L antibiogramm Inutile,necessar ed indispensabile

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1 Per la terapia DOSSIER MASTITI di una mastite in atto il ricorso a tale test L antibiogramm Inutile,necessar ed indispensabile riveste scarsa importanza. Ma fornisce preziosissime informazioni per le cure che bisognerà realizzare in futuro Metodo Kirby-Bauer: dischetti contenenti antibiotici e crescita batterica Metodo Kirby-Bauer: terreno addizionato di globuli rossi per Streptococchi di G. BOLZONI - G.A. POSANTE Gli autori sono del Centro di Referenza Nazionale Qualità Latte Bovino, Istituto Zooprofilattico della Lombardia e dell Emilia Romagna, Brescia Tra i principali obbiettivi dell allevamento della vacca da latte, dal punto di vista sanitario, vi è sicuramente quello di ridurre i casi di mastite ad un livello accettabile, fisiologico o comunque economicamente sopportabile, attraverso idonei interventi di profilassi. L ottenimento di questo obbiettivo passa anche attraverso la realizzazione di idonei ed efficaci interventi terapeutici sulle forme di mastite; sia quale cura della malattia in atto, sia quale prevenzione indiretta delle potenziali patologie future. L esempio più eclatante di quest ultimo aspetto di terapiaprofilassi è, del resto, il trattamento delle bovine alla messa in asciutta. Malgrado sia sempre ed assolutamente vero che prevenire è meglio che curare, il ricorso ai farmaci ad azione antibiotica, continua ad essere un elemento cardine nella terapia della mastite. Pur considerando i molteplici aspetti problematici (costi elevati, sviluppo di farmacoresistenza, pericolo di residui, variabilità delle percentuali di guarigione, solo per citarne alcuni) sono infatti più che evidenti i risultati che questa classe di farmaci ha consentito di ottenere nella zootecnia moderna. In quest ambito, il principale supporto che il laboratorio può fornire ad allevatori e veterinari per le decisioni gestionali e mediche è tradizionalmente legato all esame batteriologico del latte per la diagnosi eziologica della mastite, ed all antibiogramma per le scelte di terapia. Sull utilizzo pratico dei risultati dell antibiogramma e- sistono però alcuni aspetti controversi che possono generare incomprensioni e false aspettative tra gli addetti ai lavori e che, pertanto, sembra utile analizzare e chiarire a scopo informativo. Con il termine antibiogramma si identifica, in generale, un test di laboratorio in grado di valutare l efficacia di uno o più principi attivi farmacologici nei confronti di una specie o ceppo batterico (che di solito è stato isolato da un campione di materiale biologico e, nel caso specifico, da un campione di secreto mammario). Il risultato dell antibiogramma è, quindi, una misura della capacità di un antibiotico di contrastare un determinato ceppo batterico. L aspetto teorico della questione è quindi semplice, ma nella pratica le cose sono invece decisamente complesse, o meglio, è necessario tener presente una serie, purtroppo piuttosto grande e complessa, di fattori senza i quali le affermazioni precedenti perdono gran parte del loro valore. Questi fattori possono essere schematicamente divisi in due gruppi principali: quelli collegati alla diagnosi eziologica della mastite ed alle relative problematiche di interpretazione del significato patologico degli isolamenti batterici ottenuti che, seppur fondamentali, esulano dalla presente trattazione; quelli direttamente collegati al rapporto tra il risultato dell antibiogramma ed il suo utilizzo pratico in allevamento. SCOPO DEL TEST Abbiamo affermato che per definizione, l antibiogramma serve a dare informazioni circa i principi attivi (e quindi i farmaci disponibili sul mercato) idonei a trattare u- na forma di mastite in atto. Se però consideriamo i tempi minimi necessari ad ottenere l esito analitico dal laboratorio (almeno ore, nei casi ottimali, fino a superare i 4-6 giorni nei più complessi) appare evidente che, nella stragrande maggioranza dei casi, ciò non rispecchia pie- 60 IZETA n. 10 / 2005

