Scopo finale: riduzione della carica microbica, o numero di microrganismi vitali presenti.

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1 Sterilizzazione: inibizione completa della crescita microbica (battericidi: agenti che distruggono o uccidono i batteri batteriostatici: agenti che inibiscono la crescita dei batteri) I metodi volti alla inibizione di una crescita microbica rapida comprendono la decontaminazione e la disinfezione: Decontaminazione: trattamento di oggetti e superfici prevenendo la crescita microbica. Disinfezione: colpisce direttamente i patogeni, sebbene può non eliminare tutti i microrganismi (disinfettanti: agenti chimici e fisici, esempio ipoclorito di sodiocandeggina). Scopo finale: riduzione della carica microbica, o numero di microrganismi vitali presenti. Il controllo microbico in vivo è molto più difficile, avviene tramite agenti chemioterapici battericidi o batteriostatici, con selettività di azione contro i batteri

2 METODI FISICI PER IL CONTROLLO DELLA CRESCITA MICROBICA I metodi fisici usati per la decontaminazione, la disinfezione e la sterilizzazione sono: 1. Il calore 2. Le radiazioni 3. La filtrazione

3 Sterilizzazione mediante calore A temperature molto alte tutte le macromolecole si denaturano, cioè perdono la loro struttura e funzionalità.

4 Effetto della temperatura sulla vitalità di un batterio Il tempo necessario per una sterilizzazione sarà più lungo se si opera a bassa temperatura piuttosto che a temperatura più elevata. E quindi necessario determinare il tempo e la temperatura di trattamento per ottenere una sterilizzazione efficace. Anche il vettore usato per la diffusione del calore è importante: il calore umido ha un potere di penetrazione maggiore del calore secco. Il parametro più usato per caratterizzare la sterilizzazione mediante calore è il tempo di riduzione decimale o D, cioè il tempo necessario per ridurre di dieci volte, a una data temperatura, la densità della popolazione

5 Le endospore e la sterilizzazione mediante calore Le endospore batteriche e le cellule vegetative di uno stesso organismo sono molto diverse per quanto riguarda la resistenza al calore: Per la riduzione decimale delle endospore: 121 C per 4-5 minuti Per la riduzione decimale delle cellule vegetative: 65 C per 0,1-0,5 minuti Uno dei fattori più importanti nel determinare la resistenza al calore delle endospore è la quantità e lo stato dell acqua (il suo contenuto è ridotto al 10-30%), l accumulo di dipicolinato di calcio e di piccole proteine delle spore acido-solubili (SASP). Anche la natura del mezzo che viene sottoposto a riscaldamento influenza l efficienza con cui vengono eliminate le endospore e le cellule vegetative. La morte microbica è infatti più rapida a ph acido (per questo motivo i cibi acidi come i pomodori, la frutta e i sottaceti sono molto più facili da sterilizzare di quelli a ph neutro, come il mais e i fagioli). Elevate concentrazioni di zuccheri, proteine e grassi impediscono la penetrazione del calore e di solito aumentano la resistenza dei microrganismi ad esso.

6 L autoclave è una camera a chiusura ermetica che permette l immissione di vapore saturo sotto pressione. L autoclave per la sterilizzazione La normale procedura prevede un riscaldamento a una pressione di 1,1 kg/cm 2, che permette di raggiungere una temperatura di 121 C, per minuti. (a) Flusso di vapore all interno dell autoclave (b) Un tipico ciclo di sterilizzazione in autoclave per oggetti di dimensioni piuttosto grandi (c) Una moderna autoclave

7 PASTORIZZAZIONE Processo che utilizza una temperatura controllata in modo molto preciso per ridurre la popolazione microbica nel latte e negli alimenti particolarmente sensibili al calore. Prende il nome da Louis Pasteur. Non tutti i microrganismi vengono uccisi. La pastorizzazione oltre a prevenire la diffusione di microrganismi patogeni, ritarda anche la crescita di organismi responsabili del deterioramento dei cibi, consentendo così una migliore conservazione dei liquidi deperibili. La pastorizzazione del latte viene ottenuta facendo fluire il latte attraverso uno scambiatore di calore. Il latte percorre un circuito di tubo a contatto con una sorgente di calore; il controllo accurato della velocità, delle dimensioni del flusso e della temperatura della sorgente di calore permette di innalzare la temperatura del latte fino a 75 C e di mantenerla per 15 secondi. Il latte è poi rapidamente raffreddato (processo chiamato pastorizzazione istantanea). La pastorizzazione istantanea altera meno le caratteristiche organolettiche del latte. Il latte può essere anche scaldato a C in grandi contenitori per 30 minuti (processo chiamato pastorizzazione di massa). Tale metodo è però meno soddisfacente in quanto il latte si scalda e si raffredda lentamente.

