Rotaviruses in Buffaloes. Prof G. Iovane Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno

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1 Rotaviruses in Buffaloes Prof G. Iovane Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno

2 Introduzione I Rotavirus appartengono alla famiglia delle Reoviridae RNAds s sono così denominati perché il virione completo ricorda l immagine di una ruota sono responsabili di diarree neonatali in numerose specie animali, uomo compreso negli animali la diarrea neonatale da Rotavirus si osserva entro i primi 15 giorni di vita

3 Stima della ripartizione dei 800,000 decessi per infezioni da rotavirus per anno

4 Aetiology of neonatal diarrhoea in calves Rotavirus 27,6% Coronavirus 9,6% Cryptosporidium 22.9% Coccidiosis 7,3% Salmonella spp 4,8% No diagnosis 31,7%

5 Eziologia I Rotavirus maturi non hanno envelope presentano un core a simmetria icosaedrica un capside costituito da due strati

6 Spettro d ospite d in vivo L isolamento dei Rotavirus è ottenibile, oltre che nell uomo, in numerose specie animali, sia domestiche sia selvatiche Caratteristica interessante dei Rotavirus è che essi non sono specie-specifici specifici L identificazione nell uomo di stipiti virali correlati antigenicamente a rotavirus animali

7 Caratteri fisico biologici hanno la proprietà di agglutinare a diverse temperature i globuli rossi di varie specie animali L infettività è favorita dalle basse temperature e da condizioni di umidità elevata Sono stabili a ph 3 e, in quanto privi di envelope, resistono ai comuni disinfettanti quali etere, cloroformio e acidi Sensibili formalina

8 Spettro d ospite d in vitro Per la coltivazione in vitro è utilizzata la linea cellulare MA-104 Condizione essenziale per lo sviluppo del virus e per la comparsa dell effetto effetto citopatico è l aggiunta d enzimi proteolitci (tripsina) L effetto citopatico si manifesta nel giro di h, ed è caratterizzato dalla comparsa di cellule rifrangenti che si distaccano dal monostrato e vanno incontro a lisi

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11 Struttura del genoma e delle proteine virali I Rotavirus possiedono 11 segmenti di RNA a doppia elica contenuti nel core Ogni segmento di RNA codifica per una proteina,, tranne l ultimo l segmento che possiede due ORF 6 proteine strutturali (VP) e 6 proteine non strutturali (NSP)

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14 Struttura antigene Nel genere Rotavirus sono stati identificati 7 sierogruppi, indicati con le lettere da A a G. I sierogruppi sono antigenicamente distinguibili mediante diverse tecniche: immunoelettromicroscopia immunofluorescenza ELISA in base ad un antigene di gruppo comune localizzato sulla proteina VP6

15 Struttura antigene 1. I Rotavirus nell ambito di un sierogruppo sono divisi in sottogruppi, 1. due antigeni di sottogruppo, SI e SII, presenti su proteine VP6 e VP2 2. I Rotavirus di gruppo A, i più studiati, sono ulteriormente classificati in sierotipi in base alle caratteristiche della VP4 e della VP7 1. La VP4 identifica il P-tipo (Protease-sensible) 2. La VP7 identifica il G-tipo (Glicoproteina)

16 Struttura antigene Sino ad oggi sono noti 15 G-tipi G e 23 P-tipi P I tipi più diffusi sono: nei bovini: P1, P11, P5, G6 e G10 nel bufalo: P1, P11, P5, G8, G6 negli equini: P7, P12, P17, G4 e G5 nei suini: P6, P7, G4 e G5 nell uomo: P4, P6, P8, G1, G2, G3 e G4

17 Rotavirus,, strain variation Reassortment of genome segments can lead to generation of new serotypes Occurs in host infected simultaneously with 2 or more serotypes Probably a more important cause of cross- species transmission

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19 Epidemiologia La via di trasmissione principale è di tipo orizzontale, attraverso il ciclo oro fecale E possibile anche una trasmissione indiretta attraverso le attrezzature, utensili, mangimi ed acque inquinati da feci infette la via transplacentare e quella attraverso gli insetti ematofagi è da escludere in quanto la malattia non presenta fasi viremiche

20 Patogenesi il virus, assunto per ingestione, si localizza nel duodeno e nel tratto superiore del digiuno, aderendo elettivamente alle cellule epiteliali situate all apice apice dei villi intestinali Gli enzimi pancreatici agiscono attivando la proteina VP4, sui suoi siti di clivaggio, scindendola nelle 2 frazioni VP5 e VP8 aumentando così la capacità di penetrazione nella cellula

21 Patogenesi Segue lo svestimento delle particelle, inteso come rimozione del capside esterno La degradazione del capside esterno comporta contemporaneamente l attivazione l dell RNA RNA- polimerasi e degli altri enzimi per il capping e la metilazione degli RNAm in via di formazione Questi RNAm sono prodotti, con un meccanismo di trascrizione conservativo unico nel mondo dei virus, sullo stampo del filamento (-)(

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26 Patogenesi Le cellule cilindriche,, così infettate, sono distrutte e rimpiazzate da cellule cuboidi delle cripte ghiandolari La presenza di queste cellule cuboidali rappresenta una risposta dell organismo per proteggere la lamina propria dei villi

27 Patogenesi Questa risposta permette l acquisizione l di uno stato di resistenza al proseguimento dell infezione Queste nuove cellule, infatti, sono apparentemente refrattarie all infezione, essendo prive di recettori specifici per il virus

28 Patogenesi Le cellule cuboidali sono cellule immature sostituiscono, in corso di diarrea, quelle altamente differenziate accelerando la loro migrazione verso l apice dei villi queste cellule sono infatti carenti di enzimi specifici quali la disaccaridasi, lattasi, NA+-ATPasi ATPasi e K+- ATPasi Tutto ciò determina difetti di trasporto ionico, una scarsa capacità di assorbimento di glucosio e galattosio una diminuita capacità ad utilizzare il lattosio per deficienza di lattasi.

29 Patogenesi 1. zuccheri non digeriti nel lume intestinale 2. metabolizzati, da parte di batteri intestinali, 3. trasformati in acidi grassi a corta catena, 4. richiamo osmotico di plasma e di altri liquidi organici 5. aumento della pressione osmotica nel lume intestinale 6. segue diarrea e disidratazione l assorbimento di metaboliti tossici derivati dalla fermentazione degli idrati di carbonio, alla quale spesso concorrono anche patogeni secondari quali E. coli, salmonelle ed altri, spiegano così l alta mortalità soprattutto di vitelli e suinetti affetti da rotavirosi.

30 Sintomatologia Negli adulti il virus è in grado di moltiplicarsi senza provocare una sintomatologia manifesta I giovani, sprovvisti di immunità mucosale a livello intestinale, invece manifestano la sintomatologia clinica Il quadro sintomatologico è simile in tutte le specie ed è sovrapponibile alle altre enteriti.

31 Sintomatologia La forma clinicamente manifesta compare, nelle varie specie, dopo un periodo di incubazione di 1-41 giorni e persiste circa giorni Gli animali colpiti dall infezione mostrano i segni di un enterite acuta, che si manifesta con diarrea, talvolta muco-emorragica La febbre si manifesta ad intermittenza o può essere assente

32 Sintomatologia Gli animali giovani colpiti dalla diarrea possono sviluppare rapidamente una grave disidratazione, accompagnata da acidosi L estensione delle alterazioni, la compromissione dello stato generale e l eventuale l partecipazione di E.coli o di altri germi di irruzione secondaria, possono spiegare la mortalità non indifferente, oltre il 50%, che si osserva specialmente nei vitelli e nei suinetti

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35 Lesioni anatomopatologiche stato scadente di nutrizione grave disidratazione enterite catarrale acuta linfoadenomegalia mesearica ipertrofia delle placche del Peyer lieve splenomegalia

36 Lesioni anatomopatologiche esame istologico: infiltrazione nella mucosa di cellule linfo- monocitarie aumento di volume dei follicoli linfatici I villi intestinali appaiono accorciati ed atrofici le cellule cilindriche dell apice di questi ultimi sono sostituite da cellule cuboidi e nei casi più gravi da cellule pavimentose iperplasia delle cripte

37 Small intestines of mice above uninfected and below infected with rotavirus stained with PAS/Alcian Alcian Blue

38 Histopathology

39 Diagnosi E abbastanza difficile emettere un giudizio sulla sola base sintomatologica diagnosi differenziale le rotavirosi si manifestano entro i primi 15 giorni di vita Le coronavirosi si manifestano tra i 15 e 45 giorni d'età le parvovirosi dai 15 giorni fino a 6 mesi

40 Diagnosi natura istopatologica delle lesioni rotavirosi: : lisi e necrosi delle cellule degli apici dei villi mentre quelle delle cripte appaiono lievemente iperplastiche coronavirosi le lesioni interessano tutto il villo intestinale e le cellule delle cripte appaiono notevolmente iperplastiche parvovirosi le cellule delle cripte sono in completa aplasia ed i processi rigenerativi sono compromessi

41 Diagnosi Tuttavia per una conferma definitiva occorrono esami di laboratorio Quelli più usati sono indirizzati ad evidenziare il virus nelle feci eseguiti con diverse tecniche quali