2 a? io namente la realtà. L intervento terapeutico nei confronti della mastite è, infatti, tanto più efficace quanto più precoce rispetto all insorgenza e ciò è particolarmente vero per le forme acute, quali quelle sostenute da Enterobatteri. Fatte salve le ovvie eccezioni, per esempio le mastiti croniche, nella maggior parte dei casi è quindi fondamentale i- niziare la terapia nelle prime 24 ore, meglio ancora nelle prime 4-6 ore. Molto spesso dunque, l esito dell antibiogramma serve, di fatto, a confermare o a contraddire una scelta terapeutica già fatta. Tale informazione è però, a questo punto, già disponibile all allevatore in quanto fornita dall avvenuta o mancata guarigione della bovina. Sembra dunque più realistico affermare che, nella maggioranza dei casi, lo scopo dell antibiogramma non è tanto quello di indirizzare la terapia di una mastite in atto, quanto invece di fornire informazioni per la terapia delle mastiti che si presenteranno in futuro nel medesimo allevamento e con sintomatologia clinica simile. In quest ottica l antibiogramma serve dunque principalmente a raccogliere nel tempo, dati utili per comprendere se il principio attivo utilizzato in allevamento mantiene la sua efficacia o la perde nel tempo; quando è opportuno cambiare il prodotto e quale altro farmaco utilizzare; con quale prodotto intervenire, precocemente, in determinate forme di mastite in un allevamento. Tali considerazioni si adattano perfettamente alle mastiti contagiose, mentre per quelle ambientali il discorso andrebbe completato da alcune ulteriori precisazioni troppo complesse e fuori tema in questa sede. L antibiogramma viene di norma eseguito secondo due metodiche analitiche principali: determinazione della M.I.C. (Minima Concentrazione Inibente); metodo Kirby-Bauer in piastra. METODI DI ESECUZIONE Determinazione della M.I.C. (Minima Concentrazione Inibente). Quantità fisse del batterio in esame sono poste a contatto, in provetta, con diluizioni scalari del principio attivo farmacologico. La maggior diluizione di antibiotico in grado di impedire la crescita del germe è definita M.I.C. Rappresenta la metodica di elezione, ma purtroppo la sua applicazione pratica è limitata dal fatto che è decisamente dispendiosa ed impegnativa per il laboratorio (problema solo parzialmente migliorabile con la tecnica in micrometodo). Metodo Kirby-Bauer in piastra. La coltura batterica ottenuta in brodo di crescita è seminata in quantità più o meno costante, su specifici terreni di coltura, insieme a dischetti di carta contenenti quantità predefinite di antibiotico. La mancata crescita del batterio attorno al dischetto contenente, ad esempio, la penicillina si evidenzia come alone di inibizione e la sua misurazione indicherà se il ceppo in esame è da considerare sensibile o resistente ai farmaci contenenti penicillina. Diluizione diretta del latte. Il latte mastitico è diluito direttamente in reagenti per la crescita batterica e dopo un incubazione di 1-6 ore, viene distribuito in micropiastre contenenti diluizioni scalari di antibiotici. L avvenuta o mancata crescita del batterio viene valutata attraverso il viraggio di colore del terreno. Riduce fortemente i tempi ed i costi di e- secuzione, ma fornisce esiti che non sono sempre e sicuramente attribuibili al batterio responsabile della mastite (che non è né isolato, né identificato, ma semplicemente coltivato insieme al latte mastitico e quindi ad eventuali batteri contaminanti). Diluizione in Agar. Le colture batteriche in quantità più o meno definite, vengono seminate in piastre di terreno colturale contenenti diluizioni scalari dell antibiotico. È forse il metodo più preciso, ma è ulteriormente impegnativo e costoso nell esecuzione anche rispetto al metodo M.I.C. Determinazione della M.B.C. (Minima Concentrazione Battericida). Quantità fisse del battere in esame sono seminate in brodi contenenti diluizioni scalari di antibiotico, successivamente il brodo di coltura è ripetutamente seminato in piastra, ad intervalli di tempo predefiniti con valutazione finale della concentrazione in grado di determinare una riduzione standard (3 Log) della quantità di batteri vitali. Comporta un ulteriore allungamento dei tempi di analisi, dell impegno del laboratorio e di crescita dei costi (ulteriormente incrementati se si deve valutare cinetica batterica, per una relazione tempo/quantità batteri vitali). G.B. - A.P. METODO DI ESECUZIONE La differenza sostanziale sta nel fatto che la prima fornisce una valutazione di tipo quantitativo, mentre la seconda indica un esito di tipo qualitativo, tradizionalmente espresso con le diciture: Resistente, Intermedio, Sensibile. La prima metodica garantirebbe, in teoria, risultati confrontabili con quelli delle concentrazioni antibiotiche ottenibili in vivo e quindi consentirebbe la scelta del principio attivo più efficace. In pratica, i dati disponibili sulla farmacodinamica di prodotti antibiotici in bovine