METODOLOGIE MICROBICHE AA I ESPERIENZA (25-27 Marzo 2013)
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- Marina Ranieri
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1 METODOLOGIE MICROBICHE AA I ESPERIENZA (25-27 Marzo 2013) STAINING PROCEDURES a) SIMPLE STAINING 1. Fissare le cellule sul vetrino mediante calore 2. Crystal Violetto x 20 sec 3. Lavaggio con H 2 O 4. Apporre vetrino copri-oggetto 5. Osservare al microscopio ad immersione b) GRAM STAINING 1. Colorare con crystal violetto per sec 2. Sciacquare con acqua e asciugare l'acqua in eccesso 3. Colorare con la soluzione iodio iodurata e lasciare agire per circa 30 sec 4. Sciacquare con acqua e asciugare l'acqua in eccesso 5. Decolorare con EtOH 95% (per uno striscio sottile sono sufficienti sec di esposizione) 6. Sciacquare con acqua e asciugare l'acqua in eccesso 7. Applicare la safranina (colorante di contrasto) per 30 sec 8. Sciacquare con acqua e ascigare l'acqua in eccesso 9. OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO OTTICO CON OBIETTIVO AD IMMERSIONE IN OLIO 1
2 c) SPORE STAINING 1. Colorare con verde malachite e riscaldare il vetrino sul bunsen finchè il liquido non risulta asciutto 2. Lasciar raffreddare il vetrino 3. Lavare con acqua per 30 sec 4. Colorare con safranina per 20 sec 5. Sciacquare con acqua e asciugare l'acqua in eccesso 6. Osservare al microscopio ottico 2. LAVORARE IN CONDIZIONI DI STERILITA' - Trasferimento di una coltura da liquido a piastra - Trasferimento di una coltura da piastra a liquido 2
3 II ESPERIENZA (03 Aprile 2013) PREPARAZIONE DI MEZZI DI COLTURA Terreno ricco NUTRIENT AGAR (ph ) Nutrient Broth (Oxoid) Agar H 2 O bi-distillata 13.0 g 12.0 g fino a 1L Terreno PCA (Plate Count Agar) (ph ) Triptone Estratto di lievito Glucosio Agar H 2 O bi-distillata 5.0 g 2.5 g 1.0 g 12.0 g fino a 1L Terreno ricco TSA (Triptone Soya Agar) (ph 7.0) Triptone Soya Broth (Oxoid) Agar H 2 O bi-distillata 30.0 g 12.0 g fino a 1L Terreno MALT AGAR (ph 7.0) Malt Broth (Oxoid) Agar H 2 O bi-distillata 20.0 g 15.0 g fino a 1L Dopo la sterilizzazione aggiungere l'antibiotico RIFAMPICINA alla concentrazione di 15 mg/l Terreno per coliformi LB Broth (ph ) Tryptone NaCl Yeast Extract Agar H 2 O bi-distillata 10.0 g 10.0 g 5.0 g 12.0 g fino a 1L COSA FARE: 3
4 Pesare i singoli componenti utilizzando la bilancia tecnica Pesare i singoli componenti servendosi di un pezzo di carta stagnola e spatoline pulite Dopo ogni pesata pulire accuratamente le spatoline sotto l'acqua e asciugarle Versare le polveri pesate in un becher Aggiungere un volume di H 2 O bi-distillata leggermente inferiore a quello finale Far sciogliere le polveri nell'acqua servendosi di uno stirrer Misurare il ph ed eventualmente aggiustarlo Portare a volume in un cilindro Versare la soluzione in una bottiglia in vetro Pirex che verrà poi autoclavata Aggiungere il quantitativo di Agar come richiesto nella ricetta direttamente nella bottiglia (l'agar non va in soluzione!!!!!) Autoclavare il terreno (121 C per 15 minuti alla sovrapressione di 1 atm) IMPORTANTE: prima di mettere la bottiglia in autoclave assicurarsi di aver scritto sopra ciascuna bottiglia, utilizzando lo scotch da Autoclave, il NOME del TERRENO e il NOME del GRUPPO che lo ha preparato!! 4
