individuazione della causa di una patologia Diagnostica di laboratorio

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1 DIAGNOSI (διαγνωσισ = distinguere) individuazione della causa di una patologia Diagnosi su base clinica e/o anatomo-patologica sospetto o orientamento diagnostico Diagnosi di laboratorio (diagnosi eziologica) conferma diagnostica ai fini dell applicazione delle misure di terapia e profilassi Diagnostica di laboratorio procedure di laboratorio atte ad accertare l eziologia delle infezioni DIAGNOSI DIRETTA dimostrazione del patogeno direttamente nel campione, materiale biologico tramite il quale è eliminato o nel quale è localizzato l A.E.: urina, feci, sperma, secrezioni uterine, latte, saliva organi e tessuti corretto prelievo e corretta conservazione del campione 1

2 DIAGNOSI DIRETTA esame microscopico, a fresco o previa colorazione (Gram, Giemsa, Ziehl-Neelsen ) microscopio ottico e microscopio elettronico DIAGNOSI DIRETTA isolamento in coltura ed identificazione terreni colturali e adeguate condizioni di coltura metodi biomolecolari, evidenziano una o più sequenze geniche specifiche dell A.E. 2

3 DIAGNOSI INDIRETTA evidenziazione delle reazioni causate dai patogeni nell ospite produzione di anticorpi specifici diagnosi sierologica siero prove sierologiche (agglutinazione, fissazione del complemento, ELISA, IFI, WB..) sieroconversione DIAGNOSI INDIRETTA reazioni di ipersensibilità prove allergiche prova della tubercolina 3

4 TEST DIAGNOSTICO definizione Procedura ben definita utilizzata al fine di raccogliere una certa informazione QUALSIASI PROCEDIMENTO CHE VIENE ATTUATO ALLO SCOPO DI VERIFICARE UN IPOTESI non solo le procedure di laboratorio, ma anche un questionario può essere un test diagnostico TEST DI SCREENING definizione test diagnostico applicato a tutti gli individui di una popolazione a rischio, soggetti ad una probabilità più o meno elevata di presentare la malattia considerata 4

5 SCREENING Identificazione di animali malati e sani Procedure economiche, rapide e di semplice impiego Malattie degli animali di notevole gravità sul piano sanitario ed economico o zoonosi BASE dei PIANI di CONTROLLO ed ERADICAZIONE delle MI Es. test della tubercolina, FdC e Rosa Bengala per brucellosi Individuare la malattia nei SINGOLI ANIMALI o GRUPPI Utile quando si utilizza un test di screening provvisto di bassa sensibilità Individuazione di un solo animale infetto è sufficiente a dichiarare infetto l intero gruppo SCREENING DIAGNOSI Screening e diagnosi possono utilizzare lo stesso test, ma In una procedura diagnostica, il test è impiegato su animali malati, che mostrano sintomi clinici che fanno sospettare la presenza della malattia Le azioni di screening prevedono l applicazione del test su tutti gli individui della popolazione, indipendentemente dal loro stato di salute (animali sani e malati) Poiché il valore predittivo di un test dipende dalla prevalenza della malattia, la performance del test sarà meno soddisfacente in caso di screening rispetto al caso in cui lo stesso test sia utilizzato a scopo diagnostico 5

6 TEST PATOGNOMONICI E NON PATOGNOMONICI I test diagnostici non sono infallibili falsi positivi e falsi negativi Sulla base dell affidabilità dei risultati forniti si dividono in due categorie: TEST PATOGNOMONICI e NON PATOGNOMONICI Quasi tutti i test impiegati in medicina non sono patognomonici TEST NON PATOGNOMONICO Il risultato, positivo o negativo che sia, indica solo la probabilità di essere veritiero Nell ambito dei risultati positivi FALSI POSITIVI Nell ambito dei risultati negativi FALSI NEGATIVI TEST PATOGNOMONICO Non genera mai falsi risultati positivi ma può fornire falsi risultati negativi 6

7 TEST PATOGNOMONICI e NON PATOGNOMONICI Esempio: Test sierologico per brucellosi bovina (Brucella abortus) Falsi positivi:reazioni di cross-reattività (es. Yersinia) Falsi negativi: se la bovina si è infettata recentemente e non ha ancora prodotto Ab Il test sierologico non è un test patognomonico Esame colturale su latte Risultato positivo certo Risultato negativo dubbio: eliminazione intermittente delle brucelle L isolamento colturale è un test patognomonico QUINDI I test patognomonici sono migliori dei non-patognomonici? Non c è una risposta assoluta. Test patognomonici: Tempi più lunghi Costi più elevati Frequenza più elevata di falsi-negativi 7

8 VALUTAZIONE PERFORMANCE TEST DIAGNOSTICO NON ESISTONO TEST INFALLIBILI L esito dà un indicazione di probabilità, tranne nel caso di un test patognomonico che non da falsi positivi La performance del test dipende dalla quota di risultati falsi positivi e falsi negativi ottenuti applicando il test ad una popolazione che comprende sia animali sani che malati PERFORMANCE TEST a+b: test positivi c+d: test negativi ATTENZIONE!!! Non tutti gli animali positivi sono malati b: falsi-positivi Non tutti gli animali negativi sono sani c: falsi negativi Quanti degli animali test negativi sono falsi-negativi? Quanti degli animali test-positivi sono falsi positivi? 8

9 PERFORMANCE TEST PERFORMANCE TEST 9

10 PERFORMANCE TEST condizione reale del animale risultato del test SENSIBILITA Capacità di identificare correttamente gli animali malati In termini di probabilità è la probabilità di identificare come positivo un animale malato Proporzione degli animali malati che risultano positivi al test 10

11 SENSIBILITA SENSIBILITA proporzione tra i soggetti malati positivi al test e gli animali malati (+ e al test) a/(a+c) SENSIBILITA proporzione tra i soggetti malati positivi al test e gli animali malati (+ e al test) a/(a+c) VALORE COMPRESO TRA 0 e 1 Esprimibile come valore percentuale 11

12 SPECIFICITA Capacità di identificare correttamente gli animali sani In termini di probabilità è la probabilità di identificare come negativo un animale sano Proporzione degli animali sani che risultano negativi al test SPECIFICITA SPECIFICITA proporzione tra i soggetti sani negativi al test e gli animali sani (+ e al test) d/(b+d) 12

13 SPECIFICITA Importante sugli screening di larga scala Es.: nel 2002 in Italia effettuati test per BSE 34 positivi test di specificità straordinariamente elevata se test Sp = 99% 1% bovini sani sarebbe risultato positivo ben 7467 animali SENSIBILITA E SPECIFICITA 13

14 SENSIBILITA E SPECIFICITA RICAPITOLANDO.. Caratteristiche interne e proprie di un test diagnostico Caratteristiche misurabili comprese tra 0 e 1: esprimono valori di probabilità Raramente entrambi uguali a 1 SENSIBILITA E SPECIFICITA Esempio: diagnosi di morte Il rigor mortis è un sintomo assolutamente specifico: nessun vivo lo presenta. Tuttavia non è presente nei morti da troppo poco o troppo tempo EEG piatto è un sintomo assolutamente sensibile: tutti i morti hanno l EEG piatto! Tuttavia l EEG può presentarsi transitoriamente piatto in soggetti in coma profondo N.B. I TEST DIAGNOSTICI NON FORNISCONO CERTEZZE 14

15 Perché un animale sano reagisce come falso positivo? Contatti con organismi antigenicamente simili Cross-reazioni (Brucella/Yersinia; M.bovis/M.tuberculosis) Immunità passiva e immunità vaccinale Errori grossolani Contaminazione del siero Errori di identificazione Errori di misurazione Inadeguata standardizzazione della tecnica e/o degli antigeni Altri errori umani Perché un animale malato reagisce come falso negativo? Stato fisiologico Diminuita produzione di Ab in conseguenza del parto, estro e altri fattori stressanti Stati di immunodepressione (da terapie, malattie.) Mancata produzione di anticorpi Fase iniziale dell infezione Errori di misurazione Inadeguata standardizzazione della tecnica e/o degli antigeni Altri errori umani 15

16 Perché un animale malato reagisce come falso negativo? Mancata produzione di anticorpi IMMUNOTOLLERANZA Es.: BVD-MD; infezione intrauterina l evoluzione della malattia è in funzione del periodo di gestazione: Fino a 125 gg di gravidanza: riassorbimento embrionale, aborto, natimortalità e nascita di vitelli viremici, immunotolleranti e persistentemente infetti (sieronegativi e viremici) Da gg di gravidanza: malformazioni facciali, atassia, tremori, lesioni oculari e al SNC; vitelli sieropositivi e a volte viremici Oltre a 180 gg di gravidanza non provoca danni al feto che nasce sieropositivo Curva di produzione anticorpale Inizio produzione Soglia di dosabilità titolo anticorpale tempo infezione 16

17 SENSIBILITA E SPECIFICITA Test qualitativo fornisce risultati dicotomici: +/-; sì/no; sano/malato Altri test (quantitativi) forniscono risultati classificabili in più categorie Per questi si deve stabilire un valore soglia o cut-off È il limite di separazione tra positività e negatività del test A partire da quale valore di DO giudichi infetto un animale? Es: cut-off 1 non infetto < 1 infetto 1 17

18 Es: cut-off 0,8 non infetto < 0,8 infetto 0,8 Il test riesce ad individuare TUTTI i soggetti INFETTI, quindi raggiunge una sensibilità pari al 100% Svantaggio: includi tra i positivi un numero elevato di soggetti sani, quindi aumentano i FALSI POSITIVI Es: cut-off 1,2 non infetto 1,2 infetto 1,2 Il test riesce ad individuare TUTTI i soggetti SANI, quindi raggiunge una specificità pari al 100% Svantaggio: includi tra i negativi un numero elevato di soggetti infetti, quindi aumentano i FALSI NEGATIVI 18

19 Quindi la sensibilità può essere aumentata ma solo a spese della specificità e viceversa.. La riduzione del valore di cut-off determina un aumento della Se ma una riduzione della Sp L aumento del valore di cut-off determina una riduzione della Se ma un aumento della Sp In genere è meglio scegliere una situazione di compromesso, con un valore di cut-off vicino a 1.0 SENSIBILITA E SPECIFICITA INFERIORI A 100% 19

20 PRIVILEGIARE LA SENSIBILITA O LA SPECIFICITA? Considerazioni di ordine sanitario ed economico Conseguenze dei falsi positivi e negativi Un test sensibile va scelto quando le conseguenze di una mancata diagnosi sono particolarmente gravi (es. donatori sangue) Durante la diagnosi iniziale per escludere una o più malattie (diagnosi differenziale) Un test specifico è utile per confermare una diagnosi fatta con altri mezzi Se Pr della malattia elevata: va limitato il n di falsi positivi per considerazioni di tipo economico (un test specifico raramente è positivo in assenza di malattia) VALORE PREDITTIVO DI UN TEST Test + Sarà un positivo vero? Sarà un positivo falso? Possiamo rispondere a questa domanda in termini probabilistici, conoscendo il VALORE PREDITTIVO POSITIVO (VPP) 20

21 Questo valore indica, infatti, la probabilità che un animale test-positivo sia ammalato, e si calcola con la proporzione a/(a+b). VALORE PREDITTIVO DI UN TEST Test - Sarà un negativo vero? Sarà un negativo falso? Possiamo rispondere a questa domanda in termini probabilistici, conoscendo il VALORE PREDITTIVO NEGATIVO (VPN) 21

22 Questo valore indica, infatti, la probabilità che un animale test-negativo sia sano, e si calcola con la proporzione d/(c+d). VALORI PREDITTIVI da cosa dipendono? SENSIBILITA E SPECIFICITA DEI TEST PREVALENZA REALE DELL INFEZIONE: VPP Diminuisce al diminuire della prevalenza VPN Aumenta al diminuire della prevalenza 22

23 ZONA A VPP = 90% Su 100 bovini positivi al test, circa 90 sono veri positivi e 10 falsi positivi 10% bovini verrebbero abbattuti erroneamente ZONA B VPP = 55,6% 44% bovini abbattuti erroneamente ZONA C VPP = 11% 89% bovini abbattuti erroneamente Situazione inaccettabile!! Aumento rapporto costi/benefici 23