da latte in mastite a cui fare riferimento, sono estremamente limitati (vedi oltre). Essa i- noltre risulta decisamente più impegnativa e costosa da realizzare; è soprattutto per questi motivi che nella maggior parte dei laboratori di servizio, l antibiogramma viene e- seguito con il secondo metodo. Esistono altre metodiche, più o meno precise o difficili da realizzare o impegnative e dispendiose che possono essere utilizzate in funzione di differenti finalità (vedi box). In generale, possiamo comunque dire che nell ambito della ricerca (ad esempio per la sorveglianza dello sviluppo delle farmacoresistenze nei batteri patogeni per l uomo) si privilegiano metodi più complessi e, tendenzialmente, più precisi, mentre per le attività routinarie si devono accettare delle scelte di compromesso in funzione delle e- sigenze di esiti rapidi, analisi semplici e poco costose. L esistenza di differenti metodiche genera comunque un secondo tipo di difficoltà: gli esiti forniti non sono infatti sempre confrontabili tra di loro e, di conseguenza, risulta difficile aggregare l enorme massa di dati ottenibili dall attività dei diversi laboratori operanti sul territorio per trarre informazioni generali e diffondibili a livello nazionale o internazionale, utili a chi opera in campo. VALIDAZIONE DEI RISULTATI Altra fonte di difficoltà è il fatto che risulta davvero difficile dare un giudizio sulla accuratezza del risultato di un antibiogramma, indipendentemente dalla metodica utilizzata. In teoria per poter dare indicazioni terapeutiche scientificamente rigorose e IZETA n. 10 /

3 DOSSIER MASTITI QUALE ANTIBIOTICO A complicare ulteriormente quanto detto al punto precedente, vi è poi il fatto che la composizione dei farmaci (eccipienti, veicolo, associazioni con altri antibiotici o altre sostanze terapeutiche quali ancomplete, si dovrebbe disporre, in ogni singolo caso di mastite, del risultato di antibiogrammi espressi come M.I.C., delle caratteristiche di farmacodinamica del principio attivo nei diversi prodotti farmaceutici che lo contengono, derivate da studi eseguiti su bovine in lattazione ed in mastite e non soltanto in animali da laboratorio, ed infine, della casistica relativa a prove sperimentali eseguite in campo in modo standardizzato che esprima le percentuali di guarigione osservate. Solo in questo modo potremmo validare il risultato dell antibiogramma, cioè dare a tale risultato un sorta di misura della sua correttezza rispetto all utilizzo pratico del farmaco da esso consigliato. È quasi superfluo dire che la stragrande maggioranza delle informazioni di cui sopra non sono, attualmente, disponibili. I dati relativi alla farmacodinamica, ad esempio, quand anche disponibili per la bovina, riguardano quasi sempre bovine sane e somministrazioni per via parenterale, mentre è meno frequente che si disponga di dati relativi alla somministrazione intramammaria in corso di mastite. ATTENDIBILITÀ La relazione tra risultati in vitro e la situazione in vivo costituisce forse il problema più importante in quanto contiene, in modo più o meno diretto, tutti gli altri finora citati. Il confronto tra una coltura batterica ed una sostanza ad azione antibiotica realizzato nelle condizioni di laboratorio è, ovviamente, sostanzialmente diverso da quello che si realizza all interno di una ghiandola mammaria nel corso di un processo infiammatorio. Nella mammella, ad e- sempio, l azione degli antibiotici può esaltare e potenziare la risposta difensiva immunitaria della bovina, ma in altri casi la può deprimere per effetto negativo sulle capacità fagocitanti delle cellule; oppure vi possono essere, nella mammella mastitica, sostanze naturali che interagiscono con le molecole antibiotiche. La diffusione dell antibiotico inoltre, nella piastra o nella provetta, è costante e definita, mentre in mammella può essere ostacolata, in misura non costante, da particolari condizioni fisiche (presenza di essudato purulento, formazioni fibrose ascessuali, detriti cellulari e frustoli di fibrina) o chimiche (acidità, e- lettroliti). Dobbiamo poi ricordare che, nella stragrande maggioranza dei casi, non si hanno informazioni di ritorno, complete dal punto di vista scientifico, sulla corrispondenza tra i risultati forniti dalle prove di laboratorio ed il riscontro pratico di campo (guarigione o mancata guarigione) e ciò dipende da numerosi problemi di ordine pratico ed organizzativo che sarebbe davvero troppo lungo elencare ed analizzare, ma che sono ben noti agli