Epidemiologia e diagnosi dell influenza aviare in Italia

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Antonella Morelli
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1 Influenza aviare (H5N1) e influenza H1N1 Come protteggere me stesso, la mia famiglia e la collettività Azienda Ospedaliera L. Sacco Milano 5 Ottobre 2009 Epidemiologia e diagnosi dell influenza aviare in Italia Ana Moreno Martin Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia Romagna - Italy 1

2 Influenza aviare: una nuova emergenza? NON è una malattia nuova Segnalata da un veterinario Perroncito, nel 1878!!! Identificazione dell agente causale come un microrganismo filtrabile (1902 Centanni e Savonuzzi) A/Chicken/Brescia/1902 H7N7 Conosciuta ad inizio secolo scorso come peste lombarda (Hutyra & Marek) 2

3 Eziologia AIV Orthomyxoviridae Influenzavirus tipo A Sottotipi Haemagglutinin (16) Neuraminidase (9) NA HA Multiple combinazioni HA-NA 3

4 Specie ospiti dei virus influenzali Sensibilità ad H e N H7 H15 H16 4

5 Virus influenzali Affinità tra proteina H e sito recettoriale 2 tipi di recettori: SAα2,3Gal Virus aviari, equini SAα2,6Gal Virus umani, suini Specificità recettori - mutazioni aa nella HA L226, S228 SAα2,6Gal Q226, G228 SAα2,3Gal (Vilnes et al, J Virol, 1998) V135S, A138S >affinità SAα2,6Gal (Das et al, J Comput Chem, 2009) 5

6 Distribuzione dei recettori nei tessuti ospiti Uomo Recettori SAα2,6Gal - faringe, trachea, bronchi Recettori SAα2,3Gal bronchioli, alveoli Prove Istochimica (lectine): Sambucus nigra - SA α2,6 Gal (verde) Maackia amurensis- SA α2,3 Gal (rosso) Nature(2006), 440:

7 Distribuzione dei recettori nei tessuti ospiti Anatra Recettori SAα2,3Gal trachea, intestino, rene Recettori SAα2,6Gal - rene Pollo Recettori SAα2,6Gal trachea, rene Recettori SAα2,3Gal intestino J Mol Genet Med(2009) 3:

8 RESERVOIRS SPILLOVER DEAD-END hosts? GENE POOL Contesto Ecologico interconnessione tra ospiti serbatioi, spillover, aberranti 8

9 Ospite reservoir Anseriformi: anatre, oche, cigni Caradriiformi: gabbiani, rondini marine, trampolieri Mantiene l infezione Non contrae la malattia o solo in forma lieve Animali giovani Ciclo oro-fecale 9

10 Flussi migratori Flussi migratori di A.platyrhincos, A. querquedula in Eurasia ed Africa ed A. discors in America Aree di riproduzione Aree specie presenti tutto l anno Aree di ivernazzione 10 Science 312, 384 (2006)

11 Ospite spillover Pollame domestico Suscettibile all infezione se esposto Trasmette l infezione ad altri ospiti Non mantiene la disseminazione virale per lungo tempo Una malattia più grave dei reservoir Ciclo respiratorio 11

12 Ospite aberrante S infetta raramente di solito contrae una malattia grave ininfluenti nella epidemiologia della malattia, ma possono esserne gravemente colpiti Infezione H5N1: uomo, cane, gatto, tigre, leopardo 12

13 Influenza aviare:due malattie Distinte per: - Sintomatologia clinica indotta nei volatili - Caratteristiche degli stipiti virali: Influenza aviaria a bassa patogenicità (LPAI) Influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) H5, H7 13

14 Basi molecolari della patogenicità Virus a bassa patogenicità Virus ad alta patogenicità Possiedono un solo aminoacido basico nel sito di cleavage Es. sequenze aminoacidiche H7: -PEIPKGR*GLF-, -PENPKGR*GLF- Possiedono più aminoacidi basici nel sito di cleavage Es. sequenze aminoacidiche H7: -PEIPKKKKR*GLF-, - PETPKRKRKR*GLF-, -PEIPKKREKR*GLF-, - PETPKRRRR*GLF- 14

15 Patogenesi e patogenicità Fusione envelope con membrana cellula ospite Peptide di fusione dell emoagglutinina ALTA liberato da enzimi presenti in tutti i tessuti BASSA liberato da enzimi presenti solo in tessuti respiratori ed enterici Entrata virione nella cellula Replicazione Fuoriuscita del virione 15

16 Virus influenzali H5, H7 Uccelli acquatici selvatici: virus a bassa patogenicità Pollame domestico: adattamento dei virus influenzali HA addizione siti di glicosilazione NA delezione aminoacidi Virus H5 e H7: variazione della patogenicità (drift antigenico) Influenza aviaria a bassa virulenza (H5 e H7) LPAI Influenza aviaria ad alta virulenza (HPAI) 16

17 Disposizioni legislative DIR 2005/94/CEE Influenza aviaria - infezione del pollame o altri volatili causata da virus influenzale A: sottotipi H5, H7 IVPI > 1,2 nei pulcini di 6 sett Manuale OIE maggio 2005 Notifiable Avian Influenza Virus (NAI) HPAIV, tutti AIV H5 e H7 LPAIV tutti i virus non NAI 17

18 H7N1 LPAI 1999 (tacchini) 18

19 H7N1 HPAI (tacchini) 19

20 H7N1 HPAI (anatre) 20

21 Influenza aviare Italia 1998 H5N2 (HPAI) Veneto H5N9 (LPAI) Emilia Romagna H7N1 ca. 500 milioni Marzo - Dicembre LPAI focolai Dicembre 1999 Aprile HPAI focolai Agosto- Marzo LPAI focolai 21

