Tecniche immunochimiche

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1 Tecniche immunochimiche Diagnostica biochimico-clinica clinica Lezione 4

2 Risposta immunitaria Il sistema immunitario serve per distinguere ciò che è proprio (self) da ciò che è estraneo all organismo (not self). Qualsiasi molecola o organismo patogeno capace di indurre una risposta immunitaria è detto antigene.

3 Immunogenicità e Antigenicità ANTIGENE: molecola che, introdotta in un organismo, è in grado di attivare la risposta anticorpale. Gli antigeni sono tipicamente macromolecole solubili in acqua e che possiedono un alto grado di complessità chimica. Le proteine eterologhe (cioè, provenienti da organismi diversi) di massa molecolare >10000 Da sono generalmente degli ottimi antigeni, mentre i piccoli peptidi non sono di solito antigenici. Due sono essenzialmente le proprietà di un antigene: IMMUNOGENICITÀ: capacità di indurre una risposta immunitaria ANTIGENICITÀ: capacitàdi reagire in maniera specifica con i prodotti finalidelle risposte immunitarie(anticorpi e/o recettori di membrana)

4 Immunogenicità e Antigenicità Da che cosa dipende l immunogenicità di una sostanza? Estraneità: il sistema immunitario è in grado di discriminare il self dal non self, di conseguenza, le molecole estranee ad un determinato organismo hanno capacità immunogenica; Specie animale: le proprietà immunogene di un antigene variano a seconda della specie animale utilizzata per la produzione di anticorpi; Peso molecolare: più è elevato il peso molecolare della molecola in esame e maggiore sarà la possibilità di avere una risposta immunogenica; Degradabilità: macromolecole insolubili sono più immunogene di quelle piùpiccole e solubili, poichévengono piùfacilmente fagocitate ed elaborate dal sistema macrofagico; Complessità chimica e strutturale delle molecole: l eterogeneicità chimica apporta immunogenicità. Omopolimeri hanno bassa immunogenicità se confrontata con eteropolimeri dello stesso peso molecolare. Gli antigeni proteici risultano tanto più immunogeni quanto più sono complessi i loro livelli di organizzazione molecolare (struttura terziaria e quaternaria).

5 Risposta immunitaria Anche se le cellule B vivono pochi giorni a meno che non siano stimolate dal loro antigene, alcune cellule B con memoria riconoscono il loro antigene dopo settimane o anche dopo anni, producendo una risposta immunitaria più rapida e massiva (risposta secondaria).

6 Risposta immunitaria La risposta immunitaria umorale è mediata dagli anticorpi (immunoglobuline), glicoproteine che possiedono domini costanti e domini variabili, in grado di riconoscere antigeni specifici che sono prodotti dai linfociti B.

7 Risposta immunitaria Il sistema immunitario è storicamente separato in due rami: immunità cellulare e immunità umorale. L'immunità umorale è mediata da molecole in soluzione (anticorpi e complemento). L'immunità cellulare è quella mediata da cellule, come i neutrofili e i macrofagi che sono in grado di fagocitare e distruggere materiale estraneo.

8 Le immunoglobuline differiscono a livello delle catene pesanti Gli anticorpi, prodotti dalle plasmacellule, appartengono al gruppo di proteine note come immunoglobuline (Ig), classificabili in cinque diverse classi: IgG, IgA, IgM, IgE, e IgD. Le 5 classi di Ig differiscono per il tipo di catene pesanti e per lacomposizione in subunità.