8 Sterilizzazione mediante radiazioni Le radiazioni elettromagnetiche quali le microonde, le radiazioni ultraviolette (UV), i raggi X, i raggi gamma e gli elettroni. Gli effetti delle microonde sono dovuti anche ad una azione termica. Le radiazioni UV (lunghezza d onda compresa tra nm) inducono modificazioni e rotture nel DNA. Esempio, le cappe biologiche. Le radiazioni UV non sono in grado di penetrare le superfici solide opache. Radiazioni ionizzanti (raggi X e raggi gamma) producono elettroni (e-) e radicali ossidrilici (OH. ) e radicali idruro (H. ), molecole capaci di alterare e distruggere biopolimeri, come il DNA e le proteine

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11 Sterilizzazione mediante filtrazione Per sterilizzare soluzioni contenenti sostanze termolabili. Un filtro è un dispositivo con pori troppo piccoli per il passaggio di microrganismi, ma abbastanza larghi per permettere il passaggio di liquidi e gas. 1. Filtri a spessore Costituiti da strati fibrosi di carta, amianto o lana di vetro, in cui le fibre sono disposte in modo casuale. L impiego più comune di questi filtri è la sterilizzazione per filtrazione dell aria in processi industriali. Utilizzati in molti sistemi di biosicurezza: nelle cappe biologiche dove vi è un flusso di aria in entrata ed in uscita, questa passa attraverso un filtro che trattiene con alta efficienza il particolato presente nell aria, i cosiddetti filtri HEPA. 2. Membrane filtranti Usati per la sterilizzazione di liquidi nei laboratori microbiologici, costituite da dischetti molto resistenti di acetato di cellulosa, nitrato di cellulosa o polisulfone e costituite in modo tale da creare nello spessore del filtro molti pori di piccolissime dimensioni. Il loro funzionamento è simile a quello di un setaccio.

12 Apparati che utilizzano membrane filtranti (a) Apparato con membrane filtranti riciclabili (b) Apparati con membrane filtranti monouso: siringa per piccoli volumi (sinistra); sistema filtrante per grandi volumi (destra)

13 METODI CHIMICI PER IL CONTROLLO DELLA CRESCITA MICROBICA Gli agenti antimicrobici. Si suddividono in: - agenti battericidi, fungicidi e virocidi, quelli che uccidono i microrganismi - agenti batteriostatici, fungistatici e virostatici, quelli che inibiscono soltanto la crescita dei microrganismi. Gli agenti antimicrobici sono molto diversi per quanto riguarda la tossicità selettiva: alcuni agiscono in maniera poco selettiva, altri sono più selettivi e sono più tossici per i microrganismi che per i tessuti animali.

14 Effetti degli agenti antimicrobici sulla crescita Quando un agente antimicrobico è aggiunto ad una coltura in crescita esponenziale si osservano 3 effetti: (a) batteriostatici, inibiscono la crescita microbica; in genere sono composti che inibiscono la sintesi proteica legandosi ai ribosomi in modo reversibile (b) battericidi, si legano in modo irreversibile ai loro bersagli, provocando la morte senza lisi cellulare (c) batteriolitici, determinano la morte della cellula provocandone la lisi. Comprendono antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare, come le penicilline, e sostanze chimiche che distruggono la membrana citoplasmatica, come i detergenti

15 Misura dell attività antimicrobica Si misura determinando la MIC (Minimum Inhibitory Concentration, Minima concentrazione inibente), cioè la concentrazione più bassa di antibiotico che inibisce completamente la crescita di un dato organismo, e si determina con la tecnica delle diluizioni scalari.

16 Misura dell attività antimicrobica Un altra procedura comunemente usata per studiare l attività antimicrobica di un composto è il metodo della diffusione su agar.

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18 Agenti chimici antimicrobici utilizzati per il controllo dei microrganismi patogeni per l uomo Sterilizzanti, distruggono tutte le forme di vita microbica, incluse le endospore (negli ospedali e nei laboratori, es. ossido di etilene, formaldeide, perossido di idrogeno). Disinfettanti, provocano la morte dei microrganismi, ma non necessariamente le endospore, e sono usati per oggetti inanimati. (es. negli ospedali etanolo e i detergenti). Antisettici, uccidono o inibiscono la crescita dei microrganismi e sono sufficientemente poco tossici da poter essere utilizzati sui tessuti viventi (usati per disinfettare le mani e le ferite superficiali).

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20 Agenti antimicrobici utilizzati in vivo Agenti chemioterapici antimicrobici, hanno una tossicità selettiva, cioè hanno la capacità di inibire i batteri o altri patogeni senza produrre danni collaterali nell ospite. Possono essere classificati sulla base di: 1. della loro struttura 2. del loro meccanismo d azione 3. dello spettro di attività antimicrobica Ricadono in tre grandi categorie: 1. i composti sintetici 2. gli antibiotici, composti naturali 3. gli antibiotici semisintetici

21 Agenti chemioterapici antibatterici classificati sulla base della struttura chimica

22 Agenti chemioterapici antimicrobici classificati sulla base del loro meccanismo d azione

23 Agenti chemioterapici antimicrobici classificati in base al loro spettro d azione

24 Produzione ed uso mondiale annuo di antibiotici

25 Resistenza ai farmaci antimicrobici Coinvolge generalmente geni di resistenza, trasferiti attraverso scambi genetici tra i microrganismi. Tali geni sono cromosomiali oppure plasmidici (i plasmidi di resistenza o fattori R) L ampio uso di antibiotici in campo medico, veterinario e agricolo (l uso inappropriato ed esagerato) ha portato all insorgenza dell antibiotico-resistenza (fenomeno della pressione sellettiva antibiotica).

26 Comparsa della resistenza agli antibiotici in alcuni patogeni umani