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1 Corso di Biologia Molecolare AA15/16 Docente: Alessandra Coiana tel Laboratorio di Genetica Molecolare Ospedale Microcitemico riceve gli studenti tutti i giorni previo appuntamento

2 Lezioni Lun-Mer-Ven ore 9:00-11:00 Laboratorio comunicazione date durante il corso Modalità Esame: Esame finale: orale Materiale didattico: people.unica.it/alessandracoiana/lezioni 2016 PW BIOLMOL14 el II anno): Testi consigliati: - J.D.Watson et al. Biologia Molecolare del gene VII edzanichelli - F.Amaldi et al. Biologia Molecolare II ed Casa Editrice Ambrosiana - T.A. Brown Genomi 3 ed Edises

3 Cronologia dei risultati di biochimica, genetica e biologia molecolare sino agli anni '50

4 Tabella 1.1 Cronologia dei risultati della Genetica, della Biochimica e della Biologia Molecolare sino alla fine degli anni cinquanta. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

5 Tabella 1.1 Cronologia dei risultati della Genetica, della Biochimica e della Biologia Molecolare sino alla fine degli anni cinquanta.

6 Tabella 1.1 Cronologia dei risultati della Genetica, della Biochimica e della Biologia Molecolare sino alla fine degli anni cinquanta.

7 Tabella 1.1 Cronologia dei risultati della Genetica, della Biochimica e della Biologia Molecolare sino alla fine degli anni cinquanta. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

8 BIOLOGIA MOLECOLARE

9 BIOINFORMATICA GENETICA MOLECOLARE BIOCHIMICA FUNZIONEdel GENE BIOLOGIA CELLULARE FISIOLOGIA BIOCHIMICA STRUTTURALE

10 Argomenti di biologia molecolare

11 Metodologie di Biologia Molecolare

12 Acidi nucleici: DNA (acido desossiribonucleico) RNA (acido ribonucleico)

13 Struttura primaria degli acidi nucleici polinucleotidi (polimeri lineari costituiti da unità ripetitive: i nucleotidi)

14 Componenti dei nucleotidi - Base azotata (purinica o pirimidinaca) -Gruppo fosfato -Pentoso (Ribosio/ Deossiribosio)

15 Struttura dei nucleotidi:pentoso RNA DNA

16 Basi Azotate Puriniche Anelli eterociclici planari a doppio anello Adenina: 6 ammino purina Guanina: 2 ammino-6 ossi purina

17 Basi Azotate Pirimidiniche Anelli eterociclici planari a singolo anello Timina: 2,4 diossi-5 metil pirimidina (oppure 5 metil uracile) Citosina: 2 ossi-4 ammino pirimidina Uracile: 2, 4 diossi pirimidina

18 Le basi azotate sono unite al C1 del pentoso con un legame glicosidico (con N1 nelle pirimidine e N9 nelle purine)

19 Nucleoside e Nucleotide

20 Figura 2.4 Nomenclatura dei gruppi fosfato in un nucleoside trifosfato. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

21 Legame fosfodiesterico tra i nucleotidi

22 Il gruppo funzionale PO4 conferisce agli ac. nucleici le proprietà di un acido

23 Per convenzione le sequenze degli acidi nucleici si indicano in direzione 5' 3' 5'ATG3' 5'UGC3'

24 Struttura secondaria degli acidi nucleici: RNA catena polinucleotidica a singolo filamento (ss=single strand) DNA due catene polinucleotidiche due filamenti avvolte su se stesse (ds=double strand)

25 Appaiamento delle basi azotate (secondo Watson e Crick) A-T (2 legami idrogeno) C-G (3 legami idrogeno)

26 La formazione delle interazioni complementari tra le coppie AT e GC conferiscono alla molecola del DNA un carattere autocodificante

27 Ciascuna base azotata può assumere due conformazioni tautomeriche, in equilibrio tra loro La capacità di formare un tautomero alternativo può essere causa di errori durante la sintesi del DNA Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

28 Struttura secondaria del DNA Due catene polinucleotidiche allineate secondo un orientamento opposto (antiparallelo) 5'ACTG3' 3'TGAC5'.

29 L'orientamento antiparallelo delle due semieliche è una conseguenza stereochimica del modo in cui sono appaiante le basi.

30 Stabilità termodinamica della molecola di DNA 1) legami idrogeno tra le basi 2) attrazioni di van der Waals tra le basi impilate

31 DNA forma B

32 Il solco maggiore dellla doppia elica del DNA fornisce maggiori informazioni di tipo chimico A:accettori di legami idrogeno D:donatori di legami idrogeno *gruppi metilici *idrogeno non polare

33 Il riconoscimento di specifiche sequenze di DNA da parte di proteine è dovuto alla interazione tra i gruppi chimici esposti dal solco maggiore del DNA ed aminoacidi presenti in particolari dominii funzionali

34 Figura 2.17 Le proteine interagiscono generalmente con il solco maggiore del DNA. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

35 Conformazioni del DNA Forma B: in soluzione con alto grado di umidità (95%)bassa salinità. Più simile alla struttura fisiologica Forma A. in soluzione a basso grado di umidità (75%) alta salinità. Complessi DNA.Proteina. RNAds Forma Z: sequenza con purine-pirimidine alternate.alto MgCl2alta umidità bassa salinità