9 Funzioni delle immunoglobuline IgD:Ig di membrana. Concentrazione bassa nel siero. Funzione: segnale per la proliferazione del clone B e il suo differenziamento in plasmacellule. Valori: 3 mg/dl IgE:estremamente bassa nel siero. Responsabili dei fenomeni di ipersensibilitàdi tipo immediato (es. reazioni allergiche). IgE+ allergene liberazione di istamina. Valori: 30 µg/dl

10 Funzioni delle immunoglobuline IgG:maggior classe presente nel siero (80%) sono le uniche Ig che passano dalla madre al feto attraverso la placenta Valori: mg/dl IgA:concentrazione bassa nel siero, alta nelle secrezioni (saliva, latte, secrezioni intestinali) Valori: mg/dl IgM: PM circa Da molecole complesse risposta immunitaria primaria sono presenti oltre che nel siero anche sulla membrana dei linfociti B (Ig di membrana) Valori: mg/dl

11 Struttura delle IgM Le IgM, le prime ad essere secrete in risposta all antigene, sono costituite da 5 molecole a forma di Y disposte intorno ad una subunitàcentrale J. Sono efficaci contro i microrganismi.

12 Struttura delle IgG Gli anticorpi strutturalmente più semplici sono le IgG, glicoproteine costituite da due catene leggere (L) e due catene pesanti (H) che interagiscono mediante ponti disolfuro e interazioni non covalenti formando una molecola simmetrica a forma di Y. L enzima proteolitico papaina rompe le IgG in una regione a cerniera producendo due frammenti Fab (antigen binding) identici ed un frammento Fc (c, facilmente cristallizabile). Le IgG legano gli antigeni in tre regioni ad ansa presenti nei domini variabili.

13 Legame antigene-anticorpo L associazione tra antigene-anticorpo coinvolge interazioni di van der Waals, idrofobiche, ioniche e legami idrogeno. La specificità e l affinità dipendono da una straordinaria complementarità strutturale tra le due molecole (sistema chiave-serratura).

14 Legame antigene-anticorpo L unione che si instaura tra un antigene ed il corrispondente anticorpo porta alla formazione di quello che viene definito IMMUNOCOMPLESSO. La formazione degli immunocomplessi determina una serie di eventi finalizzati alla definitiva distruzione o neutralizzazione dell antigene.

15 Immunogenicità e Antigenicità Affinità: forza dell interazione antigene-anticorpo, misurata dalla costante di equilibrio della reazione di associazione; Reazione antigene-anticorpo: reazione dinamica e reversibile tra un anticorpo e un antigene per dare origine al complesso antigene-anticorpo. E caratterizzata da una costante di equilibrio definita; Immunogeno: sostanza antigenica che, in contatto con un ospite immunocompetente, è capace di stimolare la produzione di anticorpi specifici; Sito legante anticorpale: regione della molecola anticorpale capace di combinarsi con il corrispondente determinante antigenico; Determinante antigenico (epitopo): elemento strutturale della molecola antigenica riconosciuto dall anticorpo e capace di combinarsi con il corrispondente sito legante anticorpale; Marcatore:sostanza (radioisotopo, enzima, fluoroforoecc) che introdotta nella struttura di un reagente (antigene, aptene, anticorpo) ne consente la rivelazione.

16 Tecniche immunochimiche La specificità delle reazioni antigene-anticorpo e la sensibilità di marcatori (enzimi, isotopi, sostanze fluorescenti, radicali liberi) possono essere combinate insieme per compiere un dosaggio immunologico, ossia quantificare con precisione una sostanza antigenica, presente nei fluidi biologici.

17 Tecniche immunochimiche IMMUNODOSAGGI Metodi con marcatura (traccianti radioisotopici, enzimatici, fluorimetrici, bioluminescenti, chemiluminescenti) Agglutinazione Metodi senza marcatura Se avviene in soluzione acquosa Precipitazione Se avviene in matrice solida Diretta Se l Ag è corpuscolato (cellule,batteri) Indiretta se l Ag solubile, si fa adsorbire o legare covalentemente a carrier insolubili (e.g. sfere di lattice)

18 Reazioni di agglutinazione diretta L agglutinazione è un fenomeno dovuto all aggregazione e alla sedimentazione di un antigene dopo reazione con l anticorpo. Si eseguono quando si vuole ricercare la presenza di anticorpi nel siero di un paziente per diagnosticare una malattia infettiva (Siero immune paziente + antigene corrispondente) oppure quando si vuole identificare un microrganismo in base agli antigeni che possiede (Sospensione antigeni microbici + anticorpi specifici). Si cercano le IgM: poiché hanno una durata limitata, la loro presenza è indice di risposta immune contro una malattia in corso

19 Reazioni di agglutinazione

20 Reazioni di agglutinazione:determinazione del gruppo sanguigno Le reazioni di agglutinazione vengono utilizzate per deteriminare il gruppo sanguigno.

