzazione: impiegati in studi epidemiologici
5 Attendibilità del Risultato Analitico Saggio Analitico Sensibilità Specificità Robustezza Accuratezza Precisione CE IVD Laboratorio Ambiente Strumentazione Operatori Conservazione Reagenti Errori Grossolani Casuali Sistematici Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices
6 ERRORE L'errore (E) = R - µ differenza tra il valore sperimentale ottenuto (R) e il valore vero (µ) presente in ogni metodo analitico può essere dovuto a cause diverse Non si deve sempre attribuire al concetto di Errore il significato di sbaglio Nella maggior parte dei casi l Errore è legato alle inevitabili fluttuazioni dei dati ottenuti mediante misurazioni sperimentali. L Errore può essere minimizzato ma non eliminato!!
7 Errore nel Laboratorio Errore Grossolano Imprecisione di carattere accidentale. Non attribuibile ad imprecisione analitica o strumentale, dovuto, in genere, a disattenzione dell'operatore pre-analitico: scambio di campioni, non corretta conservazione post-analitico: errore di calcolo, errore di trascizione Cause: non definite in quanto commesso all insaputa dell operatore (organizzazione del Laboratorio, addestramento operatori )
8 Errore nel Laboratorio Errore Casuale (accidentale) Causati da fattori imponderabili di varia natura Strumentazione Operatore Sono caratterizzati dalle piccole fluttuazioni dei dati analitici, anche quando le misure sono eseguite dallo stesso operatore con la massima cura e in condizioni praticamente identiche. Gli errori casuali non possono mai essere completamente misura si dice "precisa" se è affetta da piccoli errori casuali. eliminati. Una
9 Errore casuale e distribuzione normale Variazioni irregolari e incontrollabili che possono influenzare il risultato analitico. Esempi: reagenti ricostituiti/miscelati non adeguatamente tempi di reazione diversi attrezzatura di laboratorio contaminazione ambientale variazioni di temperatura.. ISSN Rapporti ISTISAN 12/29 Errore Casuale identificabile dalla dispersione attorno al valore medio influenzano la precisione del saggio analitico quantificabile mediante stima della deviazione standard non ha un segno definito (viene riportati col segno )
10 Esempio di Errore Casuale Saggi Qualitativi (es. NAT) Variabilità generata dal campionamento volume 1 ml 32 unità / ml distribuite random (p) = e - 32 x 1 (p) = % positività
11 Esempio di Errore Casuale Saggi Qualitativi (es. NAT) Variabilità generata dal campionamento 32 unità / ml distribuite random volume 0,05 ml (p) = e - ( 32 x 0,05 ) (p) = % positività 4 campioni non contengono unità 16 campioni contengono una o più unità
12 Errore nel Laboratorio Errore sistematico Il risultato alterato in maniera costante, su tutte le determinazioni della serie. Può ripetersi ogni volta che ripetiamo la stessa analisi. Instabilità dei Campioni tra il momento della raccolta e il momento dell analisi Incapacità [del metodo] di determinare tutte le specie rilevanti dell analita Interferenze (es. matrice) scostamento sistematico dovuto alla taratura (es: i Campioni da analizzare ed i campioni per la taratura sono trattati in modo differente o hanno matrice diversa) reattivi o calibratori scaduti o mal conservati difformità nella strumentazione saggio eseguito in maniera incompleta uso non appropriato del kit Causa: si può identificare e tenere sotto controllo
13 Controllo, regolazione e miglioramento di un processo analitico
14 Controllo, regolazione e miglioramento di un processo analitico
15 Controllo, regolazione e miglioramento di un processo analitico
16 Controllo, regolazione e miglioramento di un processo analitico
17 Controllo di qualità Insieme di Procedure Operative attuate nel Laboratorio per garantire che i dati analitici scaturiscano da condizioni operative prestabilite e statisticamente accettabili in termini di precisione (ripetibilità, riproducibilità) e di accuratezza ISO 15189:2012 Medical laboratories --Requirements for quality and competence
18 Controllo di qualità Metodo Analitico Processo di QUALIFICA Processo di Convalida Sensibilità Specificità Robustezza Accuratezza Ripetibilità Precisione Intermedia Linearità e Range, Limite quantificazione Emissione di PO per l esecuzione del Saggio Addestramento Operatori
19 Controllo di qualità Verifiche Interne di Qualità Metodo Analitico Controllo del dato analitico Controlli forniti con il kit Controlli di Qualità interni (CQi) Verifiche Esterne di Qualità (VEQ) Finalità: dimostrare che il metodo analitico è sotto controllo. I risultati che si ottengono soddisfano i requisiti prestabiliti (specifiche)
20 Controllo di qualità DISEGNO del Controllo di Qualità Obiettivo Strategie controllo a priori controllo analitico controllo a posteriori
21 Controllo di Qualità - Controllo a Priori Prima dell'avvio della serie analitica Controllo di Sistema Fornisce una garanzia a priori della qualità analitica, grazie alle informazioni di controllo da misure effettuate a livello dei processi interni alla strumentazione analitica Controllo di Calibrazione Fornisce una garanzia a priori della qualità analitica grazie alle informazioni di controllo ottenute da misure effettuate su materiali di controllo, e/o da misure effettuate a scopo non diagnostico sui materiali dei pazienti il/i materiale/i di controllo appositamente fornito/i con il sistema analitico stesso
