Laboratorio di Batteriologia Speciale, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie Treviso

Transcript

1 Impiego del lavaggio bronco-alveolare (BAL) per la diagnosi delle sindromi respiratorie del bovino e studio della farmacosensibilità degli isolati attraverso la determinazione della minima concentrazione inibente (MIC) Bano Luca 1, Schiavon Eliana 2, Catania Salvatore 2, Berto Giacomo 1, Mottaran Davide 2, Bizzarri Davide 3, Valla Giorgio 3 1 Laboratorio di Batteriologia Speciale, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie Treviso 2 Laboratorio di Diagnostica Clinica, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie - Padova 3 CEVA Salute Animale, Agrate Brianza, Milano Corte Benedettina, 11 Novembre 2015

2 Cos è il lavaggio bronco-alveolare (BAL)? Liquido di lavaggio raccolto dalle vie respiratorie profonde Esecuzione: introduzione di catetere rinotracheo-bronchiale Lunghezza (cm) Ø interno (mm) Ø esterno (mm) Fisiologica (ml) Aspirato (ml) Vacca da latte Vitellone Vitello

3 Perché usare lavaggio bronco-alveolare come matrice diagnostica di BRD? Rispetto al tampone nasale: 1. Assente o ridotto livello di contaminazione microbica inquinante (mancano terreni selettivi per Pasteurellacee) 2. Fornisce informazioni diagnostiche sui patogeni batterici presenti nelle vie aeree profonde 3. Consente di ottenere informazioni sulla farmacosensibilità di specie batteriche responsabili d infezione delle vie aeree profonde (quelle in cavità nasale potrebbero non essere responsabili della clinica)

4

5 MATERIALI E METODI 1. CAMPIONAMENTO Tampone nasale Organi (trattamento?) 2. ESAME BATTERIOLOGICO Identificazione biochimica 3. TEST DI FARMACOSENSIBILITA Antibiogramma 1. CAMPIONAMENTO Lavaggio bronco-alveolare 2. ESAME BATTTERIOLOGICO MALDI TOF MS: identificazione rapida e attendibile anche di specie difficili da id. con bioch 3. TEST DI FARMACOSENSIBILITA MIC in brodo

6 CAMPIONAMENTO Materiali e metodi (2) Soggetti sintomatici: 3-4 per gruppo/allevamento Non trattati, non vaccinati con vaccino vivo da < 30 gg Gennaio/giugno 2015 N gruppi N soggetti Vitellone da carne Vacca da latte Vitelli a carne bianca 8 29 Bovini a duplice attitudine 4 8 TOT

7 RAZZE BOVINE CAMPIONATE Materiali e metodi (3) N gruppi N soggetti Frisona italiana Charolaise Limousine 5 18 Charolaise X Saler 1 3 Aubrac 1 1 Garonnaise 3 6 Blanc bleu belge X FI 3 6 Bruna 1 3 Pezzata rossa 2 5 Piemontese 1 3 Altri incroci 3 10 TOT

8 ACCERTAMENTI DIAGNOSTICI SU BAL Materiali e metodi (4) Virus: IBR, BVD, RSVB, BRCoV Ricerca micoplasmi: esame colturale (IZS PD) Batteriologico: terreni non selettivi (AS, AC) da 51 soggetti eseguito parallelamente il tampone nasale P. multocida, M. haemolytica, H. somni Determinazione della minima concentrazione inibente (MIC) (IZS TV)

9 MIC Materiali e metodi (5) 1 ceppo per specie microbica e per partita 30 P. multocida, 15 M. haemolytica, 10 H. somni Metodo: microdiluizione in brodo (CLSI VET01-A4, 2013) Break-points: CLSI VET01-S2, 2013

10 Materiali e metodi (6) Molecole: Betalattamine: penicillina, amoxicillina, ceftiofur Aminoglicosidi: streptomicina Tetracicline: tetraciclina Macrolidi: tilmicosina Fluorchinolonici: enrofloxacina Amfenicoli: florfenicolo Sulfamidici: sulfametossazolo + trimethoprim

11 RISULTATI ESAME VIROLOGICO Gruppi con almeno un positivo per virus: 26/49 (53%) Soggetti positivi: 47/153 (30,7%) N gruppi positivi (%) N soggetti positivi (%) Vacca da latte (%) Vitellone (%) Duplice attitudine Vit. carne bianca (%) IBR 2 (4,7) 3 (2,2) - 3 (4,5)* - - BVD 10 (18,8) 14 (9,2) 3 (6) b 4 (6) a - 7 (24,3) b BRCoV 16 (30,2) 26 (16,9) 13 (26) 7 (10,6) c 1 5 (17,2) RSVB 6 (11,3) 11 (7,1) 5 (10) 5 (7,5) d - 1 (3,8) *: charolais; a : 2 limousine, 1 charolais, 1 garronaise; b : frisona italiana; c : 6 charolais, 1 frisona italiana; d : 4 charolais, 1 charolais x saler.