21 Reazioni di agglutinazione:determinazione del gruppo sanguigno La procedura consiste nel verificare la reazione del sangue di una persona con due diversi tipi di siero immune contenente anticorpi anti-a o anti-b. Su un vetrino vengono poste due gocce di sangue, ad una di esse viene aggiunta una goccia del siero "ANTI-A" e sull'altra una goccia del siero "ANTI-B". + - Se non si verifica alcuna reazione il sangue in esame appartiene al gruppo 0 (zero), se invece si ha agglutinazione solo con l anti-a è del gruppo A, se reagisce con l anti-b è del gruppo B, e se osserviamo la reazione di agglutinazione con l anti-b e con l anti-a il sangue appartiene al gruppo AB.

22 Reazioni di agglutinazione: test di Combsdiretto Il test di Combs diretto per rilevare la presenza di anticorpi fissati alla superficie dei globuli rossi viene eseguito anche per confermare la diagnosi di anemia emolitica autoimmune dove gli anticorpi attaccano gli eritrociti del paziente stesso.

23 Reazioni di agglutinazione: test di Combsindiretto Il test di coombs indiretto viene eseguito prima di una procedura medica che prevede un eventuale scambio di sangue tra due pazienti (quale una trasfusione o la gravidanza).

24 Reazioni di agglutinazione indiretta Nei test di agglutinazione indiretta l antigene solubile si fa adsorbire o legare covalentemente a carrier insolubili (eg. sfere di lattice)

25 Reazioni di agglutinazione indiretta INFEZIONE BATTERICA: ricerca della Proteina C reattiva (CRP), prodotta dal fegato In vitro lega il polisaccaride C dello Pneumococco In vivo può legare: polisaccaridi batterici, funghi, parassiti unicellulari etc Aumenta nelle malattie reumatiche di natura infiammatoria, alcuni tumori e in numerose condizioni patologiche Test di agglutinazione con un Ab anti-crp La Proteina C reattiva, contenuta nel siero, causa l'agglutinazione di particelle di lattice ricoperte di anticorpo anti-pcr.

26 Reazioni di agglutinazione indiretta

27 Reazioni di precipitazione In adatte condizioni sperimentali e con adatti rapporti stechiometrici, se un antigene solubile viene messo a contatto con un siero contenente anticorpi specifici, si può ottenere la precipitazione del complesso antigene-anticorpo, anche di peso molecolare molto elevato.

28 Reazioni di precipitazione Il reticolo si forma solo quando la concentrazione degli antigeni e degli anticorpi è ottimale cioè si creano dei ponti tra un immunocomplesso e l altro.

29 Reazioni di precipitazione Il test di precipitazione può essere effettuato in una provetta (Test di precipitazione ad anello, Ring test). Ag e Ab diffondono in provetta. L anello di precipitato si forma dove essi raggiungono la zona di equivalenza.

30 Immunodiffusione Se l immunoprecipitazione avviene in un gel di agar, piastra Petri o su un vetrino si parla più propriamente di Immunodiffusione. Metodi di immunodiffusione più comuni per il dosaggio di antigeni: Immunodiffusione radiale semplice Immunodiffusione doppia Immunoelettroforesi

31 Immunodiffusione radiale semplice L antigene diffonde nell agar in cui è presente l Ab. Si forma un anello di precipitazione il cui diametro sarà funzione della concentrazione dell antigene stesso.

32 Immunodiffusione doppia Sia l Ag che l Ab diffondono radialmente dai pozzetti scavati nell agar. Quando si raggiunge la zona di equivalenza si forma l alone di precipitato.

