CONTROLLO CONDIZIONI IGIENICHE LABORATORIO

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1 CONTROLLO CONDIZIONI IGIENICHE LABORATORIO Filiberto Cermaglia 3^A B.S. ITIS Parma A.S. 2015/2016

2 INTRODUZIONE Questo test ha lo scopo di verificare le condizioni igieniche delle superfici del laboratorio e, successivamente, attuare procedure per determinare quale disinfettante sia più adatto per pulire tali superfici (metodo dell antisetticogramma). Inoltre, per quanto riguarda le cappe a flusso laminare, effettueremo un test sul corretto funzionamento delle lampade UV contenute al loro interno. Sappiamo infatti che queste lampade, dopo numerose ore di funzionamento, perdono il loro potere battericida e devono quindi essere sostituite. Per comodità suddivideremo questa esperienza in 3 parti: 1) controllo condizioni igieniche delle superfici; 2) antisetticogramma con successiva pulizia delle superfici; 3) controllo azione batterica degli UV a carico del nostro ceppo. 1. CONTROLLO CONDIZIONI IGIENICHE DEL LABORATORIO Il controllo delle condizioni igieniche sulle superfici del laboratorio può essere svolto in due modi distinti: attraverso l uso di tamponi sterili, da strofinare in zone delimitate della superficie da controllare di area 100mm 2 ; attraverso l uso di piastre da contatto, da strofinare direttamente sulla superficie da controllare. Effettueremo controlli sulle cappe n 3 e n 4. MATERIALI E STRUMENTI: tampone sterile; spatola sterile; spatola a L; specillo; pipetta graduata sterile con propipetta; matraccio con tappo; acqua distillata; soluzione fisiologica; provette pulite con tappi; piastre Petri; terreno PCA, generico con rapp. 21,5 g/l; vortex; autoclave; piastra elettrica; cappa a flusso laminare; incubatrice a t = C. Prepariamo il terreno PCA. Dovendo fare 9 piastre (1 CT + 4 piastre cappa n piastre cappa n 4) prepariamo 200ml di terreno (quindi 200ml di acqua + 4,30g di terreno in polvere), che inseriamo poi in autoclave a sterilizzare. Intanto inseriamo in due provette 10ml di soluzione fisiologica utilizzando una pipetta con propipetta. Applichiamo un tappo ad entrambe e inseriamole in autoclave a sterilizzare. Una volta sterilizzate estraiamole dall autoclave, raffreddiamole sotto acqua corrente e procediamo. Strofiniamo il tampone sterile sulla superficie da esaminare, di cui abbiamo delimitato una zona di 10x10mm 2 e, sotto cappa accesa, lo inseriamo nella provetta contenente la soluzione fisiologica. Passiamo la provetta sul vortex. Ripetiamo questi passaggi per la seconda cappa. Vuotiamo in 5 piastre il terreno e facciamole raffreddare. Una di queste piastre la teniamo come CT e quindi la chiudiamo e la inseriamo in incubatrice a C (temperatura ambiente).

3 Prendiamo altre 4 piastre già seminate e ne seminiamo due per cappa in superficie con 0,1ml della soluzione fisiologica aiutandoci sempre con una pipetta graduata e propipetta. Stemperiamo con la spatola a L. Chiudiamo le piastre e inseriamole in incubatrice. Nelle restanti 4 piastre (sempre due per ogni cappa) dobbiamo seminare in massa (o in doppio): depositiamo sul loro fondo la soluzione fisiologica, stemperiamo e inseriamo il terreno sopra la soluzione. Chiudiamo le piastre ed inseriamole ad incubare. Tutte le 9 piastre rimarranno ora ad incubare alla temperatura ambiente (22-25 C) per 72 ore. 2. ANTISETTICOGRAMMA A CARICO DEL CEPPO BATTERICO N.B.: i procedimenti seguenti sono riferiti alla preparazione dell antisetticogramma di una sola cappa. I passaggi sono comunque identici a quelli da svolgere per la seconda cappa o per un qualsiasi bancone. Attraverso l antisetticogramma possiamo controllare quale disinfettante, tra 5 diversi che abbiamo provato, ha una migliore azione disinfettante. I disinfettanti che andremo ad utilizzare sono: 1. H 2O 2 (acqua ossigenata perossido di idrogeno) 35% 12Vol. O 2; 2. I 2 (iodio); 3. NaClO (candeggina); 4. CH 3CH 2OH (etanolo); 5. Amuchina. Sarà necessario utilizzare anche una piastra Petri di dimensioni maggiori rispetto a quelle utilizzate solitamente, questa infatti ha un diametro di 15cm. MATERIALI E STRUMENTI: tampone sterile o spatola a L; ansa sterile e specillo; pinzetta in metallo sterile; pipetta graduata con propipetta; matraccio con tappo; acqua distillata; soluzione fisiologica; provette pulite con tappi; piastre Petri seminate al punto 1.; piastra Petri grande (Ø 15cm); terreno isosensitest agar, con rapp. 31,5 g/l (ph 7,4); dischetti sottili bianchi; soluzioni disinfettanti; vortex; autoclave; portaprovette; piastra elettrica; cappa a flusso laminare; incubatrice a t = C; bagnomaria riscaldato. Prepariamo il terreno e la fisiologica. Misuriamo con un cilindro graduato 50ml di acqua distillata e li inseriamo in un matraccio insieme a 1,57g di terreno che, nel frattempo, abbiamo pesato alla bilancia di precisione. Chiudiamo il matraccio con il suo tappo e lo inseriamo in autoclave a sterilizzare. Prendiamo ora una provetta in vetro pulita in cui versiamo 10ml di fisiologica, chiudiamola con un tappo e facciamo sterilizzare in autoclave.

