Titolo del progetto: L;LT ISOPROSTANI COIITE POSSIBILI MEDIATORI DI FIBROSI EPATICA E POLMONARE

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1 $eheda di pr.esentazione del pt'ogetfo Titolo del progetto: L;LT ISOPROSTANI COIITE POSSIBILI MEDIATORI DI FIBROSI EPATICA E POLMONARE Obiettivi del Progeflo: Il progetto si inquadra nelle tematiche mirate a chiarire il ruolo dgli isoprostani nell-rnsorgenza e progressione della fibrosi ln partrcolare. i principali rtsultati attesi sono i I Àumentati Iivelli cli isoprostani plasmatici e urinan in alcune forme di epatopatie acute (soprattutto su base tossicai e croniche (soprattutto le epatopatie alcoliche). 2) Individuazlone di recettori per gli F.,jisoprostanr sui miofibroblasti epaticí La presenza di tali recettori aprirebbe la strada a dei reali tentatir i terapeuticr 3) Aumenìati li'elli di g-epi-pgf:a ed 8-epi-PGE2 nel liquido di lavaggio bronchiale (BAL) di rattt intossicari con bleomicina ed eventuale correlazione fra rsoprostani nel BAL e contenuto di collagene poirnonare. 4) lncremento della sintesi di collagene da parte dei fibroblasti polmonari stimolati con lsoprostanr' 5) presenza di isoprostani nell'espiratr: sondensato in varie patologie poltnonart dell'uomo. Tali risultati, se rttggiunti, ptltrehhero p{n"tùt"e un nr;tevolc contribulo olla tnnytrensione dei nteccant,sntr Txttogenìi,t'ici ttalli.lihrtxi fuitirztsi tpariut a.fihutsi gtolnu;nurai, e.varehherts cli grattda.riginalita e nleirrnzct, perchè chiarirehher() verafiîenle i! rappt;rlo lrú slre.t"s tts.siclalivrt e.fihrosi. Responsabite del raggiungimento degli obiettivi del progetto: DOTT,SSA CONCETTA GARDI Descrizione elel progetto di ricerca (per il quale è necessaria loattivazione della presente richiesta) in termini di: l) impano su altre linee di ricerca; 2) impatto sulle strutture organizzative coinvolte nel progetto. E, noto che un'aumentata deposizione di collagene e di altre proteine della matrrce extraceliulare è una caratteristica di molte affeziàni croniche che interessano il fegato, il polmone" le arterie ed il srstema nervoso. La connessione fra stress ossidativo (SO) e rperproduzione di collagene è largamente documentata in letteratura (l-3) ed è ormai noto che prodotlr della perossidazione lipidica quah maloniidialdeide (MDA) e 4-idrossinonenale (HNE) stimolano la produzione di collagen e di nrna per ^Uno il collagene alfa'l(i'). dei próblemi che per molti anni non ha perrnesso I'applicazione nella patoiogia umana. almeno su larga scala. della valutazione dello So è stata la nrancanza di un metodo affidabiie e non invastvo per -oìito.up ia perossrdazione lipiclica in vir,, con il solo uso del sangue e delle urine. lnfatti tutti I metodi usad (dieni coniugati, lipoperossidi ed aldeidi) sono assai poco affrdabili quando eseguiti nel piasrna 14), data l'estfema reattività e fugucità delle specie mcrlecolari uhe si devono dosare, oppufe implicano'l'utilizzo di tessuto e quindi di{frcil*ente praticabili nell'uomo. Questo problema e suto,up"ruto con la scoperra (5, 6) degli F-isoprostani. Alcuni anni fa infatti il gruppo di Morrow- e Róberts If (5,7) ha dinrostratc la forrnazione cli tutta una serie di composti simili aile prostagianciine Fz' chiamati Fr-isoprostanr. che si originano in t,iíro ed in vit'o dalla perossidazione dell'acido

