LA RICERCA DI CAMPYLOBACTER NEGLI ALIMENTI, ISO :2006

Dimensione: px

Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "LA RICERCA DI CAMPYLOBACTER NEGLI ALIMENTI, ISO :2006"

Orsola Luciani
7 anni fa
Visualizzazioni

1 numero 3 dicembre 2007 LA RICERCA DI CAMPYLOBACTER NEGLI ALIMENTI, ISO :2006 Alcune specie di Campylobacter (C. jejuni, C. coli, e C. lari) sono frequentemente identificate come agenti causali di diarrea infettiva acuta nei paesi più sviluppati. Si tratta di infezioni causate dal consumo o dalla non corretta manipolazione di carne cruda o poco cotta, soprattutto di pollame, e di latte fresco contaminati. Per la ricerca di Campylobacter in alimenti è in vigore la normativa ISO :2006, che prevede una procedura piuttosto articolata per l arricchimento iniziale e l isolamento di Camylobacter. La metodica sintetizzata nelle pagine successive è arricchita da utili riferimenti ai materiali consigliati nella ISO :2006. Tutti i materiali sono anche richiamati nella tabella alla fine del testo. La metodica ISO :2006, per la ricerca di Campylobacter negli alimenti, prevede comunque tre fasi fondamentali: 1. Ricerca e isolamento 2. Conferma delle specie 3. Identificazione (facoltativa) 1. RICERCA E ISOLAMENTO DI CAMPYLOBACTER 1.1. Preparazione del campione Il campione va preparato omogeneizzando la matrice alimentare nel brodo di arricchimento Bolton Broth (codice 20296), in modo da ottenere un rapporto 1:10 tra matrice e brodo (massa/volume o volume/volume) Arricchimento L incubazione nel brodo di arricchimento richiede condizioni di microaerofilia (kit per microaerofilia codice ) e va eseguita in due fasi: prima a 37 C e poi a 41,5 C Isolamento La sospensione ottenuta va inoculata sulla superficie di due differenti terreni selettivi: - mccd agar (codice 20292). - terreno con diversa formulazione, es. Preston agar (codice 20297). All incubazione, ancora eseguita in microaerofilia a 41,5 C, segue l esame delle piastre alla ricerca delle colonie tipiche o sospette di Campylobacter. KAIROSafe review n. 3, dicembre /5

2 2. CONFERMA DELLE SPECIE DI CAMPYLOBACTER 2.1. Selezione delle colonie Da ognuna delle piastre incubate va prelevata almeno una delle colonie considerate sospette, e ulteriori quattro colonie se la prima risulta negativa Preparazione di colture pure Ogni colonia va strisciata su una piastra di Columbia Blood Agar (codice 20293) e incubata in microaerofilia a 41,5 C. Queste colture pure vanno utilizzate per le successive analisi: 2.3. esame di morfologia e motilità crescita in microaerofilia a 25 C crescita in aerobiosi a 41,5 C presenza di ossidasi Esame di morfologia e motilità Si tratta di sospendere una colonia in 1 ml di Brucella Broth (codice 20294) e di esaminare al microscopio, osservando morfologia e motilità Crescita a 25 C (microaerofilia) Si tratta di strisciare le colonie su una piastra di Columbia Blood Agar (codice 20293), di incubare in microaerofilia a 25 C e quindi di esaminare ricercando prova visibile della crescita di Campylobacter Crescita a 41,5 C (aerobiosi) Si tratta di strisciare le colonie su una piastra di Columbia Blood Agar (codice 20293), di incubare in microaerofilia a 41,5 C e quindi di esaminare cercando prova visibile della crescita di Campylobacter Presenza di ossidasi Da ogni piastra ottenuta al punto 2.2, si preleva una porzione di una colonia ben isolata e la si striscia su carta da filtro bagnata con il reagente per l ossidasi (codice 40560). La comparsa di un colore malva, viola o blu scuro indica la reazione positiva. Se si utilizza un kit pronto, bisogna seguire le indicazioni del produttore. Il risultato va confermato utilizzando controlli positivi e negativi. Esempi di ceppi di controllo: Pseudomonas aeruginosa NCTC (controllo positivo), Escherichia coli NCTC 9001 (controllo negativo). Interpretazione Specie di Campylobacter sono presenti se almeno una colonia presenta le seguenti caratteristiche: Morfologia Bacilli piccoli e curvi Motilità caratteristica Crescita a 25 C - Crescita a 41,5 C - Ossidasi + KAIROSafe review n. 3, dicembre /5