33 Immunodiffusione doppia Utilizzando questa tecnica (Ouchterlony test) è possibile stabilire se due antigeni hanno epitopi antigenici identici o parzialmente identici oppure se non hanno epitopi in comune. Epitopiidentici Epitopinon identici Epitopiparzialmente identici Ag Ab

34 Immunodiffusione doppia Il test di Ouchterlony test può anche essere utilizzato per stimare la concentrazione relativa degli antigeni A/S

35 Plasmaproteine dosabili con metodi immunologici

36 Immunoelettroforesi L'immunoelettroforesi è una tecnica che unisce la specificità della reazione di immunoprecipitazione con la separazione di molecole mediante elettroforesi. Solitamente si utilizza un gel d'agarosio su cui si praticano due incisioni parallele e si scavano alcuni pozzetti. Nei pozzetti si depositano gli antigeni e si fa avvenire l'elettroforesi. Al termine dell'elettroforesi, le due incisioni parallele sono riempite con un antisiero opportuno e si lascia in incubazione per una notte. Gli antigenidiffondono radialmente e gli anticorpi diffondono lateralmente dando quindi luogo ad archi di precipitazione.

37 Immunoelettroforesi L'immunoelettroforesi viene usata per indagini qualitative: Nell alterato anabolismo delle IgG(gammapatie mono- e policlonali) Nello studio delle anomalie della sintesi proteica (analbuminemia, agammaglobulinemia, ecc)

38 Metodi radioimmunologici (RIA, Radio-Immuno-Assay) Metodo, per la misura di proteine, ormoni ecc. in fluidi biologici, basato sulla competizione, tra un antigene non marcato ed una quantità nota dello stesso antigene marcato, per il legame con un numero limitato e costante di siti anticorpali (DOSAGGI COMPETITIVI ED IN DIFETTO DI REATTIVO) Antigene non marcato, Ag Antigene marcato ( 125 I), Ag * Anticorpo, Ab

39 Isotopi Il termine isotopo indica quegli elementi che posseggono un uguale numero atomico (protoni) (Z) pur avendo numero di massa (protoni+neutroni) (A) differente. Il termine più corretto per indicare una specie atomica con un nucleo formato da un determinato numero atomico e un determinato numero di neutroni N è nuclide o, se radioattivo, radionuclide. Un radionuclide è un nuclide instabile che decade emettendo energia sotto forma di radiazioni. I radioisotopi sono isotopi radioattivi, cioè radionuclidi di uno stesso elemento chimico.

40 Isotopi La radioattività è un insieme di processi fisico-nucleari attraverso i quali alcuni nuclei atomici instabili o radioattivi (radionuclidi) decadono in un certo tempo detto tempo di decadimento, in nuclei di energia inferiore raggiungendo uno stato di maggiore stabilità con emissione di radiazioni ionizzanti. Storicamente i decadimenti nucleari sono stati raggruppati in tre classi principali: decadimento alfa, beta e gamma. Nel decadimento alfa e beta cambia il numero di protoni nel nucleo e quindi il numero di elettroni che vi orbitano attorno (cambiando così la natura chimica dell'atomo stesso), il decadimento gamma avviene fra stati eccitati dello stesso nucleo e comporta solo la perdita di energia.

41 Tecniche radioimmunologiche (RIA) 1. All equilibrio, dopo aver separato l immunocomplesso marcato dall antigene marcato libero, si procede alla misura della radioattività(dosaggio dei raggi γ) delle due soluzioni: (F)= antigene free (B)= antigene bounded concentrazione nota concentrazione nota Ag * + Ab Ag*Ab (F) (B) Radioattività legata(b) radioattività libera(f) all'equilibrio(a)

42 Tecniche radioimmunologiche (RIA) Separazione dell antigene libero da quello legato all anticorpo Filtrazione su gel Precipitazione con anti Ab Centrifugazione

43 Tecniche radioimmunologiche (RIA) 2. Costruzione retta di taratura. Supponiamo di aggiungere lo stesso tipo di antigene, ma non marcato in quantità note. C 1 C 2 C 3 Aumentando la concentrazione dell antigene non marcato, favorisco la COMPETIZIONE con l antigene marcato per i siti di legame sull anticorpo.