2 2 arachidonico der fosfolipidi cti membrana, perossidazione non catah,zzata dalla via della cicloossigenasi, ma rnnescata dar radrcali liberi. Poichè gli isoprostani sono rilasciatin circolo e sono assai meno reaîfivi di altri prodotti di perossidazione (lipoperossidi e aldeidi)' essr possono essere ritrovati assai piir agevolmente nel plasma e nelle urine Perciei oggi essi sono consideratl collìè i ntarker.g piu attendiélti. non invasivi di SO (perossidazione lipidica) e possono essere usati per valutare lo stato ossrdativo in molte patologie umane. Elevati livelli di isoprostani sono stati rilevati in varie malattie (8) Oltre che rnorker.s di SO, gli F2-isoprostani si sono dimostrati essele mediatori di importantt effetti biologici: il primo acl essere rrvelato è stato l'effetto vasocostrittore sulle ar-teriole glomeruiarr renali. comsdimostrato direttamente (8,10) dall'intusione nell'arteria renale di 8-epi-PGF2,, (l'isomero piu rappresentato di tutta la serie). Esso agirebbe attraverso l'attivazione di recettori analoghi a quelli del trombossano A2 (TxA2r) (10) Questo effeno è assai importante per la spiegazione de11a slndrome Epato,Renale {11), nella quale si avrebbe ia prociuzione di F:-isoprostani nel fegato, i quali nel rene' attraverso I'effetto u*o"ort.ittore. darebbero il quadro conclamato di insufficienza renale. Altri effettr biologici importanti esercitati <tall'8-epi-pgf:r, sono quelli sulle cellule muscolari vascolari (sempre artraverso recettori simili al TxA2r) nelle quali stimcla la sintesi dr DNA e la prolifetazione cellulare' queili sulle cellule endotehali nelle quali stimola la produzione di Endotelina l, la srntesi del DNA e la proliferazione cellulare (12,13)* quétlisuivasr retinici nei quah induce vasocostrizione. produzione dr Endotelina 1 e di TxA2 (14). Infine l'8-epi-pgf2,, sembra rnediare l'aumetrtata produzione di TGIBI in cellule mesangrali e glomerulari esposte ad un elevato ambiente di glucosio (15). come nel diabels da streptozotocina. ii nostro gruppo, che 4a vari decenni studia lo $O (16). ha acclutsito larga esperienza esperienza sullir gu, di massa. e in particolare nel dosaggio degll F2-isoprostani (17' l8) ira i "ro.utogiafia-spettrometria principali obiettivi. il programma si propone quindr di studiare: A) Gii F2-isoprostani come nwrkers di SO in varie parologie umane nelle quali qussto processo è stato chiamato ln causa" senza ancora risultati definitivi In particolare, nelle epatopatie acute e croniche (forme croniche attrve in particolare ed epatopatie alcoliche) per vedere se I'eventuale presenza di isoprostani plasmatici (urinari) sra da ricollegarsi ad un incipiente sviluppo dl cinosi. Un certo numero di casi sono stati studrati nel noslro laboratorio con eslto assat prometîente- ma per arere informaztonl su quesro possible colleganrento dobbiamo aumentare fortemente il numero di casi studiati. E' da aggiungere anche che in ratti intossicati acutamente con alùool etilico il livello di F2-isoprostanr piasmaiici aumenta di 4.5 volte rispetto ai controlli {Comporti et al. risultatr non pubblicati), confermando cosi i nostn vecchi rt,rdi indi"unti che la per$ssidazicne lipidica è un fattore cruciaie nella epatotossicità da etanolo ( l9i. B) Gli F2-lsoprostani come possibili mediatori cl fenomeni che conseguono a danni verosimilmente eiovuti a SO ed in par-ticolare fibrosr poichè, come sopfa riferito, è stato rrportato che prodotti