Esercitazione di. Biotecnologie Genetiche Agrarie. Mappe genetiche

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1 Esercitazione di Biotecnologie Genetiche Agrarie Mappe genetiche

2 Mappa con marcatori morfologici (sinistra) e mappa con marcatori molecolari RFLP e SSR (destra) del cromosoma 1 di mais

3 Produzione di una mappa genetica La produzione di un mappa genetica passa attraverso tre fasi: 1. Calcolo della distanza tra tutte le coppie di loci (geni o marcatori) e valutazione della presenza di associazione. 2. Suddivisione dei loci in gruppi di associazione (anche detti di concatenazione). 3. Ordinamento dei loci all interno di ciascun gruppo di associazione.

4 Calcolo delle distanze tra coppie di loci La determinazione della distanza di mappa tra due loci inizia con il calcolo della frequenza di ricombinazione (FR) tra i loci stessi. FR = proporzione di gameti ricombinanti sul totale dei gameti analizzati associazione 0 FR 0,5 indipendenza In semplici popolazioni sperimentali (prima generazione di reincrocio o BC1 ed aploidi raddoppiati) i gameti ricombinanti sono riconoscibili dal genotipo degli individui. In altre situazioni (es. popolazioni F2) la proporzione dei gameti ricombinanti deve essere stimata con metodi più complessi.

5 A Parentali x a Esempio di calcolo della FR tra due loci, A e B, nella prima generazione di reincrocio B b F1 Parentale n.di gametiricombinanti FR = n.totalegameti = Meiosi e crossing-over Ab+ ab = n.totalegameti individuiab/ab+ ab/ab n.totaleindividui Gameti dall F1 Gameti dal parentale ab AB Ab ab ab AaBb Aabb aabb aabb BC1

6 A Parentali x a Esempio di calcolo della FR tra due loci, A e B, in una F2 B b Meiosi e crossing-over F1 Gameti dall F1 n.di gametiricombinan FR = = n. totalegameti Ab+ ab = n. totalegameti AB Ab ab ab ricombinanti? n. totaleindividuix 2 Individui con due cromosomi ricombinanti non distinguibili da non-ricombinanti AB AABB AABb AaBB AaBb Ab AABb AAbb AaBb Aabb ab AaBB AaBb aabb aabb ab AaBb Aabb aabb aabb

7 Valutazione della presenza di associazione: 1. Metodo del test del χ 2 Es.: popolazione BC1 Classe fenotipica N. osservati N. attesi (E-O) 2 /E AaBb ,36 Aabb ,64 aabb ,64 aabb ,96 Totali ,60 Il valore calcolato del χ 2, 67,6 è molto maggiore del valore critico della distribuzione per 3 gradi di libertà (7,81 per P = 0.05), quindi possiamo rigettare l ipotesi di non associazione: i loci A e B sono associati, ad una FR di 0,1 (10%).

8 Funzione di mappa Le distanze tra loci espresse sulla base della FR non sono addittive, in quanto non sono in grado di tenere conto dei doppi crossover. Alcune possibili progenie di popolazione BC1 (solo un cromosoma) A D B Questi ricombinanti sfuggono al conteggio quando si considera la distanza A-B, ma vengono considerati per A-D e B-D. Una funzione di mappa è una funzione matematica che tenta di predire il numero effettivo di crossover tra due loci a partire dal valore di FR. Per una previsione del numero effettivo dei crossover tra due loci occorre fare delle assunzioni sul livello di interferenza (= i = misura dell indipendenza di un crossing-over rispetto ad un altro). La funzione di Haldane assume totale indipendenza degli eventi di crossover (i = 0), la funzione di Kosambi assume un livello di interferenza intermedio, (i = 1-2FR), proporzionale ad FR. ln(1-2fr) FR cm (Haldane) = - cm(kosambi) = ln FR Le distanze tra loci basate sul numero di crossover sono maggiormente addittive e sono riportate sulla mappa come unità di mappa o centimorgan (cm).

9 Funzioni di mappa 2.5 Distanza di mappa (Morgan) Haldane Kosambi FR Frequenza di ricombinazione Si noti che per distanze inferiori ai 10 cm le differenze tra i risultati ottenuti con le diverse funzioni di mappa (o direttamente FR) sono minime.

10 Ordinamento di 3 loci (incrocio a tre punti) Parentali A B x F1 a b Parentale Aggiungiamo un terzo locus (D). dove mappa? Meiosi e crossing-over Gameti dall F1 Gameti dal parentale

11 Ordinamento di 3 loci (incrocio a tre punti) Ipotizziamo di seguire la segregazione di tre loci di cui non conosciamo l ordine, in un reincrocio di un individuo F1 ABD/abd con l omozigote recessivo abd/abd. Genotipo N. oss. ABD 40 ABd 0 AbD 4 Abd 7 abd 4 abd 3 abd 1 abd 41 Genotipo indicato con il vero ordine FR (A-B) = ( )/100 = 0.18 FR (A-D) = ( )/100 = 0.12 FR (B-D) = ( )/100 = 0.08 Dato che B e D sono i più vicini e A è più vicino a D, l ordine suggerito dai dati delle distanze FR a coppie è: A D B. Inoltre, l ordine più probabile è quello che minimizza il numero di doppi ricombinanti che è necessario prevedere per spiegare i dati (non mostrato, fare per esercizio). Ordine e distanze: A 0.12 D 0.08 B 0.18 Notare che A-D + D-B > A-B, perché?

12 Ordinamento dei loci all interno di un gruppo di associazione L ordinamento di molti loci all interno di un gruppo di associazione richiede l utilizzo di procedure ed algoritmi avanzati. In generale il compito è quello di arrangiare linearmente i loci in modo che le distanze risultanti sulla mappa siano il più possibile in accordo con i dati, già a disposizione, sulle distanze tra le singole coppie di loci. Le principali strategie utilizzate sono due: a) La minimizzazione del numero di crossover che si accettano definendo uno specifico ordine di loci (strategia utilizzata dal programma MapMaker) b) La minimizzazione delle differenze tra le distanze genetiche calcolate confrontando le singole distanze a coppie con le distanze misurate, per le stesse coppie, sulla mappa finale (strategia utilizzata dal programma JoinMap)

13 Perché costruire una mappa genetica La disponibilità di una mappa genetica: 1. funge da punto di partenza per l isolamento di geni di interesse tramite procedure di clonaggio posizionale; 2. consente di ottimizzare la scelta di marcatori per lo svolgimento di procedure di selezione assistita da marcatori molecolari; 3. consente l identificazione di regioni cromosomiche sede di loci che controllano i caratteri quantitativi (QTL: Quantitative Trait Loci); 4. facilita il trasferimento di informazione tra specie sfruttando le relazioni di sintenia tra le mappe genetiche.

14 Esempio di profilo AFLP su popolazione di mappa in mais Primer combination: PstGA/MseCGG Popolazione: F 2 (67 piante) dall incrocio delle linee pure di mais Lo964 (P1) x Lo1016 (P2) P1 P2

15 Esempio di file che raccoglie i dati genotipici, da utilizzarsi per il calcolo di una mappa di linkage tramite il software JoinMap.