22 Influenza aviare - Italia H7N3 (LPAI) ca.45 milioni Ottobre 2002 Settembre 2003: 388 focolai 15 settembre novembre 2004: 28 focolai 22

23 Influenza aviare - Italia 2005 H5N2 (LPAI) ca.1,8 milioni 12 aprile-10 maggio: 15 focolai Lombardia 23

24 Influenza aviare - Italia 2007 H7N3 (LPAI) Mag-Ott: 17 focolai H5N2 (LPAI): 1 focolaio Emilia Romagna 24

25 Influenza aviare - Italia 2009 H5N7 (LPAI) Apr- Mag: 4 focolai Veneto, Lombardia H7N3 (LPAI) Apr- 1 Sett: 4 focolai 22 H7 25

26 AIV in uccelli acquatici LPAI (H4N6) MALLARD BRESCIA PROVINCE 07/11/2005 LPAI (H10N7) MALLARD CREMONAPROVINCE 10/04/2006 LPAI (H11N9) MALLARD PAVIA PROVINCE 2005 LPAI (H5N1) MALLARD MODENA PROVINCE

27 Diagnosi 27

28 Ricerca antigene o genoma virale Immunofluorescenza: sensibilità bassa, specificità buona per influenza tipo A ELISA sandwich (per nucleoproteina tipo A) Kit immunoenzimatici Rt-PCR: real time tradizionale 28

29 Directigen Flu A BD TQ Anigen AIV Ag Animal Genetics Inc Sensibilità equivalente dei tre test C+ C- 5F10 Np-A ELISA 29

30 Ricerca genoma virale PCR Tradizionale gene M - Fouchier et al, J Clin Microbiol, Sapckman et al, J Clin Microbiol, 2002 H5, H7 - Diagnostic manual of avian influenza 2005/94/EC H9 - Slomka et al, Av Dis, 2007 Real time Diagnostic manual of avian influenza 2005/94/EC gene M, H5, H7 - Sapckman et al, J Clin Microbiol, 2002 H9 - Monne et al, J Clin Microbiol,

31 Diagnosi virologica ISOLAMENTO VIRALE Uova embrionate di pollo 9-11 gg via i.a. Colture cellulari (MDCK) Identificazione Tipo A Mab based sandwich ELISA (NPA) Sottotipo tipizzazione antigenica Emoagglutinina: HI Neuraminidasi: NI Mab based sandwich ELISAs H5, H7, N1-N9 31

32 Tipizzazione Hemagglutinina NEG H1N1 H4N6 H3N2 H1N2 H2N2 H7N7 H7N3 H7N1 H5N3 H5N1 H5N2 NEG H1N1 H4N6 H3N2 H1N2 H2N2 H7N7 H7N3 H7N1 H5N3 H5N1 H5N2 C - C + H5N2 NDV H10N4 H9N8 H9N2 H6N2 PMV4 PMV3 PMV2 NEG NEG PMV2 PMV3 PMV4 H6N2 H9N2 H9N8 H10N4 NDV H5N2 C + C - Elisa virologica sandwich H7 Mab 7A4 Elisa virologica sandwich H5 Mab 5D8 32

33 Tipizzazione Neuraminidasi H8N4 H1N1 H5N2 H6N2 H6N5 H7N3 H9N3 H5N1 N1 N2 N3 N4 N5 NpA(Ctrl+) H4N6 H9N8 H10N7 H11N9 H3N8 H13N6 NDV H7N7 N6 N7 N8 N9 NpA(Ctrl+) Mab platform sandwich ELISA 33

34 Diagnosi sierologica Ab verso Ag di gruppo (Tipo A): AGID ELISA ( indiretta o competitiva) Ab sottotipo specifici Anti-HA (16 H ): HI ELISA (H5 o H7) Anti-NA(9 N ): IF ELISA Proteine M1 e NP Antigeni profondi tipo-specifici Proteine HA e NA Antigeni superficiali sottotipo-specifici Heinen Vet Science Tomorrow,

35 Elisa sierologica H5, H7 H5N2 sieri positivi di campo H5N2 sieri positivi di campo H5 C+ H6/9 POS NEG H5 C+ H6/9 POS NEG H7N3 sieri positivi di campo H7N3 sieri positivi di campo H6/9 POS NEG H7 C+ H6/9 POS NEG H7 C+ Elisa competitiva H5 MAb 5D8/5D8Hrp Se= 100% (IC95%) Sp= 98.5%(IC95%) Elisa competitiva H7 Mab 7A4/7A4Hrp Se= 99.7%(IC95%) Sp= 100% (IC95%) 700 sieri pollo, tacchino : 200, H7, H5, 36 + H7/H 5 35

36 H7N1 H5N2 H7N3 100% 1404 sieri: 595 pollo, 717 tacchino, 75 anatra, 14 quaglia, 10 struzzi Moreno et al, Vaccine, % NEGATIVI H7N3 H9N2 H5N2 H1N1 H7N1 ELISA PER AC ANTI-N1 H7N3 ELISA % INIBIZI ONE SN SP N ,994 N2 75 0,976 0,995 N3 75 0,990 0,990 ELISA PER AC ANTI-N3 ELISA PER AC ANTI-N2 H7N1 H5N2 H7N3 100% H7N1 H5N2 H7N3 100% 100% NEGATIVI H7N1 H1N1 H5N2 H9N2 H7N3 H7N3 100% NEGATIVI H7N1 H1N1 H5N2 H9N2 H7N3 H7N3 36

37 Grazie per l attenzione Non fai ridere proprio per niente 37

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