4 Intanto che terreno e fisiologica sterilizzano, andiamo sotto cappa e segnamo sul retro della piastra che utilizzeremo 6 punti: 5 lungo il perimetro a circa 1-1,5cm di distanza dal bordo e il 6, che utilizzeremo come CT (anche se in questo caso è un CF, controllo fertilità), al centro. A sterilizzazione avvenuta, inseriamo il matraccio col terreno in bagnomaria riscaldato in modo da non far solidificare il contenuto. Raffreddiamo la provetta sotto acqua corrente e, quando questa sarà a temperatura ambiente, la sistemiamo nel suo alloggio sotto cappa a flusso laminare e togliamo il tappo. Con un ansa sterile preleviamo un po di colonia batterica cresciuta sulle piastre coltivate nel punto 1. e la inseriamo nella fisiologica. La sospensione del ceppo deve ora diventare torbida, per cui mescoliamo con l ansa stessa e poi dopo aver richiuso la provetta col tappo passiamola sul vortex. Riprendiamo il matraccio con il terreno e, sotto cappa, versiamolo tutto all interno della piastra precedentemente segnata e aspettiamo che si raffreddi e solidifichi completamente prima di procedere. Procediamo con la semina: sempre sotto cappa preleviamo 0,5ml della soluzione contenuta nella provetta con pipetta graduata sterile da 2ml (S = 0,1ml) e propipetta e sgoccioliamoli al centro della piastra ( semina in superficie). Stemperiamo uniformemente dentro tutta la piastra con una spatola a L o un tampone sterile e attendiamo. Adesso è il momento di effettuare la prova dell antisetticogramma. Sotto cappa, con una pinzetta sterile in metallo, preleviamo un dischetto alla volta, lo bagnamo leggermente con ciascuna soluzione (quelle elencate prima) e lo adagiamo sul punto segnato sulla piastra corrispondente (es. punto 1 H 2O 2, punto 2 I 2 etc.), avendo particolare cura di non contaminare la piastra con le pinzette sporche e di lasciare il punto 6 vuoto (cioè senza alcun dischetto appoggiato su di esso). Questo metodo di diffusione è detto metodo Kirby Bauer. Un consiglio personale: dato che l I 2 sporca e impregna molto, consiglio di lasciarlo come ultimo dischetto da adagiare sulla piastra. Inseriamo ora la piastra chiusa ad incubare a C per 72 ore. Passati i 3 giorni, osserviamo i risultati ottenuti: il punto n 3 (quello con l ammoniaca) presenta maggiore potere disinfettante. Puliamo perciò la cappa in questione con NaClO. In ogni caso anche l altra cappa ha presentato uguali risultati. 3. AZIONE BATTERICIDA DEGLI UV (CAPPA 3) A CARICO DEL NOSTRO CEPPO BATTERICO Attraverso il test dell azione batterica degli UV possiamo testare il corretto funzionamento delle lampade UV presenti all interno delle cappe a flusso laminare che utilizziamo quotidianamente nei laboratori. Tali lampade hanno una potenza α = nm. Per svolgere questo test sarà necessario preparare, tra le altre cose, un CF, cioè un controllo fertilità, per verificare la crescita indisturbata della nostra colonia scelta. MATERIALI E STRUMENTI: Tampone sterile o spatola a L; Ansa sterile e specillo; Pipetta graduata da 2ml con propipetta; Matraccio con tappo; Provetta pulita con tappo; Acqua distillata; Soluzione fisiologica; Piastre Petri seminate al punto 1.; N 5 piastre Petri pulite; Terreno PCA o TSA; Vortex; Autoclave;