addetti ai lavori. Le sperimentazioni finora realizzate in quest ambito, rappresentano sicuramente, in prospettiva, la parziale soluzione a questi problemi, ma sono davvero limitate se confrontate con l utilizzo complessivo dei farmaci antimastite. Metodo Kirby-Bauer: fasi di esecuzione della prova tiinfiammatori o antiistaminici), non può essere simulata nelle prove di laboratorio in cui si testa, di fatto, il solo principio attivo antibiotico, senza poter tener conto degli aspetti, di norma migliorativi e potenzianti, legati alle altre componenti del prodotto. In secondo luogo il laboratorio deve, necessariamente, operare una selezione rispetto ai principi attivi, non potendo testare i ceppi batterici nei confronti di tutti i possibili prodotti farmaceutici disponibili sul mercato. In genere quindi si utilizzano molecole considerate capofila per ciascuna classe di antibiotici, dando per scontato che il risultato sia estensibile a tutti i principi attivi di quella classe. Questo tipo di compromessi assume maggior rilevanza se si pensa al diffondersi di prodotti contenenti associazioni di più antibiotici; in questi casi non è sempre possibile riprodurre in laboratorio l effetto combinato dei differenti antibiotici e quindi la correlazione tra esito analitico e risultato dell intervento terapeutico può risultare particolarmente debole. Un cenno meritano anche i problemi relativi ai valori di M.I.C., ai dati di farmacodinamica e alla disponibilità di studi di campo per i germi mastitogeni. Pur non essendo in genere direttamente percepiti dagli addetti ai lavori, essi rappresentano comunque rilevanti condizionamenti per le possibilità di utilizzo pratico ed efficace degli esiti a- nalitici forniti dal laboratorio. Gli studi sperimentali sulla farmacodinamica delle singole molecole ad azione antibiotica e la definizione delle M.I.C. nelle condizioni di campo sono, per ovvie questioni economiche, perlopiù dedicate alla medicina umana ed ai batteri patogeni per l uomo. In campo veterinario le prove sperimentali si eseguono perlopiù su animali da laboratorio oppure, nel settore bovino, su animali sani. In definitiva sono pochi i dati a disposizione per farmaci antimastite provati in condizione di mastite (a diversi dosaggi, per diversi tempi di trattamento o vie di somministrazione, e così via). In conclusione ed in stretta sintesi, le informazioni mancanti per un utilizzo pratico, corretto, completo, scientificamente inoppugnabile, dei risultati delle prove di antibiogramma sono allo stato attuale moltissime ed il lavoro sperimentale da realizzare, quindi, ancora enorme. A titolo di esempio, si può accennare al fatto che, 62 IZETA n. 10 / 2005

4 MASTITE CLINICA, COSA FARE In presenza di mastite clinica o di sospetto occorre: prelevare sempre un campione di latte di quarto, secondo le modalità previste per gli esami batteriologici (prelievo sterile) prima di eseguire qualunque trattamento farmacologico; a seconda dei casi, congelare il campione, oppure inviarlo al laboratorio per la diagnosi ed il test dell antibiogramma; iniziare al più presto un intervento terapeutico (endomammario e/o parenterale) secondo le modalità e con i prodotti usualmente utilizzati in azienda, in funzione del tipo di sintomatologia clinica; valutare clinicamente l andamento della malattia. A) In caso di guarigione: Il campione inviato al laboratorio ed il relativo antibiogramma serviranno come informazioni per ampliare l archivio dell allevamento e realizzare una sorveglianza sull insorgere di farmacoresistenze. Il campione congelato potrà essere eliminato oppure insieme ad altri inviato periodicamente al laboratorio per valutazioni complessive sulla frequenza degli agenti mastitogeni e per la sorveglianza sulle farmacoresistenze. B) In caso di mancata guarigione: Il campione inviato al laboratorio potrà fornire un indicazione specifica sul tipo di farmaco da utilizzare quale ulteriore tentativo terapeutico e, comunque, servire per futuri casi di mastite della medesima tipologia. Il campione congelato deve essere al più presto inviato al laboratorio allo scopo di ottenere le informazioni necessarie ad instaurare una terapia alternativa. G.B. - A.P. quand anche disponibili, i dati delle M.I.C. o degli aloni di inibizione del metodo Kirby- Bauer, pur avendo carattere quantitativo, non sono direttamente utilizzabili come indicatori di efficienza (alone più grande uguale attività terapeutica maggiore). Non è possibile quindi fare una classifica del