Estrazione del DNA. A)Resine (Chelex 100) B) Solven: organici. C) Sali (sal:ng out)

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1 Estrazione del DNA A)Resine (Chelex 100) B) Solven: organici C) Sali (sal:ng out)

2 La Chelex 100 è una resina cara4erizzata da biglie a carica nega:va (ioni imminoaceta: contenu: nei copolimeri di s:rene divinilbenzene), che chelano gli ioni metallici polivalen: (Mg 2+ ) che agiscono come cofa4ori delle Dnasi nel catalizzare la diges:one del DNA.

3 Questa tecnica di estrazione: risulta efficiente come le tecniche che u:lizzano p.e. la Proteinasi K (tecnica del Sal:ng out); presenta il vantaggio di aver bisogno di minime quan:tà di campione, anche non perfemamente conservato; richiede tempi brevi per l estrazione; elimina le interferenze con alcuni an:coagulan: (es. Eparina)

4 D altro canto, però, il DNA estramo con la tecnica Chelex 100 risulta essere meno puro; non può essere conservato a lungo; non può essere u:lizzato per gli RFLP e talvolta può inibire la PCR ( Walsh et al., 1991).

5 L estrazione con solven: organici permeme di omenere DNA altamente purificato. Questa tecnica è caramerizzata da a) lisi dei globuli rossi (NaCl, Citrato di Sodio) b) lisi dei leucoci: c) diges:one di materiale proteico e lipidico (proteinasi K, SDS) Il DNA in soluzione viene estramo tramite fenolo mentre il cloroformio è presente per eliminare il fenolo che potrebbe inibire la PCR Si può poi procedere con precipitazione del DNA mediante dialisi (Amicon ; Microcon )

6 Questa tecnica di estrazione: risulta molto efficiente; presenta il vantaggio di aver bisogno di minime quan:tà di campione (francobolli, cicca di sigarema; tracce di materiale biologico); il DNA estramo con questa metodica è caramerizzato da elevata purezza; elimina inibitori enzima:ci elimina la maggior parte delle proteine

7 D altro canto, però I tempi di estrazione sono molto lunghi; i solven: organici sono tossici ed irritan:;

8 L estrazione non organica prevede l u:lizzo di sali come l NaCl o LiCl Come per le metodiche di estrazione con solven: organici anche per questa metodica le principali fasi sono le seguen:: a) lisi delle cellule b) diges:one di materiale proteico e lipidico (proteinasi K, SDS) I sali potrebbero non essere adeguatamente rimossi: diges:one mediante endonucleasi di restrizione; alterazione della mobilità del DNA (band shiwing)

9 Estrazione del DNA TUTTI I TAMPONI, IL MATERIALE MONOUSO E LA VETRERIA SI AUTOCLAVANO AD ECCEZIONE DELL SDS CHE NON VIENE AUTOCLAVATO Estrazione del DNA da sangue intero (Miller et al., 1988) Il tampone di estrazione Tris EDTA freddo (20mM Tris HCl, 5mM EDTA ph7,8 8) 100 µl di proteinasi K (10mg/ml) 1 ml di SDS (10%) Estrazione del DNA da piccole quanktà di materiale biologico (mod. Budowle et al., 2000) Il tampone di estrazione 100 mm Tris HCl 10 mm EDTA ph mm NaCl 2% SDS 15 µl di proteinasi K (10 mg/ml)

10 Tris HCl lisi cellulare EDTA chelante, sequestra gli ioni SDS lisi delle membrane Proteinasi K degradazione della componente proteica

11 Estrazione del DNA da piccole quanktà di materiale biologico (mod. Budowle et al., 2000) fenolo:cloroformio:alcool isoammilico (PCIA)(25:24:1) Fenolo estrazione del DNA Cloroformio eliminazione del fenolo Alcool isoammilico per rendere puro il DNA ATTENZIONE: IL PCIA È IRRITANTE E TOSSICO

12 Estrazione del DNA GENOMICO da sangue intero (Miller et al., 1988) Lasciare sciogliere i campioni MeMere il sangue in falcon sterili ed aggiungere il Buffer Tris EDTA freddo (LISI CELLULARE) Centrifugare per 15 a 4000 rpm Svuotare le proveme in becker di plas:ca facendo in modo che il pellet res: sul fondo. Aggiungere nuovamente il tampone nelle falcon con il pellet e pipemare con le pasteur tagliate ed autoclavate fino ad omenere una soluzione limpida Centrifugare per 15 a 4000 rpm Raccogliere il surnatante nei becker di plas:ca Nel caso in cui il pellet non sia pulito effemuare un nuovo lavaggio Aggiungere al pellet il tampone e risospendere Aggiungere l SDS al 10% (LISI DELLE MEMBRANE) e la proteinasi K (DIGESTIONE DELLE PROTEINE) Incubare a bagno maria a 65 C per 1 ora, agitando per inversione saltuariamente Aggiungere NaCl 5M (PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE) Agitare su piastra basculante per 10 Centrifugare per 15 a 3500 rpm Prelevare con le pasteur tumo il surnatante (lasciando i ghosts e la parte colloidale nel fondo) e trasferirlo in becker di vetro Aggiungere etanolo assoluto freddo in rapporto 2:1 (PER FAR PRECIPITARE IL DNA) Raccogliere il DNA avvolgendolo intorno ad una bacchema di vetro MeMere la bacchema in falcon da 5ml contenen: 1ml di Robert s buffer Lasciare in agitazione i tubi tuma la nome a T ambiente