Free Testosterone ELISA
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- Margherita Filippi
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1 Istruzioni per l Uso Free Testosterone ELISA Saggio immunoenzimatico per la diagnostica in vitro quantitativa di tesosterone libero nella siero umano. DB C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. USO PREVISTO Saggio immunoenzimatico per la diagnostica in vitro quantitativa di tesosterone libero nella siero umano. 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI Il testosterone, uno steoide C19, è l ormone naturale più attivo della famiglia degli androgeni. Nei soggetti di sesso maschile è principalmente prodotto dalle cellule interstiziali dei testicoli (cellule di Leydig) e solo una piccola quantità viene prodotta nella corteccia surrenale. Complessivamente i soggetti di sesso maschile hanno una concentrazione di testosterone nel plasma da 10 a 20 volte superiore rispetto ai soggetti di sesso femminile. Nella circolazione gran parte del testosterone è legata alle glicoproteine plasmatiche come la globulina legante ormoni sessuali (SHBG) e l albumina. Il testosterone è responsabile dello sviluppo dei caratteri sessuali secondari maschili e la sua misurazione è utile per valutare eventuali stati ipogonadici. Nella donna, livelli elevati di testosterone si riscontrano generalmente in caso di irsutismo e virilizzazione, ovari policistici, tumori ovarici, tumori surrenali e iperplasia surrenale. Nell uomo, livelli elevati di testosterone sono associati alle malattie dell ipotalamoipofisi, a tumori testicolari, iperplasia surrenale congenita e carcinoma prostatico. Bassi livelli di testosterone possono riscontrarsi in pazienti affetti dalle seguenti malattie: ipopituitarismo, sindrome di Klinefelter, femminilizzazione testicolare, orchiectomia e criptorchidismo, difetti enzimatici e alcune malattie autoimmuni. Il testosterone circola nel sangue legato a tre proteine: globulina legante gli ormoni sessuali (60-80%), albumina e globulina legante il cortisolo. Solo l 1-2% circa del testosterone totale in circolo non è legato o è libero. Anche se è ancora in corso di studio, la maggior parte dei ricercatori accetta la determinazione del testosterone libero come misura della frazione biologicamente attiva. Si raccomanda di determinare il testosterone libero per evitare l influenza delle variazioni delle proteine di trasporto sulla concentrazione totale di testosterone. 3. PRINCIPIO DEL TEST Test immunoenzimatico assorbente su fase solida (ELISA) basato sul principio di competizione. Una quantità sconosciuta dell antigene presente nel campione e una quantità fissa di antigene legato all enzima competono per i siti di legame sugli anticorpi che rivestono i pozzetti. Dopo incubazione i pozzetti vengono lavati per bloccare la reazione di competizione. Successivamente alla reazione del substrato l intensità del colore sviluppato è inversamente proporzionale alla quantità dell antigene presente nel campione. I risultati dei campioni possono essere determinati direttamente usando la curva standard. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. 8. Il personale delle pulizie dev essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle procedure da adottare. 9. Alcuni reagenti contengono azido di sodio (NaN 3 ) come conservante. In caso di contatto con occhi e pelle risciacquare subito abbondantemente. NaN 3 potrebbe reagire con piombo e rame piombato formando metalli azidici esplosivi. Quando si eliminano i reagenti provvedere a bagnarli con grandi quantità di acqua per evitare formazione di azidi. Version / 6
3 10. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi. 5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. L informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. La piastra microtitrata aperta è stabile fino a scadenza del kit se conservata nel suo involucro ben chiuso riposta a 2 8 C. 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Siero Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l integrità del campione di sangue dal momento del prelievo al momento dell esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati, itterici o lipemici. È possibile utilizzare NaN3, ProClin 300 o Thimerosal come conservante. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro interno. Conservazione: 2-8 C -20 C (Aliquote) Stabilità: 48 h > 1 mese 7. MATERIALE FORNITO Quantità Simbolo Componente 1 x 12x8 MTP 1 x 15 ml ENZCONJ 1 x 6 x 1.0 ml CAL A-F 1 x 2 x 1.0 ml CONTROL x 19 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Non esporre alla luce solare diretta e al calore. Evitare la ripetizione di cicli di congelamento/scongelamento. Spedire i campioni dopo loro congelamento. Prima di pipettare, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. No scongelare i campioni in un bagnomaria a 37 C. Micropiastra Strisce separabili. Rivestito con anticorpo da topo anti-testosterone (monoclonale). Coniugato Enzimatico Pronto/a all uso. Contiene: Testosterone coniugato a HRP, stabilizzatori. Standard A-F 0; 0.4; 1.1;7.5; 25; 160 pg/ml Pronto/a all uso. Contiene: Testosterone, Siero umano, stabilizzatori. Controllo 1+2 Pronto/a all uso. Contiene: Testosterone, Siero umano, stabilizzatori. Soluzione Substrato TMB Pronto/a all uso. Contiene: TMB, Tampone, stabilizzatori. Soluzione Stop TMB Pronto/a all uso. 1 M H 2SO 4. 1 x 100 ml WASHBUF CONC Tampone Lavaggio Concentrato (10x) 8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 25; 50; 100; 150 e 250 µl 2. Vortex mixer 3. Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti 4. Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico 5. Incubatore, 37 C 6. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento nm) 7. Acqua bidistillata o deionizzata 8. Carta assorbente, puntali per pipette e timer Version / 6
4 9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (18-25 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. 4. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento. 5. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un appropriata distribuzione sulla piastra. 6. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le soluzioni in tutti i pozzetti. 7. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti. 8. L umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l involucro finché non ha raggiunto la temperatura ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell involucro con il disseccante. 10. ISTRUZIONI PRE-TEST Il contenuto del kit per 96 determinazioni può essere diviso per 3 esecuzioni separate. I volumi indicati di seguito si riferiscono a un'esecuzione con tutte le strisce (96 determinazioni) Preparazione di componenti liofilizzati o concentrati Diluire / dissolvere Componente con Diluente Rapporto Note Conservazione Stabilità 100 ml WASHBUF 900 ml acqua bidist. 1:10 Mescolare energicamente. 2-8 C 8 settimane Diluizione dei Campioni Pretrattamento dei campioni: nissuno I campioni con valori superiori a 160 pg/ml non devono essere diluiti. La diluizione altererebbe l equilibrio tra il testosterone libero e le proteine sieriche. 11. PROCEDURA DEL TEST 1. Pipettare 25 µl di ogni Standard, Controllo e acilato nei rispettivi pozzetti della micropiastra di provette. 2. Pipettare 100 µl di Coniugato Enzimatico nei ogni pozzetto. 3. Mescolare bene per 10 secondi. 4. Incubare 1 h a 37 C. 5. Lavare 3 volte con 250 µl di Tampone Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una carta assorbente. 6. Pipettare 150 µl di Soluzione Substrato TMB nei ogni pozzetto. 7. Incubare min a 37 C. 8. Arrestare la reazione per aggiungere 50 µl del substrato una soluzione stop TMB nei ogni pozzetto. Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. Il colore passa da blu a giallo. 9. Misurare la densità ottica con un fotometro a 405 nm (lunghezza d onda di riferimento: nm) entro 15 min dopo aver pipettato la Soluzione Stop. Version / 6
5 12. CONTROLLO DI QUALITA I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l uso. L utente deve inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi di controllo qualità periodici. In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni d incubazione e metodi di lavaggio. 13. CALCOLO DEI RISULTATI La DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione (asse x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log. Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile). La concentrazione dei campioni può essere ricavata dalla curva standard. (OD) Free Testosterone ELISA Tipica Curva di Calibrazione (Esempio. Non usare per il calcolo!) Standard Testosterone OD Media OD/OD max (%) (pg/dl) A B C D E F pg/ml 14. VALORI ATTESI I soli risultati non dovrebbero essere l unica motivazione alla base di una scelta terapeutica. Devono essere correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici. Soggetti apparentemente sani mostrano i seguenti valori: Free Testosterone n Mediano 95% percentile Uomini [pg/ml] Donne [pg/ml] Si consiglia ad ogni laboratorio di calcolare i propri valori di riferimento. 15. LIMITI DELLA PROCEDURA La raccolta e conservazione dei campioni ha influenza significativa sui risultati del test. Vedere la sezione PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI per maggiori dettagli. Per le reazioni crociate vedere la sezione PERFORMANCE. I seguenti componenti del sangue non influenzano significativamente (+/-20% del valore atteso) I risultati del test fino alle concentrazioni indicate di seguito: Emoglobina 5 mg/ml NaN % Bilirubina 5 mg/ml ProClin % Trigliceridi 91 mg/ml Thimerosal 0.01 % Version / 6
6 16. PERFORMANCE Specificità Analitica (Reattività Crociate) Sensibilità Analitica (Limite di Rilevazione) Precisione Intra-Saggio Inter-Saggio Sostanza Testosterone (4-Androsten-17β-ol-3-one) 11β-Hydroxy-Testosterone (4-Androsten-11β,17β-diol-3-one) 11α-Hydroxy-Testosterone (4-Androsten-11α,17β-diol-3-one) Diidrotestosterone (5α-Androstan-17ß-ol-3-one) Androstenedione (4-Androstene-3,17-dione) Metil-Testosterone (4-Androsten-17α-methyl-17ß-ol-3-one) Siero Reattività Crociate (%) pg/ml Media (Zero-Standard) - 2SD Cross-reattività di altre sostanze esaminate 0.1 % Siero pg/ml Media SD CV(%) n Confronto del metodo IBL-Assay = x r = n = 255 EFFETTO DELLA GLOBULINA LEGANTE GLI ORMONI SESSUALI (SHBG) Lo scopo di questo studio era indagare una possibile interferenza causata dal legame della SHBG con il coniugato testosterone libero-perossidasi di rafano. Siero umano trattato per adsorbimento su carbone attivo è stato addizionato con SHBG a concentrazioni comprese tra 6 e 200 µg/ml ed è stato analizzato con il kit ELISA diretto per il testosterone libero. SHBG aggiunta (µg/ml) OD 450 nm B/B0 (%) I risultati hanno mostrato valori di testosterone legato compresi tra 97 e 103% di of B/B 0 (B 0 =siero non addizionato) anche a livelli di SHBG superiori al normale (0,5-5 µg/ml). Concludendo, i risultati hanno mostrato che l SHBG non esercitava alcuna influenza significativa sul kit ELISA diretto per il testosterone libero. EFFETTO DELL ALBUMINA SIERICA UMANA (HSA) Lo scopo di questo studio era indagare una possibile interferenza dell albumina sierica umana (HSA) sulla procedura di analisi. HSA è stata ggiunta ai campioni di tre pazienti a concentrazioni di 1,25, 2,5 e 5,0 g/dl. Tutti i campioni sono stati analizzati con il kit diretto ELISA per il testosterone libero e hanno fornito i seguenti risultati (in pg/ml): Campione HAS aggiunta (g/dl) I risultati dimostrano l assenza di effetti significativi dell HSA aggiunta ai campioni di siero di tre pazienti. Version / 6
7 17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Andersen, O. M. (2003): Essential Role of the Apolipoprotein E Receptor 2 in Sperm Development. In Journal of Biological Chemistry 278 (26), pp , checked on 10/03/ Fritz, K. S.; McKean, A. J.; Nelson, J. C.; Wilcox, R. B. (2008): Analog based free testosterone test results linked to total testosterone concentrations, not free testosterone concentrations. In Clin Chem 54 (3), pp Nieschlag, E. (2005): Entwicklungsstand der hormonellen männlichen Kontrazeption. In Deutsches Ärzteblatt Selby, C. (1990): Sex hormone binding globulin: origin, function and clinical significance. In Ann. Clin. Biochem 27 (Pt 6), pp Swerdloff, R. S.; Wang, C. (2008): Free testosterone measurement by the analog displacement direct assay: old concerns and new evidence. In Clin Chem 54 (3), pp Vermeulen, A.; Stoïca, T.; Verdonck, L. (1971): The apparent free testosterone concentration, an index of androgenicity. In J. Clin. Endocrinol. Metab 33 (5), pp Wheeler, M. J. (1995): The determination of bio available testosterone. In Ann. Clin. Biochem 32 (Pt 4), pp Winters, S. J.; Kelley, D. E.; Goodpaster, B. (1998): The analog free testosterone assay: are the results in men clinically useful? In Clin. Chem 44 (10), pp Version / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /
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