12 RICERCA MICOPLASMI Risultati (2) Gruppi con almeno un positivo per Mycoplasma spp.: 33/49 (67,3%) Soggetti positivi: 92/153 (60%) N gruppi positivi (%) N soggetti positivi (%) N Vacche da latte (%) Vitelloni (%) Vit. carne bianca (%) M. bovis 29 (59) 61 (39,8) 13 (26) 36 (54,5) 9 (31) M. dispar 6 (12,2) 9 (5,8) 5 (10) 2 (3) 2 (6,9) M. bovirh. 12 (24,4) 24 (15,6) 8 (16) 12 (18) 3 (10) Sporadici isolamenti di: M. arginini (4 gruppi), M. alkalescens (3 gruppi) 4/61 positivi solo a M. bovis 3/9 positivi solo a M. dispar

13 ESAME BATTERIOLOGICO Risultati (3) Gruppi con almeno un positivo per PM, MH, HS: 45/49 (91%) Soggetti positivi per PM, MH, HS: 93/153 (60,7%) N gruppi N soggetti N Vacche N Vitelloni Vit. carne positivi (%) positivi (%) da latte (%) (%) bianca (%) Pm 30 (61,2) 68 (44,4) 23 (46) 29 (44) 13 (44,8) Mh 15 (30,6) 29 (19) 4 (8) 18 (28) 7 (24) Hs 10 (20) 20 (13) 4 (8) 12 (18) 2 (6,8) Altre specie: Trueperella pyogenes (6), Bibersteinia trehalosi (3), Branhamella ovis Polimicrobismo (9), Bacillus spp.; Enterococcus spp., E. coli, muffe

14 ESAME BATTERIOLOGICO BAL vs TAMPONE NASALE Risultati (4) Concordanza assoluta per patogeni primari sugli stessi soggetti: 13/42 BAL T. nas Concordanza PM MH HS Polimicrobismo: 1 (BAL) vs 14 (T. nasale)

15 RISULTATI AGGREGATI (gruppi) Risultati (4) NEG B. trehalosi/h. parainfluenzae M+V B+V M B Trueperella pyog. V B+M V+B+M V: positivo almeno a 1 agente virale indagato M: positivo a M. bovis e/o M. dispar B: positivo a P. muotocida e/o M. haemolytica e/o H. somni

16 N ceppi Penicillina Risultati (4) PM MH HS MIC 50 0,032 0,063 0,032 MIC 90 0,063 0,5 (I) 0,032 % S 93, P. multocida M. haemolytica H. somni µg/ml

17 N ceppi Amoxicillina Risultati (5) PM MH HS MIC 50 0,125 0,125 0,032 MIC 90 0,125 0,125 0,032 % S 93, P. multocida M. haemolytica H. somni µg/ml

18 N ceppi Ceftiofur Risultati (6) PM MH HS MIC 50 0,016 0,016 0,063 MIC 90 0,016 0,032 0,063 % S P. multocida M. haemolytica H. somni µg/ml

19 N ceppi Enrofloxacina Risultati (7) PM MH HS ,016 0,032 0,064 0,125 0,25 0, µg/ml MIC 50 0,016 0,032 0,032 MIC 90 1 (I) 0,25 0,063 % S 93, P. multocida M. haemolytica H. somni

20 N ceppi Florfenicolo Risultati (8) PM MH HS MIC 50 0,25 1 0,25 MIC 90 0,5 2 0,5 % S P. multocida M. haemolytica H. somni µg/ml

21 N ceppi Streptomicina Risultati (9) PM MH HS MIC (I) > MIC 90 > 256 > % S 46,6 13,3 0 0, > 256 µg/ml P. multocida M. haemolytica H. somni

22 N ceppi Tetraciclina Risultati (10) PM MH HS MIC 50 0,25 0,5 0,5 MIC % S 70 86, ,125 0,25 0, > 32 µg/ml P. multocida M. haemolytica H. somni

23 N ceppi Tilmicosina Risultati (11) PM MH HS MIC MIC % S P. multocida M. haemolytica H. somni µg/ml

24 N ceppi Sulfametossazolo + Trimethoprim Risultati (12) PM MH HS MIC 50 0,125 0,063 0,125 MIC 90 0,5 0,063 0,125 % S 96, P. multocida M. haemolytica H. somni µg/ml

25 Discussione e conclusioni La BRD si conferma una malattia poli fattoriale Il BRCoV è l agente virale più frequente nelle forme respiratorie del bovino BVD è prevalente nelle pezzate nere (vacca da latte e vitelli carne bianca) BAL vs TAMPONE: scarsa concordanza. BAL più sensibile per H. somni (12 vs 3)

26 Discussione (2) Farmaci di vecchia generazione (penicilline, FFC, SXT) si confermano sostanzialmente ancora efficaci «in vitro» ( uso razionale del farmaco) Tilmicosina: in vitro scarsa efficacia sul MH e HS altro meccanismo?

27 Apoptosi di neutrofili infetti da MH* accumulo nei neutrofili (40 X siero) Tilmicosina Riduzione «in vivo» di fattori proinfiammatori (LTB4)* + Riduzione «in vitro» della produzione di PGE da macrofagi alv. e COX2* Scarso danno tissutale e infiammazione autolimitante Miglioramento della sintomatologia clinica *effetto osservato anche con eritromicina, claritromicina, azitromicina, tulatromicina ma non con antibiotici di altre famiglie