22 Controllo di qualità DISEGNO del Controllo di Qualità Obiettivo Strategie controllo a priori controllo analitico controllo a posteriori
23 Controllo di Qualità - Controllo a Posteriori Valutazione a posteriori dell'attendibilità analitica Risultato Positivo conferma analitica secondo algoritmo Risultato Positivo conferma da altre tipologie di saggi Partecipazione a VEQ
24 Controllo di qualità DISEGNO del Controllo di Qualità Obiettivo Strategie controllo a priori controllo analitico controllo a posteriori
25 Controllo di Qualità - Controllo Analitico Inserito nella serie analitica Controllo di Validità Fornisce la garanzia della qualità analitica agendo in modo interattivo Il Controllo di Validità = controllo delle misure effettuate su materiali specifici inseriti nel processo analitico Il Controllo di Validità è utile nelle situazioni in cui esiste un'elevata probabilità di sbagli, legata tipicamente ad una esecuzione delle analisi Il razionale del Controllo di Validità risiede nel fatto di porre al centro dell'attenzione l Operatore, come una fonte importante di sbagli
26 Carta di Controllo risultati non attesi Limite di controllo +3 DS Limite di attenzione + 2 DS Media + 1 DS -1 DS Limite di attenzione -2 DS Limite di controllo -3 DS risultati non attesi Tempo / n Campioni di Controllo
27 Controllo di Qualità - Controllo Analitico Diagnostica Sierologica Saggi qualitativi Saggi quantitativi Diagnostica Molecolare Saggi qualitativi Saggi quantitativi
28 Controllo di Qualità - Controllo Analitico Diagnostica Sierologica Saggi qualitativi Diagnostica Molecolare Saggi qualitativi
29 Controllo di Qualità - Controllo Analitico Diagnostica Sierologica Saggi qualitativi Diagnostica Molecolare Saggi qualitativi Controllo di Qualità materiali di controllo costituiti da: Matrice senza analita Controllo Negativo" Matrice (es. plasma) con concentrazione nota di analita Controllo Positivo"
30 Controllo di Qualità - Controllo Analitico Diagnostica Sierologica Saggi qualitativi CQ negativo CQ positivo CQ positivo 0 1 Indice di Cut-Off
31 Esempio Carta Monitoraggio Saggio HbsAg qualitativo Sensibilità: mui/ml Run Control I Livello: 66 mui/ml (cut-off index > 2) Run Control II Livello: 33 mui/ml (cut-off index >1 <2) Cut-off
32 Esempio Carta Monitoraggio Saggio anti-hcv qualitativo Run Control I Livello: (cut-off index > 2) Run Control II Livello: (cut-off index >1 <2) Cut-off
33 Controllo di Qualità - Controllo Analitico Diagnostica Molecolare Saggi qualitativi % LOD Probabilità % Controllo Positivo 3-5 x cut-off U.I. / ml (log) Sensibilità Saggio Molecolare = Limite di Rilevamento al 95% (95%LOD)
34 Esempio Carta Monitoraggio Saggio_ HCV RNA qualitativo Sensibilità: 11 UI/mL Run Control: 33 UI/mL Run Control Controllo Interno
35 Controllo di Qualità - Controllo Analitico Diagnostica Sierologica Saggi qualitativi Saggi quantitativi Diagnostica Molecolare Saggi qualitativi Saggi quantitativi
36 Controllo di Qualità - Controllo Analitico Diagnostica Sierologica Saggi quantitativi Diagnostica Molecolare Saggi quantitativi
37 Controllo di Qualità - Controllo Analitico Diagnostica Sierologica Saggi quantitativi HBsAg quant Metodo A B Range UI/mL 0, , diluizione 1:500 (a bordo, opzionale) Fino a 1:999 (manuale ) 1:100 o 1:400 (a bordo) Range finale 0, , Controllo positivo Alto da diluire Basso da usare tal quale
38 Controllo di Qualità - Controllo Analitico Diagnostica Molecolare Saggi quantitativi HBV DNA quant Metodo A B C RangeUI/mL 3,3 log -8 log 1,0 log -8,0 log 1,0 log -9,0 log Controllo positivo Alto 3-5 log superiore il limite inferiore Basso 5 volte sopra il limite inferiore
39 Controlli Qualità FORNITO CON IL KIT obbligatori soddisfano requisiti del produttore materiale non infetto molecola di sintesi contenuto (UI/mL, copie/ml) non ben definito
40 Controlli Qualità INDIPENDENTI DAL KIT campioni reali contenuto (UI/mL, copie/ml) ben definito preparazioni di riferimento campioni commerciali campioni positivi prodotti in casa
41 Scelta del Materiale di Prova da impiegare nei Controlli di Qualità
42 Saggi NAT ricerca di acidi nucleici Saggi Immunometrici ricerca di antigene (es. HBsAg) Saggi Immunometrici ricerca di anticorpi (es. anti-hcv)
43 Saggi NAT ricerca di acidi nucleici Campioni di plasma positivi (es. HCV RNA) Standard Internazionale Preparazione di Riferimento Donazione positiva (da caratterizzare) Genotipo virale Concentrazione virale (UI/mL) UI/mL Diluizione in plasma neg UI/mL Materiale di Prova
44 Saggi Immunometrici ricerca antigene (es. HBsAg) Campioni di plasma positivi Standard Internazionale Preparazione di Riferimento Donazione HBsagpositiva Genotipo virale Concentrazione antigene (UI/mL) UI/mL Diluizione in plasma neg UI/mL Materiale di Prova
45 Saggi Immunometrici ricerca anticorpo (anti-hcv) Campioni di plasma positivi Standard Internazionale Preparazione di Riferimento Donazione positiva Genotipo/Sottotipo virale Concentrazione anticorpo Diluizione in plasma neg Materiale di Prova?