44 Tecniche radioimmunologiche (RIA) Sempre separando l immunocomplesso dall antigene libero, si misura la radioattività delle due soluzioni monitorando lo spiazzamento dell'antigene marcato: Ag * Ab + Ag Ag*Ab+ AgAb il rapporto(b) Radioattività legata(b) Radioattività libera(f) ogni volta che si aggiunge una quantità nota di antigene non marcato, tale rapporto diminuisce all aumentare della quantità di antigene non marcato) Per differenza tra A (tutti gli Ab occupati dall Ag marcato) e B (Ab legano sia Ag radioattivo che normale) s'individua la quantità di Ag freddo legato a Ab. Maggiore è la concentrazione di Ag non radioattivo minore è la quantità di Ag* radioattivo legato all'ab.

45 Tecniche radioimmunologiche (RIA) Si può costruire una retta di taratura, che riporta in grafico tale rapporto in funzione delle concentrazioni note di antigene non marcato usate libero. Ag*Ab Ag non marcato (scala decimale) Ag non marcato (scala logaritmica)

46 Tecniche radioimmunologiche (RIA) Una volta costruita la retta di taratura si può analizzare un sistema in cui l antigene non marcato si trova in un fluido biologico a concentrazione ignota che viene determinata per interpolazione sulla retta di taratura. La concentrazione di anticorpo, in difetto rispetto alla quantità necessaria per legare tutto l antigene presente e la concentrazione di antigene marcato sono entrambe note. La tecnica del dosaggio radioimmunologico è comune in vari ambiti clinici: diagnosi del diabete (dosaggio insulina), dell ipertensione, di patologie correlate a disfunzioni tiroideee dell'ormone della crescita, dosaggio nel sangue di sostanze stupefacenti o applicazioni forensi (antidoping).

47 Applicazioni RIA in biochimica clinica

48 Tecniche radioimmunologiche (RIA) Vantaggi del RIA Si dosa qualsiasi composto che sia però disponibile anche in forma marcata Elevata sensibilità(pg/ml) Elevata specificità Elevata precisione Procedura automatizzata, quindi analisi di elevato numero di campioni Svantaggi del RIA Costo elevato di apparecchiature e reagenti Durata dei reagenti Pericoli radiologici legati all uso del radioattivo Tempi di risposta lunghi

49 Metodi immunoenzimatici(eia, Enzyme immunoassay) Gli antigeni sono marcati non con radionuclidi ma con enzimi. Il dosaggio avviene con tecniche spettroscopiche. L'ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) è una tecnica molto utilizzata, basata sulla coniugazione chimica di enzimi (quali ad es. la fosfatasi alcalina o la perossidasi) con anticorpi o antigeni. L attività di questi enzimi è facilmente monitorabile e consente di quantificare la concentrazione di complesso coniugato ( marcato ) con facilità e precisione.

50 Metodi immunoenzimatici(eia, Enzyme immunoassay) A seconda del particolare metodo utilizzato, l ELISA può servire per il dosaggio di antigeni o anticorpi. L antigene o anticorpo è riconosciuto da un anticorpo secondario (detection ab) marcato con un enzima (Enzyme linked), capace di dare una reazione il cui prodotto sia colorato.

51 Diagramma di processo del dosaggio ELISA

52 Diagramma di processo del dosaggio ELISA

53 Diagramma di processo del dosaggio ELISA

54 Diagramma di processo del dosaggio ELISA

55 Dosaggio ELISA Gli enzimi più comunemente usati sono la perossidasi di rafano (HRP) o la fosfatasi alcalina(ap). I substrati enzimatici dovrebbero essere idealmente stabili, non tossici e poco costosi: substrati non colorati sono convertiti in prodotti colorati (es. OPD,arancio e TMB, blu).