42 Test rapido immunocromatografico (Rotascreen dipstick M580)

43 Diagnosi microscopia elettronica

44 Colture cellulari Diagnosi

45 immunofluorescenza Diagnosi

46 Diagnosi PAGE (elettroforesi in gel di poliacrilamide)

47 Diagnosi RT-PCR (reverse polimerase chain reaction) RT-PCR con i primers Beg9- End9. Amplificazione del gene VP7 (1060 bp). RT-PCR con i primers Con2- Con3. Amplificazione di frammenti di 876 bp del gene della proteina VP4

48 Profilassi sanitaria è in grado di realizzare una riduzione della carica infettante negli ambienti di allevamento Garantendo una temperatura ed areazione ottimale degli animali in allevamento, una pulizia e disinfezione dei locali con disinfettanti a base di formalina

49 Immunità passiva le madri guarite da rotavirosi o immunizzate contro Rotavirus sono in possesso di anticorpi specifici che trasmettono alla prole per vie diverse, secondo la specie gli animali ne acquisiscono in quantità notevole soprattutto con il colostro e in parte con il latte quindi l assunzione l di colostro è indispensabile ed il privarli di esso significa renderli senza difesa

50 Immunità attiva l infezione acuta della malattia provoca un notevole stimolo antigenico a carico dei linfociti della parete intestinale i primi anticorpi a comparire sono quelli della classe IgM, successivamente le IgG immunità omotipica,, cioè rivolta solo nei confronti del sierotipo che ha causato l infezione.

51 Immunità attiva Di maggior rilievo, invece, hanno in questa infezione gli anticorpi della classe IgA che risultano più avidi e che sono in grado di bloccare la sintesi virale ma la loro produzione è transitoria, perdurando solo da 4 a 10 giorni nell uomo ed in molte specie animali sono stati isolati da feci anticorpi non solo della classe IgA ma anche quelli di classe IgG ed IgM

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53 G and P genotipi di rotavirus bufalini in sette allevamenti Strains Herd Year of isolation G-type P-type BuRV/1 A 2001 G-8 P[1] BuRV/2 A 2001 G-8 P[1] BuRV/3 A 2002 G-8 P[5] BuRV/4 A 2002 G-8 P[5] BuRV/5 G 2002 G 10 P[1] BuRV/1S E 2003 G 10 P[1] BuRV/2S E 2003 G 10 P[1] BuRV/B E 2003 G 10 P[1] BuRV/90 B 2003 G 6 P[5] BuRV/377 A 2003 G 6 P[5] BuRV/378 A 2004 G 6 P[5] BuRV/562 F 2004 G 6 P[5] BuRV/547 F 2004 G 6 P[5] BuRV/549 F 2004 G 6 P[5] BuRV/F1 D 2004 G 6 P[5] BuRV/F2 D 2004 G 6 P[5] BuRV/F3 D 2004 G 6 P[5] BuRV/M C 2004 G 6 P[5] BuRV/2M C 2004 G 6 P[5] BuRV/304 A 2004 G 6 P[5] BuRV/404 A 2004 G 6 P[5]

54 Relative frequencies of various combination of the G and P genotypes observed in buffalo rotavirus field isolates in Italy. Genotype P[1] P[5] P[11] Total G6-12 (57,14) - 12 (57,14) G8 2 (9,52) 3 (14,28) - 5 (23,8) G10 4 (19,04) ( 19,04) Total 6 (28,56) 15 (71,42) - 21 (100)

55 Strains buffalo P[5] G6 57% P[1] G10 19% P[5],G8 14% P[1],G8 9.5%

56 Strains An intersting finding was the identification of strains displaying the P[1],G10 combination reassortment between a P[1] buffalo strain and G10 bovine strain

57 Distribution of rotavirus strains in the various herds Herds A G8-P1 (2) G8-P5 (3) G6-P5 (1) G6-P5 (3) B - - G6-P5 (1) - C G6-P5 (2) D G6-P5 (3) E - - G10-P1 (3) - F G6-P5 (2) G - - G10-P1 (1) - Escape immunity

58 Conclusion buffalo and bovine rotaviruses share similar VP4 and VP7 antigenic specificities G8 more frequent in buffaloes. a novel reassortant strain, P[1],G10 occurred in buffaloes.

59 Conclusion Three vaccines are available in Italy a killed vaccine P[7] G5 two live modified vaccines P[1] G6 and P[5] G6 Not contain G10 Partial immunity

60 Conclusion Continual surveillance for rotavirus genotypes in buffalo herds is required for a better understanding of the global rotavirus ecology and for the optimisation of current vaccines and prevention programs of rotavirus diarrhoea in buffalo.

61 Grazie per l attenzione