46 Valutazioni Esterne di Qualità o Prove Valutative
47 CQI: valuta in tempo reale la stabilità del sistema analitico (errori casuali e sistematici). La valutazione del CQI ci consente di validare la seduta analitica. CQE = VEQ valuta la comparabilità dei risultati di più laboratori (con o senza lo stesso metodo analitico e strumentazione). È retrospettivo, quindi inadatto per la validazione della seduta analitica.
48 Valutazione Esterna di Qualità (VEQ) Procedimento che utilizza i risultati di diversi laboratori che analizzano i medesimi campioni di controllo (Campioni VEQ) per valutare le performance analitiche di un singolo laboratorio o di un saggio analitico
49 VEQ: scopo Obiettivo finale dei Programmi VEQ è il continuo miglioramento dell uniformità di misura tra laboratori diversi, in modo da ottenere, per lo stesso paziente, nelle stesse condizioni, lo stesso referto in tutti i laboratori, sia in termini di risultato (a parità di metodo) ma soprattutto in termini di inquadramento dello stato di salute.
50 Obiettivi della VEQ Confrontare i risultati di un laboratorio con quelli ottenuti laboratori da altri Valutare in maniera periodica, obiettiva e indipendente la qualità dei saggi analitici effettuati di routine Valutare le prestazioni di un laboratorio nell effettuazione di una determinata misurazione e controllarne la validità nel tempo identificare i problemi del laboratorio correlati al saggio impiegato /misurazione (competenza del personale, taratura della strumentazione, idoneità dei materiali di riferimento impiegati, criticità nella PO) MIGLIORAMENTO
51 Risultato Soddisfacente Procedura analitica adottata è valida Procedure analitiche sono sotto controllo I risultati concordano e sono confrontabili a quelli di altri laboratori Rassicurazione dell operatore/analista
52 Risultato NON soddisfacente Errore del Laboratorio Valutazione delle procedure e dell intero processo analitico (manutenzione e calibrazione, regole di controllo di qualità, validazione dei risultati, addestramento operatori) Problema riconducibile al saggio analitico Problema tecnico strumentale Specifiche tecniche del saggio analitico (es. sensibilità, specificità) Idoneità del saggio analitico Programma VEQ non adeguato Materiale distribuito non idoneo
53 Programma VEQ Schema HBsAg qualitativo
54 VEQ HBsAg 2012 Pannello HBsAg mui/ml ~130 ~130 ~130 neg HBsAg 2nd Int. Stand. 00/588 Log S/Co Sensibilità analitica Log mui/ml
55 VEQ HBsAg 2012 Pannello HBsAg mui/ml ~130 ~130 ~130 neg WHO Reference Panel Paul Erlich Institute code 6100/09 Genotipo B2_adw2 (fiala n. 4 of WHO Ref. Panel) ~130 mui/ml ( ) Genotipo C2_adr (fiala n. 6 of WHO Ref. Panel) ~130 mui/ml ( ) Genotipo D1_ayw2 (fiala n. 9 of WHO Ref. Panel) ~130 mui/ml ( )
56 Sigla kit Metodo N lab Sensibilità dichiarata mui/ml Sensibilità calcolata mui/ml A CMIA C MEIA D EIA 4 < E ELISA 2 < G CLIA H ECLIA
57 Conclusione Il CQ dei saggi analitici è un attività fondamentale per assicurare l affidabilità dei referti di laboratorio. In assenza del CQ il referto non è utile o, peggio, può essere dannoso
58 Conclusione Il CQ è uno strumento da utilizzare per verificare la stabilità del saggio analitico (entro limiti predefiniti) Il CQ non migliora le prestazioni analitiche.
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