aldeidici di perossidazione inducono processl iii elpression e sintesi di collagen., ubbi*rno voluto vedere se effetti analoghi vengono ottenuti con gli F2-isàprostani. Da un punto di vista speculatrvo il vantaggio degli isoprostani sulle aldeidi e rappresentato dal t'atto che gli isoprostani presentano recettori che possono mettere in moto ben prectse vie di trasduzione del segnale, mentre le aldeidi possono interagire con macromolecole cellulari solo eon processi di addizion e condensíìzlone. RecÀntemente. abbiamo dimostrato (20) che il livello di isoprostanr plasmatici (che è drammatrcamente aumentato (18" 2l) nell"intossicazione acuta con CCl"r ) sr nrantien eievato tn un modello di intossicazione cronica con CCll portante a chiara fibrosi e cirrosi- e si correla all,incremento di collagene epatico. In studi paralleli, abbianro dinrostrato (20) che l'aggiunta di rsoprosrani a colure di Cellule stellate epatiche (CSE) attivate al fenotipo m-v-tt/íhrtthlast-íike (positivita all'cr-actina del muscolo liscio, a,-sma) induce un marcato aumento della proliferazione cellulare

3 -i (misurata come incorporazrorre di timidina triziata) e della sintesi del collagene (mtsurata come incorporazione di prolina tnziata). Parimenti e aumentato il contenuto netto dt collagene nella colturu (valutata con il "sirius Red") 1",econcentrazioni attive in yilrtt sono tra l0-8 e 10"M. esattan'ìente uguali a quelle riffovate nel plasmanell'intossicazione vivrt. Alla luce dr questi risultati, i successivl studi si propongono di studiare: 1) la presenza di recettori per 1"8-epi-PGF:" nelle CSE (e in particolare se vengono coinvolti recettori simili a quelli del TxA2), mediante studi di hinjing, e utiliazando agonrsti e antaqonisti del recetîore per il TxA2. l) le,rie di trasduzione del segnale messe in moto dal legame dell'8-epi-pgflu con il suo recettore' C) per quanto rrguarda il pùmone. Janssen e Tazzeo (23) hanno esaminato la risposta a differentr isoprostani della serre dei'lli-ring' e"l--rin{'in arteriole polmonari umane e canine. I piu effrcienti composti si sono dimostrati essere 1'e-epi-nGEr e 8-epr-PGF:,,, che evosano az'ionl vasosostrittrici attraverso la via dr trasduzione del segnale indotto dalla tirosina chinasi e dalla Rho/Rho kinase' L' g-epi-pge: è rrsultato essere i1 più potente effettore di tutti gli isoprostanr nel1e arleriole polmonari umane e l'g-epi-pge: ed il 8-epi-PGF2(r sono ugualmentefficacinelle venule polmonart. Da quanto sopra detto sembrerebbe che i markit'"s piu specifici di stress ossldativo polmonare siano gh Fr-rsoprostanr e soprattutto gli H1-isoprostani. Pertanto ci proponiamo di valutare l'8-epi-pgf:o e l'8- epi-pgez prima nel plasma, nelle urlne e soprattutto nel hqurdo di lavaggio bronchiale (BAL) dr animali sperimentalmente intossicati con bleomrcina (che induse una fibrosi pr.rlmonare) e poi in soggetti eiposti ad ambienti di lavoro ricchi dl partrcolato con patologie poimonarr Sarà inoltre valutata la eventuale correlazione fra isoprostani e collagene polmonare, misurato sia come conrenuro di idrossiprolina, sia come sintesi (mrna con Northen blotting o con RT-PCR) precedenti studi hanno dimostrato che la fibrosi pelnronare e assai spesso carattertzzata, nel'l'ambito delle popolazioni dr fibroblasti polmonan" da un aumento di nun'lero e di volume di cellule che presenta;o frlamenti contrattili (2't-26). Queste