5 3 ESPERIENZA IL CAMPIONAMENTO 5
6 PREPARAZIONE DELLA SOSPENSIONE DI SUOLO - Preparo la sospensione di suolo in fisiologica (0,9% NaCl) pesando 2 gr di suolo e aggiungendo 18 ml di fisiologica (diluizione 1:10) - Metto in agitazione per 30 minuti a T ambiente - Nel frattempo preparo in tubi tipo eppendorf 900 µl di fisiologica. Ciascun gruppo dovrà preparare 4 tubini. - Passati i 30 minuti ciascun gruppo dovrà seminare sotto cappa 100 µl dell'opportuna diluizione. 6
7 IV ESPERIENZA (22 E 24 Aprile 2013) 1. STIMA DELLA CARICA MICROBICA TOTALE - Contare le colonie cresciute sulla piastra - Calcolare il numero di Unità Formanti Colonia sfruttando la formula di seguito riportata 2. Scegliere una colonia dalla piastra (ciascuno dovrà scegliere una singola colonia): - Risospendere la colonia in un tubino tipo Eppendorf contenente 100 µl di H 2 O sterile (Già pronto). DA FARE SOTTO CAPPA - Strisciare la colonia su di una piastra pulita (SOTTO CAPPA) - utilizzare una piastra per gruppo divisa in 4 quadranti. Scrivere sulla piastra nome del gruppo e nome della colonia 3. TEST DELLA MOTILITA I METODO: Test in tubino con SOFT AGAR 1. Preparare i tubini contenente 4ml di soft agar 0,4% (1 tubino per ceppo) 2. Lasciare solidificare il mezzo 3. Inoculare il ceppo utilizzando un ansa sterile immergendola per circa 2 cm nel mezzo 4. Incubare i tubini a temperatura di crescita ottimale II METODO: Osservazione al microscopio ottico 1. Preparare lo smear sul vetrino senza fissare le cellule al calore 2. Apporre il vetrino copri-oggetto 3. Osservare al microscopio ottico ad immersione 4. COLORAZIONE DI GRAM Ciascun studente dovrà effettuare la colorazione di GRAM sulla colonia scelta secondo il protocollo di seguito riportato 1. Trasferire il campione sul vetrino(applicare poche gocce della sospensione batterica già preparata) 2. Fissare al calore utilizzando il bunsen 3. Colorare con cristal violetto per sec 4. Sciacquare con acqua e asciugare l acqua in eccesso 5. Colare con soluzione iodio iodurata e lasciare agire per circa 30 sec 6. Sciacquare con acqua e asciugare l acqua in eccesso 7. Decolorare con EtOH 95% (10-20 sec) 8. Sciacquare con acqua e asciugare l acqua in eccesso 9. Applicare la safranina (colorante di contrasto) per sec 10. Sciacquare con acqua e asciugare l acqua in eccesso 11. OSSERVARE AL MICROSCOPIO OTTICO 7
8 5 ESPERIENZA (29 Aprile 2013) VALUTAZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA - IN PIASTRA: osservare la crescita avvenuta sulle piastre seminate nella precedente esperienza - IN LIQUIDO: preparare un tubino con 4ml di Nutrient liquido e inoculare il ceppo servendosi di un ansetta sterile - IN SLANT: versare 5 ml di Nutrient agar in un tubino e farlo solidificare inclinato utilizzando il bancone come piano d appoggio. Aspettare 30 minuti e poi seminare il ceppo servendosi di un ansetta sterile. TEST BIOCHIMICI a) TEST DELLA CATALASI 1. Partendo dalla piastra su cui è cresciuto il ceppo strisciato nella precedente esperienza di laboratorio, prelevare con un ansa sterile un po di biomassa e stemperarla in un tubino da 13 ml contenente 1 ml di fisiologica 2. Aggiungere un ugual volume di H 2 O 2 al 3% 3. Attendere circa un minuto e osservare la formazione di bolle. POSITIVO: si bolle NEGATIVO: no bolle b) TEST DELL OSSIDASI 1. Imbibire una strisciolina di carta Whatman con una soluzione di tetramethyl-pphenylenediamine chloride 1% (già pronta) 2. Strisciare sulla carta imbibita un po di biomassa batterica, partendo dalla piastra 3. Attendere alcuni secondi POSITIVO: formazione di colore violetto-porpora in 10 sec NEGATIVO: nessun colore 8
