Polymerase chain reaction (PCR) Lezioni d'autore di Paola Vinesi

Transcript

1 Polymerase chain reaction (PCR) Lezioni d'autore di Paola Vinesi

2 PCR (I) VIDEO

3 PCR (II) Il metodo della reazione a catena della polimerasi è stato ideato nel 1983 da Kary B. Mullis, che nel 1993 ha ricevuto il premio Nobel per la chimica proprio per questa invenzione. Si tratta di una tecnica che ai pregi della semplicità nell'applicazione, dell'economicità nei costi e della rapidità nel fornire risultati, abbina anche quelli di poter lavorare su quantità minime di campione (in linea teorica anche una singola molecola) e di avere una grande versatilità nell'utilizzo.

4 PCR (III) Questa tecnica biomolecolare permette di amplificare un preciso frammento di DNA di cui si conoscono le sequenze di inizio e di fine, oppure un filamento di RNA, partendo anche da quantità ridottissime. In questo modo è possibile ottenere in vitro in tempi rapidi e in grande abbondanza il materiale genetico necessario per ulteriori applicazioni. Prima dell'introduzione della PCR non era possibile selezionare oligonucleotidi direttamente dal DNA e per ottenere una specifica sequenza era necessaria una metodica lunga e dai risultati non sempre sicuri.

5 PCR (IV) La PCR sfrutta le capacità dell'enzima DNA polimerasi, presente in natura e la cui funzione è di permettere la sintesi di un nuovo frammento di DNA. Dopo che la doppia elica si è divisa in due, esponendo i due filamenti di nucleotidi che la compongono (in questo stato il DNA si dice denaturato), l'enzima si lega all'estremità di un filamento e comincia ad associare in modo complementare nuovi nucleotidi a quelli del filamento già presente, che fa quindi da stampo. Viene così ricostituita la sequenza di DNA.

6 PCR (V) Il materiale da sottoporre a PCR consiste in una soluzione tamponata contenente il frammento di DNA di interesse e tutti i reagenti necessari alla sua amplificazione (ossia DNA polimerasi, primers e una miscela di nucleotidi). In un ciclo di PCR, la fase iniziale è rappresentata dalla denaturazione del DNA d'interesse. Questa è effettuata a temperature molto elevate (intorno ai 100 C). Poiché la DNA polimerasi umana è sensibile al calore, che la inattiva, si usa una polimerasi ottenuta da batteri termofili, naturalmente predisposti a sopportare temperature molto alte. Dopo la denaturazione si ha un raffreddamento che permette ai primers di attaccarsi allo stampo di DNA.

7 PCR (VI) I primers funzionano da innesco per la sintesi del nuovo filamento di DNA e sono costituiti da sequenze oligonucleotidiche complementari a quelle poste ai lati della regione da replicare. Questa è la cosiddetta fase di annealing (appaiamento) e vede entrare in gioco la DNA polimerasi termostabile, poiché si ha un innalzamento della temperatura (circa 72 C). Per la sintesi del nuovo filamento (fase di prolungamento) si utilizzano i nucleotidi presenti in soluzione nel campione su cui si sta lavorando. Il filamento si forma partendo da un innesco e raggiungendo l'altro, e funziona come stampo per le successive repliche di DNA, poiché la PCR prevede più cicli e questo garantisce un raddoppiamento del DNA a ogni ciclo. Inoltre, la velocità della reazione è tale che in poche ore vengono sintetizzati cento miliardi di molecole.

8 PCR (VII) Nella figura lo schema dell'amplificazione di una regione di DNA tramite PCR

9 PCR (VIII) L'intera sequenza di reazioni della PCR è condotta in un apparecchio specifico chiamato termociclatore, in grado di eseguire automaticamente i cambiamenti ciclici di temperatura necessari ad amplificare per via enzimatica le sequenze di DNA.

10 TERAPIA GENICA (I) Le malattie genetiche sono dovute alla mutazione di un gene che determina la produzione in quantità insufficienti di una proteina vitale per l'organismo oppure la produzione di una proteina nociva. Il fondamento della terapia genica è che, inserendo nel genoma di una cellula una copia normale del gene mutato, si può ripristinare l'abituale funzionalità genica. D'altra parte, oltre ai geni codificanti è possibile trasferire frammenti di DNA e di RNA dotati di attività enzimatiche e di regolazione, e in questo modo si può intervenire anche nelle patologie non genetiche, dove può essere ripristinata una funzione perduta o alterata.

11 TERAPIA GENICA (II) Questo ha ampliato il campo d'applicazione della terapia genica, estendendolo per esempio all'oncologia, alle patologie cardiovascolari, alle malattie da virus, come l'aids. Nelle figure della slide successiva sono riportati esempi, rispettivamente: A) di come la terapia genica può essere applicata alla cura di patologie del sangue; B) oppure alla stimolazione immunologica.

12 TERAPIA GENICA (III) Esempio di terapia genica somatica, rivolta al trattamento delle malattie del sangue: le cellule staminali, prelevate dal paziente, sono infettate con il virus vettore che vi introduce il suo genoma con il gene normale. Le cellule modificate successivamente sono iniettate in vena.

13 TERAPIA GENICA (IV) Esempio di terapia genica su base immunologica: nelle cellule tumorali sono inseriti plasmidi contenenti geni che codificano proteine capaci di stimolare la risposta immunitaria

14 TERAPIA GENICA (V) Il trasferimento del gene "curativo" può avvenire in vari modi; quello che attualmente appare più efficiente utilizza i vettori virali: nel genoma virale è inserito il gene di interesse, successivamente trasferito in una cellula ospite sfruttando la capacità infettiva del virus. A questo scopo i virus più promettenti risultano essere i retrovirus, i lentivirus, gli adenovirus, i virus adenoassociati, gli herpesvirus.

