Controllo microbiologico degli alimenti: metodi a confronto

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Virgilio Bonetti
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1 Fiera di Cremona, venerdì 17 aprile 2009 Controllo microbiologico degli alimenti: metodi a confronto Valerio Giaccone Facoltà di Medicina veterinaria Università di Padova Dal 1 gennaio 2006 è entrata in vigore la normativa comunitaria sull igiene delle produzioni alimentari (pacchetto igiene) Due figure per il controllo degli alimenti l Operatore del Settore Alimentare (OSA) 1

2006 è entrata in vigore la normativa comunitaria sull igiene delle produzioni alimentari

2 Due figure per il controllo degli alimenti l Autorità Sanitaria di Controllo Il controllo dell igiene delle produzioni alimentari non si fa più analizzando a campione le partite di alimenti prodotti Il controllo dell igiene delle produzioni alimentari si fa tenendo sotto controllo il processo produttivo (compito dell OSA) 2

campione le partite di alimenti prodotti Il controllo dell igiene delle

3 Se l OSA può dimostrare che tiene sotto controllo i suoi processi produttivi si parte dal concetto che tutte le partite di alimento sono salubri Lo strumento col quale l OSA tiene sotto controllo i suoi processi produttivi è la metodologia HACCP In teoria, se si riesce a fare un ottimo HACCP non c è bisogno di fare alcuna analisi di laboratorio per ottenere conferme 3

sotto controllo i suoi processi produttivi è la metodologia HACCP In teoria, se si riesce a

4 In pratica, analisi di laboratorio mantengono il loro ruolo ma servono tecniche diagnostiche più semplici, rapide e predittive Fino agli anni 60 del 1900 si sono ricercati soprattutto i patogeni Dal 1960 al 1990 si sono studiati anche i microrganismi alteranti e quelli utili Filoni di ricerca della microecologia degli alimenti 4

ricercati soprattutto i patogeni Dal 1960 al 1990 si sono studiati anche i

5 Processi di fermentazione e alimenti probiotici Sviluppo di ceppi microbici con attività metaboliche volute, con tecniche di ingegneria genetica Sviluppo di ceppi di batteri lattici resistenti all attacco di virus batteriofagi Ingegneria genetica per ottenere ceppi microbici in grado di produrre grandi quantità di particolari composti (es. alcool) Sequenziamento del genoma di importanti ceppi di batteri lattici e di virus batteriofagi Impiego dei batteri lattici in sintesi di proteine immunitarie Sviluppo delle tecniche di bioconservazione degli alimenti 5

in grado di produrre grandi quantità di particolari composti (es.

6 Studio dei caratteri fisiologici e biochimici di microrganismi probiotici Sviluppo di nuove tecniche più efficaci per la coltura dei batteri lattici Processi di alterazione degli alimenti Identificazione di nuovi alteranti, la cui crescita è favorita dalle nuove tecniche di conservazione degli alimenti Studio delle alterazioni degli alimenti indotte da esoenzimi batterici 6

alimenti Identificazione di nuovi alteranti, la cui crescita è favorita dalle nuove tecniche

7 Studio degli stress letali e subletali sulla vitalità dei microrganismi e sulla comparsa di forme di resistenza stress-indotte (compresa l antibiotico-resistenza) Nuove tecniche molecolari per identificare i metaboliti prodotti dai microrganismi alteranti (chemiometria) Malattie alimentari Sviluppo di nuove metodiche per l identificazione di microrganismi patogeni in alimenti inquinati Metodi per l individuazione rapida ed efficace dei virus agenti di malattia alimentare Importanza degli stress ambientali nell aumento o nella diminuzione di virulenza dei microrganismi patogeni per l uomo 7

alimentari Sviluppo di nuove metodiche per l identificazione di microrganismi patogeni in alimenti inquinati Metodi per l individuazione rapida ed

8 Fattori di adesione dei microrganismi patogeni alle superfici di lavoro e agli utensili Metodi più efficaci per l epidemiologia applicata alle malattie alimentari (Human Illness Attribution) Metodi rapidi per la ricerca di microrganismi e loro tossine negli alimenti Le tecniche tradizionali di isolamento e/o conteggio in coltura cedono il posto alle metodiche rapide 8

Attribution) Metodi rapidi per la ricerca di microrganismi e loro tossine negli alimenti Le

9 Le tecniche rapide permettono di ottenere gli stessi risultati di quelle tradizionali ma in tempi molto più rapidi e con bassi costi economici Tecniche immunoenzimatiche Metodi di immunofluorescenza Metodi RPLA (Rapid Plate Latex Agglutination) Tossine batteriche (S. aureus, B. cereus) 9

economici Tecniche immunoenzimatiche Metodi di immunofluorescenza

10 Adsorbimento/separazione immunomagnetica EIA (Enzyme ImmunoAssay) o ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Sistemi Vidas e Mini-Vidas Anche le tecniche diagnostiche rapide hanno svantaggi e inconvenienti Funzionano bene solo se la carica del patogeno è piuttosto alta Esempio : metodi in impedometria o PCR in Real Time 10

diagnostiche rapide hanno svantaggi e inconvenienti Funzionano bene solo se la

11 I metodi rapidi sono troppo sensibili e provocano risultati falsi positivi Esempio : sistemi immunoenzimatici tipo Vidas Misurazione indiretta della Carica Microbica Conoscere le cariche microbiche (specifiche e aspecifiche) di un alimento è essenziale per formulare un giudizio di idoneità igienico-sanitaria 11

