LEGIONELLA Valorizzazione ed implementazione della multidisciplinarietà nell ambito della Legionellosi Dipartimento di Prevenzione ULSS 20, Verona

Transcript

1 LEGIONELLA Valorizzazione ed implementazione della multidisciplinarietà nell ambito della Legionellosi Dipartimento di Prevenzione ULSS 20, Verona Problematiche analitiche correlate al prelievo, al trasporto, alla consegna e all analisi dei campioni.

2 Problematiche analitiche correlate al prelievo, al trasporto, alla consegna e all analisi dei campioni. NORMATIVA DI RIFERIMENTO Circolare 400.2/9/5708 del 29/12/1993: linee-guida per la prevenzione e il controllo della legionellosi Documento Stato Regioni 04/04/2000: Gazzetta Ufficiale n.103 del 05/05/2000 Provvedimento 15 gennaio 2005: «Linee guida recanti indicazioni ai laboratori con attività di diagnosi microbiologica e controllo ambientale della legionellosi» Documento Stato Regioni: «Linee guida per la prevenzione e il controllo della Legionellosi» - DGRV n del 28 settembre 2015, BUR 98 16/10/2015 dr.ssa M.Cristina Mosconi -

3 La normativa riporta indicazioni per gli operatori che operano nella sanità pubblica - sorveglianza sanitaria - matrici di campionamento - modalità di campionamento Indicazione ai microbiologi laboratoristi - indicazioni analitiche Provvedimento 15 gennaio 2005 ha definito i laboratori con attività diagnostica e di controllo ambientale a tre livelli gerarchici: - laboratorio di base - laboratorio di riferimento regionale - laboratorio di riferimento nazionale dr.ssa M.Cristina Mosconi -

4 Documento Stato Regioni: «Linee guida per la prevenzione e il controllo della Legionellosi» - DGRV n del 28 settembre 2015, BUR 98 16/10/2015 Allegato 3 Campionamento di matrici ambientali per la ricerca di Legionella Allegato 4 Ricerca e quantificazione di Legionella in campioni ambientali con tecniche colturali e PCR. - La tecnica colturale: validata applicabile per i controlli ufficiali - La tecniche PCR: non validata non applicabile per i controlli ufficiali dr.ssa M.Cristina Mosconi -

5 Legionella pneumophila Vive comunemente in ambienti acquatici naturali - laghi - corsi d acqua - acque termali Può contaminare ambienti acquatici artificiali - reti idriche cittadine - impianti idrici degli edifici (docce!!!!!) - piscine - fontane - apparecchiature sanitarie (aerosol) Il genere Legionella comprende 61 specie diverse (sottospecie incluse) e sono stati riconosciuti circa 70 sierogruppi. Legionella pneumophila è la più importante per la patologia umana clinico, il sierogruppo 1 è il più importante. Non vengono comunque trascurati i sierogruppi dr.ssa M.Cristina Mosconi -

6 Decreto Legislativo 81/2008 Testo unico in materia di salute e sicurezza Allegato XLVI - Legionella pneumophila e le altre specie patogene per l uomo (Legionella spp): rientrano tra gli agenti biologici del gruppo 2. «agente che può causare malattia in soggetti umani e costituire rischio per i lavoratori; è poco probabile che si propaghi nella comunità e nell ambiente; sono di norma disponibili efficaci misure profilattiche e terapeutiche preventive e il rischio di diffusione è limitato» dr.ssa M.Cristina Mosconi -

7 MANIPOLAZIONE MATERIALE POTENZIALMENTE INFETTO - MISURE DI CONTENIMENTO accettazione - campioni sigillati e inseriti in involucri protettivi -i recipienti di vetro contenenti campioni vanno maneggiati e trasportati con cura laboratori -manipolazione di campioni potenzialmente infetti da microrganismi gruppo 2 : bunsen, e mascherine di protezione individuale per operazioni poco indaginose, disinfettanti specifici per la pulizia delle superfici di lavoro, sterilizzazione dei recipienti li lavoro. -cappa di sicurezza biologica per la manipolazione delle colture lavaggio sottoporre contenitori, vetreria... a processi di disinfezione o sterilizzazione (autoclave) prima delle operazioni di lavaggio dr.ssa M.Cristina Mosconi -

8 FLUSSO LAMINARE VERTICALE CAPPE BIOLOGICHE DI SICUREZZA CLASSE II impiegata per microrganismi a medio rischio (gruppo 2 e 3) apertura frontale: passaggio di aria dall esterno all interno filtro HEPA per l aria in entrata flusso laminare verticale nell area di lavoro filtro HEPA per l aria in uscita protezione operatore: buona protezione dell ambiente: ottima protezione del campione: ottima dr.ssa M.Cristina Mosconi -

9 CAPPA DI SICUREZZA CLASSE II Presenta un filtro HEPA in entrata ed uno in uscita Filtro HEPA: è composto da foglietti filtranti di microfibre (generalmente in borosilicato) assemblati in più strati, separati da setti in alluminio. I foglietti filtranti in microfibra hanno bloccano le microparticelle. L aria entra nella cappa con un flusso di aspirazione dall estero all interno (si crea barriera di protezione per l operatore) e si muove verticalmente dall alto verso il basso. dr.ssa M.Cristina Mosconi -

10 AUTOCLAVE Decontaminazione attrezzature e materiale infetto attraverso il processo di sterilizzazione determinando l uccisione di tutti i microrganismi vitali. Temperatura di sterilizzazione: 121 C per 15 minuti dr.ssa M.Cristina Mosconi -