cellule. chiamate miofibrohlasti. sono anche presenîr nella riparazione delle ferite (27-29) nella fibrosi polmonare idiopatica (30) e nella fibrosi polmonare indotta sperimentalmente cla bleomicina (26,31). ln quest'ultima si osserv'ano (26) due tipi di cellule miofibroblastiche: uno che esprime SlvfA e desmina e I'altro esprimente solo SMA" entrambi i tipi esprimono il mrna per il procollagene. Senrbra che queste cellule, che esprimono anche il mrna per il TGFB, siano da co"siderare come le principali sorgenti dell'iperproduzrone dr collagene. Quello che ancora non è chraro e Io stimolo capace ai ar scattare la differenziazione dei fibroblasti a celluie miofibroblastiche, che in condizioni normali non sono pfaticamente visibili. l) A questo proposito, saranno condotti studi ir virro su colture di fibroblasti polmonarl trattatl con isoprostani. I frbroblasti saranno isolati dal polrnone cli ratto con le metodiche già in atto nel nostro laboratorio (32). Una parte clelle colture verranno trattate con gh F2-isoprostani nei primi giomi dr coltura per vedere se gli isoprostani siano in grado di intervenire sulla eventuale trasformazione dei fibroblasti al fenotrpo"mioflibroblastico. Tale fenotipo sarà evidenzrato dalla comparsa dei classici marcatori dl attivazione, e cioè u.-sma e/o desmina. Se non sarà possibile osservare tale tiasformazione fenotipica parîendo da frbroblastinormali, allora si partirà da fibroblasti ottenuti da ratti trattati con bleomicina. neì quali, come si e detto sopra, sono visibili gia ai primr giomi di trattamento miofibroblastr esprrmenti SMA e desmrna. Fotremo allora vedere se gli isoprostani accelerino ia trasformazione fenotipica e I'espressione del rnrllia per il procollagene' 2) I fibroblasti in coltura alía conflu enza verranno trattati con F2-isoprostani' nel range delle concentrazioni rrtrovate in virtt nelf intossrcazione da bleomicina, per vedere se tale trattamento influisca. a) sulla sintesi del DNA (rncorporazione di timrdina triziata); b) sulla sintesr di coliagene (incorporazione della prolina traiata nélle proteine collageniche" tenendo owiamente in conlo!'incorporazrone nelle prcltsrne non collageniche); c) sulla sintesi netta del collagene. d) sulia del mrna per il procollagene; e) sulla espressione del mrna per il TGFB' "rpr.rrion"

4 J L'attivazione della presente richiesta e la disponibilita di un tecnrco con provata espertenza nel campo delle colture cellulari e delle princrpafi tecnrche di biochimica e necessaria nelle varie fasi del progetto' La clisponibilita dr tale unrtà dr personale avrà sonlunque un rmpatto importante sulle altre lineee cli ricerca attualmenîe condotte dai docenti proponenti che prevedono 1'r-rtilizzo delle suddette tecniche per lo studio del ruolo dello stress ossidativo nelie patologle epatiche e polmonan. REFERENZE l) cholkier ct al.l linl Cheni lr)l{g.2(r;l:l(rt}57 2)i:lcrtossa ct al. llqratologv 19911"19:12(rl 3l }Jenciletti ct al' lìiochim Iìiophvs Acta l-9g(),(rl(ì:21{i 4i l:s{erbaucr et ul. t;ree Ilacl iliol Mcd 199 l"ll:81 5l N,{orrou et rl. N'lethocls }lnzlmol 199;t.233:16.j ól M*rrou ct rl!'r"rr,-r Nutl Ar:ad Sci tlsa l9u)2-89 1{)7:l 7) N'1,.rmrn et ll. Anal }ilochem l990-18'l l li) lìoherlsiletal. lnl.rcclìailchcmlliolmed Yoshikarvacral eds.2()0().p329 9)Morror.rctal l)rtrcnatlacadsci usa igi)0.g7:g3g3. l0) Irrkahashict al.t clin lnr.esr () l3lr lir Ib]t et al Kiduer kit 1999"55:271 12'l"ukunaga et al,\mjphvsitl1l9()3.2l.l.cl6tql1}[jirt;r'urugacrl1jcltrc1irrvaxc,plriìmraqil1l()(}5^2iis51l,1ìi","rhare.,et 1!)9tJ..13:l40(l,l5)Mtlntcrtlctal-Kldnerlnt2(X){).58:19ti3,[ri}Llonrptlt1ir.ltaiu'l.