farmaco più potente o semplicemente più adatto sulla base di questi dati. LIMITI E PREGI L insieme dei problemi accennati nei punti precedenti è più che sufficiente per mostrare l importanza dei limiti e dei condizionamenti con cui ci si deve confrontare. Per completezza, a questi dovremmo aggiungere, solo per fare degli esempi: le problematiche di ripetibilità e riproducibilità di una qualsiasi metodica analitica (quindi anche degli antibiogrammi e- seguiti da operatori diversi o in laboratori diversi). Concludere quindi, che per la terapia della mastite il ricorso all antibiogramma, indipendentemente dalla metodica u- tilizzata, sia sostanzialmente inutile sembra, a questo punto, quasi ovvio. Per fortuna non è questa la conclusione obbligata. È, infatti, altrettanto corretto affermare che l antibiogramma può essere, a seconda delle finalità e degli ambiti applicativi per cui è eseguito, un utilissimo supporto sia per le decisioni terapeutiche in allevamento che per le attività di ricerca scientifica (epidemiologiche, farmacologiche, diagnostiche). Da quest ultimo punto di vista il ricorso a test di validazione per l efficacia dei principi attivi è assolutamente indispensabile e deve essere realizzato con i mezzi tecnici a disposizione, per limitati che siano. Di fatto ciò che appare ancora inadeguato allo scopo, è la mancanza di prove standardizzate, e quindi confrontabili, che fornisca in modo sistematico l efficacia dei 64 IZETA n. 10 / 2005

5 differenti principi attivi, e delle loro associazioni, per lunghi periodi di tempo. Ma aldilà di questo, il risultato dell antibiogramma assume comunque una valenza positiva anche se rimaniamo nell ambito dei problemi pratici, sanitari, del singolo allevamento. Il problema deve essere analizzato sulla base di una valutazione costo-beneficio e, soprattutto, in relazione alle condi- L'antizioni tipiche di ciascun allevamento interessato. In breve, si può dire che soltanto in pochi casi l esito dell antibiogramma costituisce un valido supporto per la terapia della mastite in atto (come accennato prima, fondamentalmente per un problema di tempi, irrisolvibile). Nella stragrande maggioranza dei casi, però, l esito dell antibiogramma può essere archiviato così da costituire u- na fonte di informazioni relativamente allo sviluppo di farmacoresistenze di determinati microrganismi nello specifico allevamento in questione. È fatto notorio che, spesso, un prodotto utilizzato in un allevamento funzioni molto bene (cioè fornisca una buona percentuale di guarigione nei casi di mastite trattati) per un certo periodo, ma che, con l andar del tempo, possano cominciare a comparire mancate guarigioni o recidive, attribuibili allo sviluppo di ceppi batterici farmacoresistenti caratteristici di quell allevamento. L antibiogramma inutile o quasi per curare la mastite in atto, diventa in quest ottica utile se non addirittura indispensabile, per scegliere il biogramma è indispensabile per tenere sotto controllo nel tempo l efficacia delle scelte terapeutiche prodotto terapeutico, da lattazione o da asciutta, più a- datto ed efficace per quell allevamento e per quel tipo di mastite e soprattutto per tenere sotto controllo nel tempo l efficacia delle scelte terapeutiche. È probabilmente questa la forma più corretta per valutare questo ausilio laboratoristico dal punto di vista del veterinario pratico e dell allevatore. UN SEMPLICE CONSIGLIO Tralasciando la soluzione dei numerosi e complessi problemi tecnicoscientifici evidenziati in precedenza, che richiedono evidentemente studi e valutazioni da esperti, è possibile tentare di schematizzare una sorta di linea guida comportamentale per la gestione del problema antibiogramma che possa rappresentare un compromesso tra le difficoltà ed i limiti suddetti da u- na parte, e le esigenze pratiche di veterinari ed allevatori dall altra (vedi box). Questo schema dovrà, ovviamente, essere modulato in funzione della situazione specifica di ciascuna realtà aziendale (per esempio, nei casi di forme di mastite contagiosa), ma da un punto di vista generale è possibile concludere che malgrado tutti i limiti accennati, è comunque evidente che, per la gestione sanitaria della stalla, le informazioni fornite dall esame batteriologico e dall antibiogramma costituiscono elementi utili, a volte anche per i casi patologici in atto, ma sicuramente sempre per affrontare in modo efficace quelli futuri. 66 IZETA n. 10 / 2005

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