15 TERAPIA GENICA (VI) Nel complesso, la terapia genica è un metodo molto promettente, potenzialmente capace di aprire ampi orizzonti alla medicina e non solo, ma presenta ancora molte difficoltà applicative, che attualmente ne limitano l'utilizzazione curativa a un numero ridotto (almeno rispetto alle possibilità) di patologie. Sarà quindi necessario proseguire con ulteriori e più approfonditi studi per garantire la necessaria sicurezza che permetterà a questa forma di terapia di diffondersi nella prassi medica.

16 MARCATURA GENICA Tramite il metodo della marcatura genica, i procedimenti alla base della terapia genica possono essere utili anche per ottenere informazioni di tipo sia biologico sia clinico. In questo caso, il vettore virale contiene un gene marcatore, che è trasferito in una popolazione cellulare specifica, successivamente reimpiantata nel paziente. E' così possibile seguire il destino delle cellule marcate all'interno di un organismo vivente. Questo tipo di approccio è ancora sperimentale, ma è già in grado di fornire informazioni molto utili.

17 VACCINI (I) Un'altra applicazione delle tecniche di manipolazione del DNA è rappresentata dalla creazione di vaccini. In questo caso, il tratto genico trasferito codifica per la proteina contro la quale si desidera stimolare la risposta del sistema immunitario. Il gene in oggetto può entrare nell'ospite complessato in un vettore virale o, semplicemente iniettato, come DNA nudo. Come esempio si può citare il vaccino contro il virus dell'epatite B (HBV, Hepatitis B virus), disponibile da più di 20 anni. Attualmente si sta lavorando su vaccini diretti contro patologie come l'aids e alcuni tipi di tumore.

18 VACCINI (II) La tecnologia del DNA ricombinante garantisce una purezza del vaccino più elevata rispetto a quella che caratterizza i vaccini ottenuti dal plasma, cosicché è stato possibile eliminare effetti collaterali dovuti a sostanze presenti nel preparato di vaccinazione ma che nulla hanno a che fare con esso. Inoltre, permette di ottenere quantità pressoché infinite dell'antigene e anche di abbassare i costi di produzione.

19 MAPPATURA DEL GENOMA (I) Tra le applicazioni della PCR una di quelle che ha avuto più risonanza ha riguardato i vari progetti di mappatura del genoma, compreso quello umano. Tra le possibilità offerte per questo tipo di indagine, c'è per esempio quella fondata sull'utilizzazione di particolari siti genici costruiti per funzionare come marcatori, dando la possibilità di disporre i frammenti del genoma (ottenuti attraverso la PCR) nell'esatto ordine che dovrebbero avere su uno specifico cromosoma. Il completamento del Progetto genoma umano ( ) ha permesso di conoscere l'intera sequenza del genoma dell'uomo.

20 MAPPATURA DEL GENOMA (II) Si tratta di un progresso di particolare importanza, con ricadute potenzialmente molto interessanti, per esempio nel settore medico. Infatti, la conoscenza dell'assetto genetico di un individuo può dare informazioni molto specifiche sulla sua predisposizione verso particolari malattie, che inoltre potrebbero essere diagnosticate precocemente, e sulla sua eventuale sensibilità verso determinati farmaci. In questo modo, attraverso la conoscenza dello stato di salute "genomico" di un paziente, è possibile elaborare terapie personalizzate, dotate di maggiore efficacia rispetto ad altre più generiche.

21 MAPPATURA DEL GENOMA (III) Schema delle ricadute del Progetto genoma umano nell'ambito sanitario, nella ricerca di base e nel campo eticofilosofico.

22 DIAGNOSTICA L'utilità della PCR nel settore della diagnostica è ormai da tempo riconosciuta e le applicazioni sono numerose, in particolare questa tecnica risulta molto efficace nell'individuare le mutazioni genetiche causa di forme tumorali o di malattie ereditarie. Per esempio, in oncologia con la PCR è possibile controllare la comparsa di recidive in pazienti leucemici che siano stati sottoposti a terapia. La PCR è anche impiegata nella diagnosi delle infezioni batteriche e virali.

23 GENETICA FORENSE Nell'ambito giuridico, la PCR è utilizzata per amplificare le tracce di DNA presenti in alcuni tipi di campioni prelevati dal luogo in cui è avvenuto un reato. Questi campioni devono naturalmente essere di origine biologica, come sangue, capelli, saliva, sperma, pelle. L'amplificazione del DNA garantisce quantità sufficienti di materiale per poter effettuare tutte le analisi necessarie, compresi i confronti tra l'impronta genetica dei materiali biologici e quella dell'eventuale sospettato.

24 STUDIO MOLECOLARE DELL EVOLUZIONE (I) La PCR è impiegata anche negli studi di evoluzione molecolare. E' infatti possibile misurare l'omologia tra specie diverse confrontando le differenze esistenti fra nucleotidi dello stesso gene: tanto maggiore è la diversità tra le sequenze nucleotidiche, tanto più elevata è le lontananza delle specie rispetto a un antenato comune; tanto più alto è il grado di conservazione di queste sequenze nucleotidiche, tanto più vicine sono le specie dal punto di vista evolutivo.

25 STUDIO MOLECOLARE DELL EVOLUZIONE (II) Importante è anche l'applicazione della PCR agli studi sull'evoluzione di popolazioni umane, in particolare per quanto riguarda l'analisi di particolari siti del DNA mitocondriale. Anche l'esame del DNA di origine retrovirale può fornire utili informazioni sui processi di speciazione.

26 FINE