3 3. IDENTIFICAZIONE DI CAMPYLOBACTER (facoltativa) 3.1. Generale Tra le specie di Campylobacter che crescono a 41,5 C, quelle più frequentemente rilevate sono Campylobacter jejuni e Campylobacter coli. Altre specie sono state descritte: es. Campylobacter lari e Campylobacter upsaliensis. Le caratteristiche indicate nella tabella a pagina 4 permettono di distinguere le varie specie Rilevazione catalasi Per ognuna delle colonie selezionate al punto 2.2, si deposita un ansata di coltura in una goccia di perossido di idrogeno 3% vol. (test catalasi codice 88597). Se entro 30 secondi compaiono delle bollicine il test è positivo. Il risultato va confermato utilizzando controlli positivi e negativi. Esempi di ceppi di controllo: Staphylococcus aureus NCTC 8532 (controllo positivo), Enterococcus faecalis NCTC 775 (controllo negativo) Rilevazione di sensibilità a cefalotina e acido nalidixico Per ognuna delle colonie selezionate al punto 2.2, si prepara una sospensione in Brucella Broth di densità 0,5 McFarland. La sospensione va diluita 1/10 con il medesimo brodo e versata sulla superficie di una piastra di Mueller Hinton 5% Blood Agar (codice 20295). Si lascia in contatto per 5 minuti e quindi si elimina l eccesso di sospensione. Le piastre devono poi essere asciugate a 37 C. A questo punto sulla superficie dell agar si depositano un disco impregnato di acido nalidixico (codice NA) e uno di cefalotina (codice KF). Le piastre vanno incubate a 37 C in atmosfera microaerofila. Interpretazione: crescite in prossimità del disco sono classificate come resistenti la presenza di una zona di inibizione di qualunque dimensione è classificata come sensibile Rilevazione dell idrolisi dell ippurato Per ognuna delle colonie selezionate al punto 2.2, si preleva un ansata densa e si prepara una sospensione in una provetta da emolisi (13x75mm) contenente una soluzione di sodio ippurato (codice 53275). Si mescola e si incuba a 37 C. Sulla superficie della soluzione di sodio ippurato va addizionata una soluzione di ninidrina (codice ), senza mescolare. L incubazione procede ancora a 37 C. Un colore viola scuro indica la reazione positiva. Un colore viola pallido o un colore inalterato indicano la reazione negativa. Il risultato va confermato utilizzando controlli positivi e negativi. Esempi di ceppi di controllo: Campylobacter jejuni NCTC (controllo positivo), Campylobacter coli NCTC (controllo negativo) Rilevazione dell idrolisi dell indoxil acetato Si tratta di prelevare una delle colonie selezionate al punto 2.2 e di strisciarla su un disco di indoxil acetato (codice 04739), aggiungendo poi una goccia di acqua sterile distillata. Se l indoxil acetato è idrolizzato compare un colore al blu scuro. Il risultato va confermato utilizzando controlli positivi e negativi. Esempi di ceppi di controllo: Campylobacter jejuni NCTC (controllo positivo), Campylobacter lari NCTC (controllo negativo). KAIROSafe review n. 3, dicembre /5

4 Interpretazione Le specie di Campylobacter che crescono a 41,5 C possono essere identificate a livello di specie seguendo la tabella seguente: Caratteristiche C. jejuni C. coli C. lari C. upsaliensis Catalasi o poco Acido nalidixico S a S a R/S b S Cefalotina R R R S Idrolisi ippurato Idrolisi acetato =positivo, -=negativo, S=sensibile, R=resistente a= è stato evidenziato un aumento della resistenza alacido nalidixico in C. jejuni e C. coli b=esistono sia ceppi resistenti che sensibili Terreni di coltura e reagenti ISO :2006, tutti i prodotti nel catalogo Kairosafe Terreni di coltura e reagenti Codice Descrizione Formato Bolton Broth, Campylobacter Enrichment Broth 1 flacone 225 ml mccd Agar Camplobacter 20 piastre 90 mm Preston Agar Campylobacter 20 piastre 90 mm Columbia Blood Agar Campylobacter 20 piastre 90 mm Brucella Broth 10 provette 10 ml Mueller Hinton 5% Blood Agar 20 piastre 90 mm Reagenti Kit per microaerofilia 20 buste Strip ossidasi 100 strip Test catalasi 100 ml Sodio ippurato (PBS non incluso) 500 g Ninidrina (acetone e butanolo non inclusi) 25 g Strip Indoxyl Acetato 100 strip NA Dischi Acido Nalidixico 50 dischi KF Dischi Cefalotina 50 dischi KAIROSafe review n. 3, dicembre /5

5 Ceppi microbici di controllo ISO :2006, tutti i prodotti nel catalogo Kairosafe Ceppi di controllo Codice Ceppo liofilizzato NCTC ATCC * Confezione 1 MS-P028 Pseudomonas aeruginosa Microswabs MS-E023 Escherichia coli Microswabs MS-S037 Staphylococcus aureus Microswabs MS-E014 Enterococcus faecalis Microswabs MS-C002 Campylobacter jejuni Microswabs MS-C050 Campylobacter coli Microswabs 1 MicroSwabs: Sistema costituito da una provetta di plastica con tappo a serbatoio a cui è applicato un tampone ovattato. Il pellet di microrganismi si trova sul fondo della provetta mentre il liquido di ricostituzione è all'interno del tappo/serbatoio e viene fatto defluire con un semplice movimento. Il tampone permette lo striscio diretto sui terreni in piastra. Il pellet contiene un minimo di 1000 UFC. * The ATCC Licensed Derivative emblem, the ATCC Licensed Derivative word mark and the ATCC catalog marks are trademarks of ATCC used under license. Kairosafe is licensed to use these trademarks and to sell licensed products manufactured for Mecconti using ATCC materials derived from ATCC cultures. Look for the ATCC Licensed Derivative emblem for products derived from ATCC cultures. Per informazioni e richieste: KAIROSafe S.r.l. Sistiana, 41/D Duino Aurisina (TS) Tel/fax: info@kairosafe.it web: KAIROSafe review n. 3, dicembre /5

Documenti analoghi

ANALISI MICROBIOLOGICHE DELLE ACQUE PER USO UMANO Ricerca di Pseudomonas aeruginosa

numero 12 maggio 2009 ANALISI MICROBIOLOGICHE DELLE ACQUE PER USO UMANO Ricerca di Pseudomonas aeruginosa Microrganismo con elevata capacità di adattamento, Pesudomonas aeruginosa è pressoché ubiquitario