56 Dosaggio ELISA Tipi di ELISA DIRETTO (Anticorpo primario marcato) INDIRETTO (Anticorpo secondario marcato) COMPETITIVO DIRETTO SANDWICH ELISA DIRETTO SANDWICH ELISA INDIRETTO

57 METODO ELISA DIRETTO In questo metodo, che consente di titolare un antigene, è un anticorpo primario che deve essere coniugato con un enzima indicatore. Si fa reagire una soluzione di un anticorpo specifico marcato con un enzima con un antigene ancorato ad una fase solida. Substrato Ag Ab primario coniugato Dopo aver lavato, si aggiunge il substrato dell'enzima. In questa tecnica, l'attività enzimatica misurata sarà direttamente proporzionale alla quantità di antigene presente.

58 METODO ELISA INDIRETTO Serve per titolare un anticorpo, anziché un antigene. E l anticorpo secondario ad essere coniugato all enzima. Il materiale da dosare (ad es. un siero umano contenente IgG) viene fatto reagire con l apposito antigene legato ad una fase solida. Dopo reazione del siero con l antigene immobilizzato, il materiale che non si è legato viene rimosso mediante lavaggio. Si aggiunge poi un anticorpo anti-iggumane coniugato con un enzima. Si lava di nuovo e si aggiunge substrato dell enzima: l attività misurata sarà direttamente proporzionale alla quantità di anticorpo specifico presente nel siero originale.

59 METODO SANDWICH ELISA DIRETTO Questa metodica può essere utilizzata esclusivamente quando l analita possiede almeno due epitopi. Un eccesso di anticorpo verso il primo sito antigenico viene immobilizzato sulla fase solida e incubato con diluizioni successive di antigene presente nel campione incognito. Dopo il lavaggio, il complesso AgAb immobilizzato viene incubato con una concentrazione fissa di anticorpo marcato che andrà a legarsi al secondo sito antigenico dell immunocomplesso. La misura del prodotto della reazione enzimatica risulterà direttamente proporzionale alla concentrazione dell antigene da stimare.

60 METODO SANDWICH ELISA INDIRETTO Si fa reagire una soluzione ignota di antigene con un anticorpo specifico legato ad una fase solida, si lava e si aggiunge un secondo anticorpo (che dovrà essere policlonale oppure dovrà essere un anticorpo monoclonale diverso da quello immobilizzato, capace di riconoscere un diverso epitopodell'antigene). Substrato Ag Dopo un secondo lavaggio si aggiunge un terzo anticorpo, capace di legarsi al secondo e marcato con l enzima; dopo opportuni lavaggi, viene aggiunto il substrato dell'enzima. In questa tecnica, l'attività enzimatica misurata sarà direttamente proporzionale alla quantità di antigene presente.

61 METODO ELISA COMPETITIVO DIRETTO Una quantità fissa di antigene marcato (blu) e diluizioni decrescenti di antigene libero (come standard o nel campione, rosso) vengono messe a reagire insieme nei confronti di un anticorpo in difetto. In questo modo, l antigene marcato e quello libero si troveranno a competere per un numero limitato di siti anticorpali. Dopo aver lavato il complesso, si aggiunge il substrato per l enzima e si misura l attività enzimatica. La concentrazione del prodotto enzimatico misurata risulteràinversamente proporzionale alla concentrazione dell analita(antigene non marcato).

62 DIPSTICK ELISA Il saggio ELISA può essere semplificato mediante l utilizzo di strip su cui sono immobilizzati gli Abo gli Ag.

63 Applicazioni ELISA in chimica clinica Ricerca di proteine nel plasma a basse concentrazioni, dosaggio del ferro nel siero, ricerca di anticorpi (anti-hiv), ricerca di ormoni come insulina, estrogeni, gonadotropina corionica umana, antigeni di superficie delle epatiti, etc.