9 6 ESPERIENZA ESTRAZIONE di DNA TOTALE da CEPPI BATTERICI (METODO DELLE PALLINE DI VETRO) Si parte da ceppi in coltura pura cresciuti overnight in mezzo liquido Tampone di estrazione: 2,5 ml di SDS 10% 0,5 g di Triton X-100 0,5 ml di NaCl 5 M 250 µl di EDTA 0,5 M portare a volume finale 25 ml. Inoculare una singola colonia da piastra in un tubo contenente 4 ml di terreno liquido a 28 C in agitazione over night. Prelevare 1,5 ml di coltura liquida, centrifugare a rpm per 10 minuti ed eliminare il surnatante. Aggiungere al pellet 0,2 ml di tampone di estrazione, 0,3 g di palline di vetro (dal diametro di 0,4-0,5 mm sterilizzate in etanolo assoluto) e 0,2 ml fenolo-cloroformio. Agitare sul vortex per 2 minuti. Centrifugare a rpm per 5 minuti. Prelevare la fase acquosa e trasferirla in una nuova eppendorf. Addizionare isopropanolo 1:1 ed incubare a temperatura ambiente per 5minuti. Centrifugare a rpm per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Lavare il pellet con etanolo 70% (300 l). Centrifugare a rpm per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Far seccare il pellet all aria e risospendere in 50 µl di acqua. 9
10 CONTROLLO del DNA genomico ottenuto su gel di agarosio - preparare gel di agarosio 1% - preparare campione da caricare: 5 l del DNA ottenuto 1 l LD 4 l H 2 O - corsa elettroforetica a 100 V per min 10
11 7 Esperienza Maggio 2013 a) PCR SUL GENE 16S rrna 11
12 Allestimento della reazione di PCR In ogni tubino: Templato 3 ul Buffer 1X (stock 5X) Primer F1 (10 pmol/reazione) Primer R12 (10 pmol/reazione) dntps (0,4 mm) Taq polimerasi (1U/reazione) H 2O Volume totale (stock 10 pmol/ul) (stock 10 pmol/ul) (stock 10 mm) (stock 5U/ul) fino a 25 ul 25 ul PREPARARE UNA MASTER MIX PER 6 CAMPIONI: 4 per i ceppi, 1 per il controllo negativo (1 per volume di sicurezza). CICLO DI REAZIONE: Temperatura Tempo Denaturazione 94 C 4 min iniziale 30 cicli Denaturazione 94 C 45 sec Annealing 42 C 45 sec Estensione 72 C 2 min Estensione 72 C 5 min 12
13 finale b) TEST DI RIDUZIONE DEL NITRATO E NITRIFICAZIONE 1. Preparazione del terreno di coltura Nutrient Broth KNO 3 (0,1%) Agar H 2O bidistillata 13,0 g 1 g 1,7 g fino a 1 L 2. Sterilizzazione in autoclave 121 C per 15 minuti 3. Preparare i tubini sotto cappa versando 5 ml di terreno in tubi da batteriologia (1 tubo per ogni ceppo) 4. Lasciar raffreddare il mezzo di coltura 5. Inoculare il ceppo utilizzando un ansa sterile 6. Incubare i ceppi a temperatura di crescita ottimale per 5-7 giorni c) TEST UREASI The urease test identifies those organisms that are capable of hydrolyzing urea to produce ammonia and carbon dioxide. It is primarily used to distinguish urease-positive Proteeae from other Enterobacteriaceae. Urease is a constitutively expressed enzyme that hydrolyzes urea to carbon dioxide and ammonia. 13