5 Portaprovette; Piastra elettrica; Cappa a flusso laminare; Incubatrice a t = C; Bagnomaria riscaldato. Cominciamo preparando il terreno: come sempre pesiamo sulla bilancia e inseriamo in un matraccio insieme a 100ml di acqua distillata, facciamo sciogliere completamente e sterilizziamo in autoclave. Ora vuotiamo in una provetta di vetro pulita 5ml di fisiologica, la chiudiamo con un tappo e la facciamo sterilizzare in autoclave. A sterilizzazione avvenuta, inseriamo il matraccio col terreno in bagnomaria riscaldato in modo da non far solidificare il contenuto durante l attesa che vengano compiute le ulteriori procedure. Raffreddiamo la provetta sotto acqua corrente e, quando questa sarà a temperatura ambiente, la sistemiamo nel suo alloggio sotto cappa a flusso laminare e togliamo il tappo. Con un ansa sterile preleviamo un po di colonia batterica cresciuta sulle piastre coltivate nel punto 1. e la inseriamo nella fisiologica. La sospensione del ceppo deve ora diventare torbida, per cui mescoliamo con l ansa stessa e poi dopo aver richiuso la provetta col tappo la passiamo sul vortex. Riprendiamo il matraccio con il terreno e, sempre sotto cappa, vuotiamo il suo contenuto all interno delle 5 piastre Petri preparate e aspettiamo che si raffreddi e solidifichi completamente prima di procedere. Una piastra preparata sarà il nostro CT: chiudiamola, segnamola con un pennarello ed inseriamola in incubatrice (sempre a C per 72 ore). Procediamo con la semina delle restanti 4 piastre: sempre sotto cappa preleviamo 0,1ml per volta della soluzione contenuta nella provetta con pipetta graduata sterile da 2ml (S = 0,1ml) e propipetta e sgoccioliamoli al centro di ciascuna piastra. Stemperiamo uniformemente dentro tutta la piastra con una spatola a L o un tampone sterile e attendiamo ( semina in superficie). Una di queste piastre sarà il nostro CF, ovvero il controllo di fertilità, che dovrebbe avere una crescita indisturbata per confermare la nostra tesi. La chiudiamo, la segnamo con un pennarello e la inseriamo in incubatrice (22-25 C x 72h). Le restanti 3 piastre preparate dovranno essere lasciate aperte sotto cappa con lampada UV accesa rispettivamente per 10, 20 e 30 minuti, dopodiché andranno richiuse e messe ad incubare insieme alle altre. In questo modo controlliamo e confermiamo il corretto funzionamento o meno delle lampade UV di ogni cappa. Dopo 72 ore dall incubazione dell ultima piastra possiamo affermare che: Il CT è rimasto pulito, non sono presenti crescite di colonie batteriche o muffe; Il CF ha avuto una crescita regolare su tutta la sua superficie, sono presenti molte colonie di batteri del nostro ceppo ma nessuna muffa; La piastra rimasta sotto i raggi UV per 10 presenta crescite di muffe* e una piccola quantità di colonie batteriche del nostro ceppo; La piastra rimasta sotto i raggi UV per 20 presenta crescite di muffe* e una davvero minima (praticamente assente) quantità di colonie batteriche del nostro ceppo; La piastra rimasta sotto i raggi UV per 30 presenta crescite di muffe* e un assoluta assenza di colonie batteriche del nostro ceppo. * E comunque importante ricordare che la crescita delle muffe all interno delle piastre rimaste sotto l effetto degli UV sia normale in quanto, in assenza di flusso d aria sul bordo della cappa, le spore penetrano nella cappa stessa e si depositano sul terreno.

6 CONCLUSIONI Possiamo concludere l esperienza affermando di aver controllato le condizioni igieniche delle superfici del laboratorio (in particolare le superfici della cappa n 3 e della cappa n 4, risultate comunque abbastanza pulite); di aver stabilito quale disinfettante sia il migliore per la pulizia e disinfezione delle stesse superfici e di aver testato il corretto funzionamento della lampada UV della cappa n 3. RELAZIONE FORMATO DIGITALE A COLORI: