Renato Tozzoli Servizio di Medicina di Laboratorio Ospedale di Latisana (Ud)

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1 Renato Tozzoli Servizio di Medicina di Laboratorio Ospedale di Latisana (Ud)

2 IL CONSOLIDAMENTO DEI TEST AUTOANTICORPALI NEL LABORATORIO DI AUTOIMMUNOLOGIA: L ESPERIENZA ITALIANA

3 The future of autoimmunology Fritzler MJ New technologies in the detection of autoantibodies From Proteomics to Molecular Epidemiology: Relevance of Autoantibodies 6th Dresden Symposium on Autoantibodies Dresden, September 4 7, Multiplex testing 1. Arrays of addressable laser microbeads 2. Arrays on planar surfaces: microchip/membrane spotted arrays 3. Microfluidics: Lab on a chip 4. Nanotechnology and nanoengineering: nanobarcodes

4 L evoluzione della tecnologia e le ricadute sui percorsi diagnostici

5 L evoluzione delle tecnologie diagnostiche nelle malattie autoimmuni I metodi convenzionali per il dosaggio autoanticorpale: le vecchie tecnologie L impiego dei singoli test autoanticorpali nella diagnosi e nella prognosi delle malattie autoimmuni I metodi a determinazione multipla per il dosaggio autoanticorpale: le nuove tecnologie Il ruolo dei profili autoanticorpali nella predizione e nella prognosi di malattia

6 I metodi immunologici per la rilevazione autoanticorpale Tozzoli R, et al. Il Laboratorio nelle MRA. Esculapio, Bologna 2007 Bassetti D, et al. Il Laboratorio nelle MAO. Esculapio, Bologna 2009 Metodi immunologici convenzionali Metodi immunochimici (qualitativi) Metodi immunometrici (quantitativi) Metodi immunologici a determinazione multipla (multiplex o proteomici)

7 Classificazione dei metodi immunologici commerciali per la misura di autoanticorpi (2009) Convenzionali di I generazione Immunodiffusione doppia (ID) Fissazione del complemento (CF) Immunofluorescenza indiretta (IFI) Agglutinazione passiva (AP) Radiorecettoriale (RRA) Westernblot (WB) Convenzionali di II generazione Recettoriale (RRA, ERA, LRA) Radioimmunologico metrico (RIA IRMA) Immunoenzimatico metrico (EIA IEMA) Immunodot blot (IB DB) Immunochemiluminometrico (CLIA ILMA) Immunofluorimetrico (FIA IFMA) Proteomici (multiplex) Microarray a microsfere indirizzate (MBA) a microparticelle codificate (UCP) a microspot a nanodot (NALIA) Macroarray a blot lineare Convenzionali di III generazione Recettoriale (ERA)

8 I livelli di automazione dei metodi immunologici commerciali (2009) Manuali A tubi sensibilizzati A micropiastre Ad automazione parziale (a moduli) A micropiastre Ad automazione totale Dedicati ad analiti eterogenei Dedicati ad analiti omogenei (solo autoanticorpi)

9 L evoluzione delle tecnologie analitiche: il ruolo dell automazione Throughput Metodi convenzionali manuali (IFI, DID, WB) 1970 Metodi convenzionali automatizzati (EIA, FIA, LIA, RIA) 1995 Metodi multiplex ad alta automazione (array) 2006 Metodi multiplex a bassa automazione (line blot, array) 2003 Time

10 L evoluzione dell attività produttiva del laboratorio clinico in autoimmunologia

11 I metodi a determinazione multipla (multiplexing): una nuova era per i test autoanticorpali High throughput protein array techniques are already available in which hundreds of autoantibodies specificities can be analyzed simultaneously. This technology might allow prospective studies of large numbers of healthy individuals for the development of many autoimmune diseases. Another alternative is to apply this technology to existing databases.. Testing these samples for multiple autoantibodies with protein arrays and correlating the results with diagnosed diseases might answer several important questions about the preclinical natural history of autoimmune diseases. Scofield RH. Autoantibodies as predictors of disease. Lancet 2004; 363:

12 Planar and Nonplanar Microarrays for Autoantibodies Tozzoli R. Clin Chem Lab Med 2008 (modified) Support Format Detection system AutoAbs tested Estimated throughput Microbeads Wells FL Microbeads Al barcoded microparticles Nitrocellulose membranes Nitrocellulose membranes Full automation Commercial product FIDIS, ATheNA, QuantaPlex Reference Rouquette, 2003 FL BioPlex 2200 Shovman, 2005 Wells FL UltraPlex Microspots CL Biochip Nanodots CL NALIA Pang, 2005 Hentschel, 2004 McBride, 2008 Polystyrene chips Microspots FL Impact Klause, 2007 Glass slides Microspots FL NA Glass slides gold coated Microspots SPR NA Hueber, 2005 Segbers Lokate, 2007

13 Multiplexing: sistemi analitici e diffusione in Italia ( ) Azienda Sistema Profili/Antigeni Evoluzione Diffusione BMD, F (AU) FIDIS ANA/9, Rheuma/2, AIV/2 Celiac/3, Thyroid/2 IL (INOVA), S QuantaPlex ANA/8, AIV/2, Celiac/3, Liver/5? +? +/- ZEUS, USA Athena Multi- Lyte ANA/10, AIV/3 Celiac/2, Thyroid/2 ++ +/- BIO-RAD, USA Bioplex 2200 ANA/13, ANCA/ /- Pronostics, UK UltraPlex ANA/9, RF/3, acl/3, Thyroid/2, Celiac/5, Liver/ ImmunoConcept Microzyme ANA/

14 Multiplex bead array (MBA): le soluzioni commerciali

15 Il Sistema AtheNA Multi Lyte AtheNA Luminex Lx 200 Fully Automated Platform AIMS

16 Il sistema AtheNA e il suo sviluppo AtheNA Products ANA II Plus (10 antigens) ANA III Plus (10 antigens) AIV Plus (3 antigens) Tg/TPO Plus (2 antigens) RF Plus (1 antigen) Celiac IgA Plus (2 antigens) Celiac IgG Plus (2 antigens) Athena Future Products APS IgG (2 antigens) APS IgA (2 antigens) APS IgM (2 antigens)

17 Il sistema BioPlex 2200 Lo strumento Le caratteristiche strutturali

18 BioPlex 2200: The Technology Components Immunoassay format Magnetic Beads Automated Washing Fluorescence Detection

19 The BioPlex 2200 Difference Patented Magnetic Beads Fully Automated Random Access Continuous Sample Loading STAT Capability 100 Samples per hour 1300 results on every ANA Screen Kit 3 Internal QC Beads in Each Kit

20 The UltraPlex system The UltraCode Principles of the UltraPlex assays Al barcoded microparticles (UltraCode) Anti human IgG fluorescent coniugate The UltraPlex SmartReader detects fluorescence associated with each UltraCode 96 deep well microplate ANA (10 autoantibodies) Thyroid (2 autoantibodies) Coeliac (5 analytes: AGA IgA, AGA pan Ig; ttg IgA; ttg pan IgG; Total IgA)

21 The UltraPlex system The UltraCode UltraPlex future products Liver (4 autoantibodies) acl (3 autoantibodies: IgG, IgA, IgM) RF (3 autoantibodies: IgG, IgA, IgM)

22 The MicroZyme system The Microarray The BioChip

23 Ideal requirements of a proteomic technology for diagnostic and predictive purposes Bizzaro N, Tozzoli R, Shoenfeld Y. Arthritis Rheum 2007; 56: Allow simultaneous determination of at least different autoantibodies Enable the detection of multiple antibody isotypes Be based on laboratory systems with high analytical accuracy Be highly automated with high troughput Have performance costs per antibody five/ten fold lower than those of conventional tests

24 Il ruolo del Laboratorio Clinico nelle malattie autoimmuni: gli autoanticorpi come marcatori predittivi Marcatori predittivi di malattia in soggetti sani 1. Nella popolazione in toto 2. Nelle femmine in età puberale 3. In gravidanza 4. Nei familiari di soggetti affetti da malattie autoimmuni 5. Nei soggetti sani con positività autoanticorpale casuale Marcatori predittivi di malattia in soggetti sintomatici 1. Pazienti paucisintomatici 2. Pazienti affetti da MRA 3. Pazienti affetti da MAO Marcatori predittivi del decorso di malattia (prognostici) 1. Attività 4. Severità Leslie D, Lipsky P, Notkins AL. Autoantibodies as predictors of disease. J Clin Invest 2001; 108: Bizzaro N, Tozzoli R, Schoenfeld Y. Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases? Arthritis Rheum 2007; 56:

25 L iceberg epidemiologico autoimmune Tozzoli R. RIMeL, 2008 The sun: The environmetal agent The man in the boat: The clinician The snorkel diver: The hystopathologist The aqualong diver: The autoimmunologist

26 STATO DELL ARTE E PROSPETTIVE DELLA DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE MALATTIE AUTOIMMUNI ORGANO SPECIFICHE

27 Evoluzione delle proposte dell Industria Biomedica: sistemi ad automazione discreta Azienda ADALTIS Nexgen Bouty 2. ALFA WASSERMANN Immunozone Medical Systems 3. ASTRA AP Blot 4. ALIFAX Tek 6 Bellini 5. BIOMEDIS BIOSYSTEMS AP22, APE 6. BIO RAD Evolis PhD System 7. DADE BEHRING BEP 2000 Siemens 8. DASIT AP22, APE 9. DELTA BIOLOGICALS Mago Plus DW Mago Plus DW 10. DIASORIN ETI Max ETI Max

28 Evoluzione delle proposte dell Industria Biomedica: sistemi ad automazione discreta Azienda EUROIMMUN DSX I2 P 12. EUROSPITAL Impatto 13. GRIFOLS Triturus Triturus 14. IL QuantaLyser 15. MENARINI Plato Zenit 16. PHADIA DSX 17. RADIM Alisei Alisei, Brio TECHNOGENETICS DSX DSX

29 Sistemi ad automazione discreta (a moduli)

30 Sistemi ad automazione discreta (a moduli)

31 Evoluzione delle proposte dell Industria Biomedica: sistemi ad automazione completa Azienda Napoli, 2003 Spoleto, 2009 BAYER Centaur Siemens Centaur XP BECKMAN COULTER Access BIOALLERGY/BIO GENETIX ENEA System ENEA System, Ulisse DIASORIN Liaison Liaison MEDICAL SYSTEMS Immulite 2000 Siemens Immulite 2000 IL INOVA Bioflash PHARMACIA/PHADIA ImmunoCap EliA 100 ImmunoCap EliA 100,250 ROCHE Elecsys, Modular Elecsys, Modular RADIM RAD 120 TECHNOGENETICS IDS isys

32 Il sistema di rilevazione negli analizzatori automatici Azienda Strumento Tracciante BECKMAN COULTER Access Chemiluminescenza BIO GENETIX Ulisse Chemiluminescenza DIASORIN Liaison Chemiluminescenza IL/INOVA BioFlash Chemiluminescenza PHARMACIA/PHADIA ImmunoCap EliA 100, 250 Fluorescenza ROCHE Elecsys, Modular Chemiluminescenza RADIM RAD 120 Fluorescenza SIEMENS Centaur XP, Immulite Chemiluminescenza TECHNOGENETICS IDS isys Chemiluminescenza

33 Sistemi ad automazione completa

34 Sistemi ad automazione completa di recente introduzione Phadia: ImmunoCap 250 Radim: RAD 120

35 Sistemi ad automazione completa di prossima introduzione IL: BioFlash Technogenetics: isys

36 La nuova estetica dell automazione: Helmed Aesku e ipro BioSystems

37 SIMeL, GdS AIA, AIRA ringraziano ALIFAX ASTRA BIORAD BIOSYSTEMS BIOMEDIS DASIT DELTA BIOLOGICALS DIASORIN EUROIMMUN EUROSPITAL GRIFOLS IL INOVA IMMUNOCONCEPTS LAGITRE MENARINI DIAGENE PHADIA RADIM TECHNOGENETICS