14 (NH 2 ) 2 CO + H 2 O CO 2 + 2NH 3 Urease test media contain 2% urea and phenol red as a ph indicator. An increase in ph due to the production of ammonia results in a color change from yellow (ph 6.8) to bright pink (ph 8.2). Christensen s Urea Agar Ingredient Peptone Dextrose Sodium chloride Potassium phosphate, monobasic Urea Phenol red Agar Amount 1 g 1 g 5 g 2 g 20 g g 15 to 20 g -Distribuire 5 ml di Christensen's Urea Agar in tubini sterili da 13 ml e lascirli solidificare in modo da formare un becco di clarino. - Inoculare il ceppo mediante semina con ansa sterile. - Incubare per una settimana a 37 C e osservare la formazione di colore ROSA = POSITIVO GIALLO = NEGATIVO 14
15 1. CRESCITA IN PRESENZA DI ANTIBIOTICI 8 Esperienza (22 Maggio 2013) Il ceppo batterico verrà cresciuto sugli antibiotici Ampicillina (Amp) e Tetraciclina (Tet) 1. Ciascun gruppo dovrà preparare una piastra di Nutrient Agar addizionata di Ampicillina (100 µg/ml) e una addizionata di Tetraciclina (50 µg/ml). Lasciar asciugare la piastra sotto cappa per minuti Suddividere la piastra in 4 quadranti e seminare mediante striscio con ansetta sterile monouso un ceppo batterico in un quadrante. Osservare crescita dopo 3-5 giorni di incubazione 2. TEST DI RIDUZIONE DEL NITRATO E DENITRIFICAZIONE Molti ceppi batterici sono in grado di utilizzare il nitrato come accettore di elettroni nella respirazione anaerobica, convertendolo a nitrito. Questa reazione avviene ad opera dell enzima NITRATO RIDUTTASI. NO e - + 2H + NO2 - + H2O La presenza di ossigeno disciolto nel mezzo previene la riduzione del nitrato -> per questo motivo il mezzo di coltura deve contenere agar. Il metodo utilizzato dà un informazione qualitativa. 1. Crescere il ceppo batterico in mezzo liquido contenente KNO 3 0,1 % e agar 0,17 %. 2. Aggiungere alla coltura batterica così cresciuta 1 ml di soluzione A e 1 ml di soluzione B. La soluzione A contiene acido sulfanilico e la soluzione B dimethyl-alpha-naphthylamina che reagiscono con il nitrito eventulamente presente nel brodo di coltura dando un colorazione rosarossa. La comparsa di colore rosa indica la presenza di NITRITO. 3. Nel caso non si osservi formazione di colore, aggiungere polvere di zinco e mescolare il tubino. Questa reagisce con il NITRATO eventualmente presente nel mezzo e lo precipita formando un colore rosa-viola. 4. Se non viene dimostrata la presenza né di nitrato né di nitrito, probabilmente vi è stata denitrificazione (formazione di N 2 ). 3. Controllo dei prodotti di PCR Caricare su gel (agarosio, 1%) 5 µl di campione. Corsa elettroforetica a 100V per minuti 15
16 9 Esperienza 27 Maggio 2013 ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis Digestione con enzimi di restrizione (AluI e HhaI): Sample Buffer 10X (10 µl) 1X Enzima 0.5 µl H 2 O to 30 µl Ciascun gruppo prepari due MASTER MIX (una per AluI e l'altra per HhaI) per il n di amplificati che digerisce + un volume vuoto Incubare a 37 C per 3 ore Verifica del profilo di restrizione ottenuto su gel di agarosio 1.5% (in TBE) - La corsa elettroforetica viene condotta in tampone TBE 1X per circa 2 ore a 70 V - Colorazione del gel mediante lavaggio in Tampone TBE 1X + ETBr (1 g/l) per 30 min Preparazione dei campioni da caricare su gel per ARDRA Utilizzare 25 µl della digestione + 5 µl di LD 16
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