11 Buone pratiche di esecuzione del campione QUINDI POTREMMO PARADOSSALMENTE AFFERMARE CHE IL PRELIEVO È PIÙ IMPORTANTE DELL ANALISI

12 Campionamento microbiologico

13 Materiale e attrezzatura per il campionamento Termometro Contenitori idonei per il campionamento Abbigliamento monouso/ DPI: guanti, soprascarpe, camici, copricapo, mascherina, ecc Verbale o Documento di Accompagnamento (D.A.) Sistemi refrigerati per il trasporto al laboratorio Campione istantaneo: per verificare l eventuale esposizione immediata dell utente. - Prelevare senza flambare al punto di sbocco, senza far scorrere l acqua - Misurare la temperatura Campione di acqua all interno dell impianto: per monitorare le condizioni d igiene - Far scorrere l acqua almeno 1 minuto e poi campionare - Misurare la temperatura

14 il materiale prelevato deve giungere al laboratorio nelle stesse condizioni microbiologiche in cui si trova al momento del prelievo Gli effetti sono particolarmente evidenti nei mesi caldi e soprattutto a carico dei parametri quantitativi. Gli aspetti da prendere in considerazione sono i seguenti: Tempi di trasporto TEMPERATURA DI TRASPORTO Temperature di trasporto i campioni devono esser trasportati in laboratorio nel più breve tempo possibile, a temperatura ambiente, al riparo dalla luce L analisi inizia preferibilmente entro 24 ore, trascorse le 24 ore i campioni vengono conservati in un intervallo di temperatura di 2 C-8 C, non oltre i 4 giorni dal prelievo

15 Trasporto e consegna dei campioni Contenitori utilizzati per il trasporto Contenitori coibentati con piastre refrigeranti Per trasporti di lunga durata e/o in condizioni particolari i contenitori coibentati non sono solitamente in grado di mantenere la temperatura richiesta. Frigorifero portatile elettrico o furgone refrigerato. Devono essere portati alla temperatura di esercizio prima di eseguire il campionamento.

16 Procedimento analitico Metodo colturale Il campione di acqua viene filtrato su membrane strerili di di policarbonato, di nylon o esteri di cellulosa con porosità pari a 0,22-0,45 microm e collocate sulle rampe di filtrazione Una aliquota del campione sottoposto a filtrazione viene insemenzata sulla superficie dei terreni di coltura che devono essere arricchiti di cisteina Una seconda aliquota del campione viene sottoposto al trattamento alla temperatura di 50 C per 30 minuti per eliminare la flora ambientale interferente e poi distribuita sul terreno di coltura, La piastra con il terreno di coltura insemenzato viene incubata a 36 C per 10 giorni Le colonie sospette vengono sottoposte a prove sierologiche di conferma o di immunofluorescenza

17 Procedimento analitico Metodo PCR PCR: Plymerase Chain Reaction ( reazione a catena della polimerasi) La tecnica consiste nel ricercare della presenza del DNA genomico della Legionella Rispetto alla PCR classica si può applicare anche la Real-Time PCR che fornisce informazioni quantitative. E denominata anche q-pcr. Il metodo non è validato E dimostrato che questa tecnica fornisce un numero più elevato di campioni positivi e valori più alti rispetto alla tecnica colturale. Vengono rilevati anche le cellule morte, danneggiate o vitali non coltivabili. I risultati positivi devono essere confermati con il metodo colturale. La tecnica colturale esprime il risultato in «Unità Formante Colonie/L», la PCR in «Unità genomica»/l. I due risultati non sono confrontabili

18 Sistemi di controllo della temperatura Sistemi di controllo della temperatura del contenitore di trasporto norme per i campionamenti

19 Controllo ambientale Campionamento microbiologico delle superfici TECNICA DEL TAMPONE Il risultato viene espreso in ugc/cm 2

20 Controllo ambientale Campionamento microbiologico delle superfici TECNICA DELLA SPUGNETTA

21 CAMPIONAMENTO MICROBIOLOGICO DELLE SUPERFICI Si impiegano piastre dette RODAC TECNICA DELLE PIASTRE A CONTATTO Hanno una superficie di 24cm 2, Il fondo è solitamente quadrettato con quadrati di 1x1 cm per facilitare il conteggio Il tempo di contatto terreno/superficie dovrà essere di circa 10 secondi Il tempo di contatto tra piastra e superficie e la pressione esercitata sulla piastra costituiscono le due variabili principali che devono essere standardizzate Dopo incubazione si contano le colonie che si sono sviluppate esprimendo il risultato in UFC/cm 2 o in UFC/24cm 2 Un conteggio accurato può essere effettuato solo sulle piastre nelle quali non siano cresciute più di 200 colonie

22 Controllo ambientale Campionamento microbiologico dell aria TECNICA DELLE PIASTRE ESPOSTE ufc/tempo di esposizione TECNICA SAS ufc/m 3

23 SISTEMA QUALITÀ DEL LABORATORIO Qualificazioni del personale - PO02DL Tecniche di qualificazione del personale Procedure di verifica dei metodi applicati - PG03DL Validazione metodi microbiologici Modalità di calcolo ed espressione dell incertezza del dato analitico - PG04DL Modalità di calcolo, espressione dei risultati e stima dell incertezza di misura per le prove microbiologiche

24 GRAZIE PER L ATTENZIONE