24 COME MIGLIORARE IL VALORE PREDITTIVO TEST MULTIPLI 2 TEST IN SUCCESSIONE Si applica il 1 test sulla popolazione (test meno costoso) Il 2 solo sui positivi (test più costoso ) I due test devono essere biologicamente indipendenti Es. test sierologici che misurano differenti classi di Ab Es. Piano Nazionale di Profilassi Brucellosi bovina Test Rosa Bengala FdC 24

25 TEST MULTIPLI 2 TEST IN CONTEMPORANEA Otteniamo le seguenti combinazioni di risultati: Test A + e Test B + Test A + e Test B Test A e Test B + Test A e Test B Come interpretare i risultati? 25

26 TEST MULTIPLI INTERPRETAZIONE IN PARALLELO (OR) un animale si considera infetto (o ammalato) quando è positivo ad un test o all altro o ad entrambi Questa interpretazione aumenta la sensibilità ma diminuisce la specificità fornisce a ciascun animale una maggiore probabilità di reagire positivamente Aumento dei FALSI POSITIVI Aumento del VPN a scapito del VPP Diagnosi rapida (emergenze) oppure con pazienti che non potranno essere esaminati un altra volta TEST MULTIPLI INTERPRETAZIONE IN SERIE (AND) L animale è considerato positivo solo quando reagisce positivamente ad entrambi i test Si effettua quando sia richiesta una maggiore specificità La specificità aumenta perché per ogni animale saggiato, la probabilità di risultare positivo a entrambi i test è inferiore rispetto a quanto avviene interpretando i risultati in parallelo Facile che sfuggano alla diagnosi animali infetti FALSI NEGATIVI Aumento del VPP a scapito del VPN 26

27 TEST MULTIPLI INTERPRETAZIONE IN SERIE Quando non è richiesta una diagnosi rapida (animali ospedalizzati) Fase finale dei piani di eradicazione TEST MULTIPLI 27

28 TEST MULTIPLI Differenza tra gli approcci in contemporanea e successione: Il numero di animali da saggiare in caso di test in successione è senz altro inferiore rispetto all applicazione in contemporanea Fattore molto importante se la popolazione da saggiare è numerosa RIPRODUCIBILITA (PRECISIONE) È quella caratteristica della misurazione per cui la stessa, ripetuta più volte sullo stesso oggetto di misurazione, fornisce lo stesso risultato; Capacità di dare risultati sovrapponibili Riproducibilità interna al laboratorio (INTRA-ASSAY) Riproducibilità tra laboratori (INTER-ASSAY) 28

29 ACCURATEZZA (o VALIDITA o EFFICIENZA) capacita del test di fornire un esito veritiero Proporzione di individui (o di unità di studio, es. allevamenti, gruppi ecc) identificati correttamente come ammalati/non ammalati (o infetti/non infetti) da quel test diagnostico Dipende dalla sensibilità e specificità ACCURATEZZA 29

30 ACCURATEZZA Poiché nella pratica il vero stato sanitario degli animali non è noto, si misura il grado di concordanza con un test di riferimento noto, il golden test o gold standard test ACCURATEZZA Es.: 300 bovini sottoposti test tubercolina; In seguito macellati ed eseguito esame anatomo-patologico (gold standard) (25+253) / 300 = 0,927 Concordanza tra i 2 test è pari al 92,7% Quindi il test della tubercolina ha una «accuratezza» del 92,7% rispetto all'esame anatomo-patologico. Questo significa che il test della tubercolina identifica correttamente lo stato di un animale (non importa se affetto da tubercolosi o no) nel 92,7% dei casi. 30

31 ALTRE CARATTERISTICHE Facilità di esecuzione (automatica o manuale) Facilità del prelievo del materiale occorrente per la diagnosi Costi (reagenti, attrezzature, personale ecc) Possibilità di standardizzazione (dei metodi e dei risultati) Prevalenza dell infezione/malattia da diagnosticare Altro (politica sanitaria, legislazione nazionale/internazionale ecc) 31