36 Parametri strutturali della doppia elica del DNA

37 DNA Z Conformazione ad elica sinistrorsa che si instaura in sequenze con alternanza purina/pirimidina (CGn) in cui le basi assumono conformazioni alternate syn/anti. Figura 2.21 Le due posizioni syn e anti della deossiguanosina nelle forme A e Z del DNA. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

38 Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

39 Figura 2.22 Nella stessa molecola di DNA possono coesistere tratti di DNA B e di DNA Z. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

40 DNA a tripla elica DNA duplex di coppie di basi con un filamento composto di sole pirimidine e l'altro di sole purine. Appaiamenti di Hoogsteen Figura 2.23 DNA a tripla elica. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana Non è stato dimostrato un ruolo naturale per questa struttura

41 e, Plevani Il quartetto di G :intramolecolare o intermolecolare appaiamenti di Hoogsteen 4 tratti di DNA o RNA che contengano ciascuno 3 o più G consecutive si affiancano a formare una struttura quadruplex (a quattro filamenti) tenuti insieme ma appaiamenti di Hoogsteen Es: telomeri cromosomi eucariotici Figura 2.24B Il quartetto di G. Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

42 Ripetizioni invertite di una stessa sequenza con orientamento opposto sequenza palindromica sequenza ripetuta e invertita Figura 2.25 Sequenze ripetute e invertite e palindromi. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

43 Pesole, Plevani Struttura Cruciforme Un tratto di DNAds che contiene una sequenza ripetuta e invertita può assumere una struttura cruciforme con appaiamenti intramolecolari Figura 2.28 Visualizzazione di una struttura cruciforme. Figura 2.26 Struttura cruciforme. Biologia molecolare - 2a edizione Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani 2014 CEA - Casa Editrice Ambrosiana Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

44 Struttura a forcina (hairpin) Figura 2.27 Struttura a forcina. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana Tratto di RNA (o DNAss) che contiene una sequenza ripetuta invertita può assumere una struttura a forcina costituita da uno stelo a doppia elica e una ansa a singolo filamento

45 DNA intrinsecamente curvo Es: AT-AT repeats ogni 10bp (1 giro d'elica) Figura 2.29 DNA intrinsecamente curvo (o piegato). Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione CEA - Casa Editrice Ambrosiana

46 La denaturazione del DNA

47 Le due semieliche del DNA possono denaturarsi...in vivo duplicazione

48 Le due semieliche del DNA possono denaturarsi e riassociarsi...in vivo trascrizione

49 Le due catene del DNA possono denaturarsi e rinaturarsi...in vitro - DNA doppia elica bassa Assorbanza 260 nm - DNA singola elica aumento Assorbanza 260 nm - Nucleotidi liberi massima Assorbanza 260 nm

50 Temperatura di melting (TM) Temperatura a cui è denaturato il 50% delle molecole di DNA presenti nel campione Aumenta Quanto più è elevata la % di basi G-C nella sequenza Diminuisce In presenza di reagenti che possono formare legami H con i nucleotidi (urea, formammide) In presenza di reagenti che aumentano la solubilità delle basi (metanolo) o distruggono il rivestimento di H2O indebolendo le interazioni idrofobiche

51 : Denaturazione del DNA In condizioni fisiologiche gli ioni Na+ formano nuvole cariche intorno ai fosfati neutralizzandoli Per diminuita concentrazione di sali i due filamenti del DNA subiscono una repulsione elettrostatica dovuta ai fosfati con carica negativa.

52 Denaturazione alcalina del DNA A ph elevato la carica di diversi gruppi cambia. Le basi non formano legami H A ph 11,9 tutti i legami idrogeno sono eliminati (con NaOH)

53 Rinaturazione del DNA: condizioni necessarie - Concentrazione salina abbastanza elevata da evitare la repulsione elettrostatica - Temperatura stringente:sufficientemente elevata da evitare legami idrogeno tra singoli filamenti ma non troppo per favorire il riappaiamento

54 Il DNA non si riappaia nei due filamenti originali, ma casualmente con altri filamenti omologhi IBRIDAZIONE

55

56 Due campioni di DNA da confrontare sono denaturati completamente mediante riscaldamento Quando le due soluzioni sono mescolate e la miscela viene raffreddata lentamente, le catene di ogni campione si riassociano con le loro catene complementari e riacquistano la struttura a doppia elica Se i due diversi DNA hanno un omologia di sequenza significativa, essi tenderanno a formare duplex o ibridi l uno con l altro. Quanto più alto sarà il grado di omologia, tanto maggiore sarà il numero di ibridi che si potranno formare

57 Ibridazione del DNA su filtro

58 Ibridazione e sonde molecolari

59 Reazione di ibridazione in situ su cromosomi in cellule in metafase (FISH)

60 Reazioni di bridazione degli acidi nucleici : DNA sonde RNAsonde Sonde oligonucleotidiche -Southern /Northern blot:sonde marcate con isotopi radioattivi -Ibridazione in situ di cromosomi in metafase (FISH) sonde marcate con molecole fluorescenti -Ibridazione inversa su filtro: sonde coniugate con biotina-avidina (rivelazione enzimatico-colorimetrica)

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