Carica Microbica Conoscere le cariche microbiche (specifiche e aspecifiche)

12 Le metodiche tradizionali di conteggio in piastra sono costose e richiedono ore per arrivare al risultato È per ovviare a questi problemi che si sono sviluppati metodi di conteggio rapidi alternativi Metodi per conduttimetria o impedometria Bactometer 12

questi problemi che si sono sviluppati metodi di conteggio

13 Questi metodi permettono di conteggiare solo una CMT aspecifica ma usando terreni selettivi si può arrivare a conteggiare anche cariche specifiche I due sistemi sono più rapidi di quelli tradizionali ma risultano piuttosto imprecisi nella determinazione della carica Tecniche per bioluminecenza ATP-metria 13

due sistemi sono più rapidi di quelli tradizionali ma risultano piuttosto

14 Misurano il contenuto di ATP del campione che si ammette essere solo quello prodotto dai microrganismi Sistemi come l ATP-metria sono adatti per misurare la carica microbica presente sulle superfici di lavoro Il metodo è in grado di rilevare cariche batteriche anche piuttosto basse (fino a ufc/cm 2 di superficie) 14

carica microbica presente sulle superfici di lavoro Il metodo è in grado di

15 Il metodo è abbastanza affidabile, ma si possono creare false positività sulle superfici ricche di sostanza organica Tecniche di biologia molecolare Sonde a DNA Piccole sonde di nucleotidi che riconoscono i principali patogeni alimentari (Salmonella, L. monocytogenes, E. coli ecc.) 15

molecolare Sonde a DNA Piccole sonde di 200 4.

16 Come tutte le altre prove genomiche si rischia di individuare anche segmenti specifici del DNA di microrganismi ormai morti Tecniche di PCR Non richiedono più arricchimenti e individuano con assoluta certezza qualunque ceppo microbico si voglia cercare Il loro maggiore problema è che il DNA è termostabile per cui si rischia di rilevarlo anche se i microrganismi sono stati inattivati dal calore 16

assoluta certezza qualunque ceppo microbico si voglia cercare Il loro maggiore problema è che il

17 Con la PCR in Real Time si può anche arrivare a quantificare la carica specifica di qualsiasi batterio agente di malattia alimentare La chemiometria Punta a valutare presenza e proliferazione di microrganismi misurando per via chimica specifici composti da essi liberati nel substrato 17

chemiometria Punta a valutare presenza e proliferazione di

18 Attualmente sono stati studiati sistemi diagnostici soprattutto per valutare i processi di putrefazione in carni e prodotti ittici freschi I principali composti che si possono cercare e misurare si possono così riassumere Acido acetico, acido lattico, acido gluconico Acido lattico totale e D-lattato Etanolo e altri composti alcolici Amminoacidi, ammine biogene, ammoniaca 18

e misurare si possono così riassumere Acido acetico, acido lattico, acido gluconico Acido

19 Acetone, composti metilici e chetoni Composti solforati (dimetilsolfuro, acido sulfidrico) La chemiometria può svelare incipienti stati di putrefazione ancora non rilevabili e perfezionare i risultati delle prove di determinazione della shelf-life Svantaggi della chemiometria individuare i composti da cercare, secondo il processo biochimico 19

rilevabili e perfezionare i risultati delle prove di determinazione della shelf-life

20 Svantaggi della chemiometria non puntare le determinazioni sui soli metaboliti dei microrganismi Svantaggi della chemiometria è analiticamente complesso e costoso eseguire queste determinazioni Possibili strumenti per fare chemiometria biosensori (rilevano una specifica reazione biochimica) 20

analiticamente complesso e costoso eseguire queste determinazioni

21 Possibili strumenti per fare chemiometria naso elettronico (connessione di molti sensori di singole molecole) Possibili strumenti per fare chemiometria sistema a raggi infrarossi di Fourier (FT-IR) Per concludere 21

22 In microbiologia i sistemi diagnostici rapidi stanno velocemente soppiantando le tecniche di laboratorio tradizionali Le tecniche moderne assicurano risultati più precisi, più rapidamente con minori costi di gestione e minore impatto ambientale (riduzione della plastica) Le più promettenti sono le tecniche di biologia molecolare applicate al DNA Valide anche le tecniche immunoenzimatiche 22

23 Nessuna di queste tecniche è del tutto scevra di problemi Sono dei limiti le cariche microbiche basse e l eccessiva sensibilità (risultati falsi positivi) Per sviluppare al meglio nuove tecniche diagnostiche è indispensabile anche conoscere meglio i microrganismi oggetto della ricerca Per sviluppare al meglio nuove tecniche diagnostiche è indispensabile anche conoscere al meglio i processi biochimici che avvengono negli alimenti 23

24 Grazie per la Vostra attenzione! 24

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