<trtcoltlgrtr1.thcI,ircreris.199tt.p22I.I7)stgntrrinietal.llvitssSpcctnlltt2(X)j.38'l{kiT,llrlLìrrrrrptrrtre[alI.tr:cRad.lliolMed.20 19) Comptrrli ct al. l,ah ìrrr'est l(x.7.1{i:ól(; ](ìl Corrrptldi ct al [,atn' ìnr.cst 2(Xì'i.85: Ijt{l 2'll Mtlrrtru ct al 'I (.lin kr'cst ;1)jtt2.22i lrhlhsm.l.ilqrarol l9li8. ó fl.2-l).lansscn t'lirtt,ctt Arrl.i l)hrsiol.ung Cell Mol PhYsiol g0:1.10(t7 Z1')Aillerctal Am.ilrhrrol9l{l,l()2:,127 25}Zhar.getal.Arn.lt}habl 199'1'l'-15:ll'1 26)Zhangetal A'r.Tphar.l l995.l47:1527t l)nrbr er rrl!.*b lnvest ll)9(.i.íì3:21 28) Wclch ct al.l['cll]iol 199() ) singeret al JCclllliol 198.tr.91{:209i -ì{})kiihiieeul Ani.ll)lrarcl;1rQl 13t{ X25731)Mrtchcl!ctal l.rhlnves{ ii)ft1l-6():6{l 32) Gardi e1 al. ljiochem Phatmacol ì:tó51) Altri Descrizione Comunità Scientifica Industrie fannaceutiche Azienda Ospedaliera Individuazione di meccanismi patogenetici legati al danno epatico e polmonare da stress ossidativo i lnoltre ci potrebbe essere una base di partenza per i allargare gli studi alle fibrosi che si ritrovano in i affuzioni del sisterna lìervoso, come la sclerosl I multipla, o la sclerosi laterale amiotrofica. I Le ncadute rn camp$ farmaceutico potrebbero i essere cfavvero rilevanti. basti pensare alla sintesi luna volta rndividrrata la struttura rnolecolare del recettore) dr prodotti capaci di bloccare il recettore stesso e di controbilanciare cosi I'effetto profibrogenico dei prodotti di ossidazrone linrdica tl ptogett" p*"ede la collaboraziotre con Cliniche i Universitarie per 1e analrsi su esplrato condensato ed altri liqurdi biologicr Termini previsti per la rta\izzations d l progett$ Data inrzio i 5/08/2007 Data ultimazione /2012 Durata del progetto...5 annt

5 l Quadro l; risorse umane! strumentali e servizi coinvolti Le persone presenti nel Dipartimento dr Fisiopatologia, Medicina Sperimentale e Sanità Pubblica" e coinvolte nella ricerca rn questrorìe sono rappi*r*ntote da n" 3 unità di personale docente, 2 dottoraiidi di ricerca in Biologia e Fiiiopatologia Cellulare (con sede ammrnístrativa nel Dipartimento). I1 personale docente afferente Oip".tl*ento e coinvolto in tale ricerca nella realizzazione ditale "t progetto e per la sua intera durata Ò rappreserrtato dal Fnrof. h4ario Compor-ti (Professore ordinario). bott.ssa Concetta Cìardi (Ricercatore Confermato) e dalla Dott.ssa Cinzia Signorini (Ricercatore Confermato). I beni utrlizzatt sono patrimonro del Dipartrmento di Fisiopatologra, X,lsdig:ina Sperimentale Sanità pubblica e parte integrante dei 3 laboratori destinati a tale ricerca (Laboratorio di Colture Cellulari, Laboratorio di Biochlrnica per lo studio della Matrrce Extrac.ellulare. Laboraîorio di Spenrometria di massa) e di laboraton ad uso comune che contengono strumentazione di base. e non, trthzzafe dai vat't gr.,ppiscientifici operanti nel Dipartimento. Il valore complessivo di tali strumentazrone si aggira sr'ri trecentocrnqualtamila euro e comprende tra I'altro: Spettrofotometri, Fluorinretrí. Ultracentrifuga e Centlfughepreparative, Microscopio a Fluorescenza, HPLC, lettore dr piastre ELISA, apparato per Real TiÀe pcr" citocentrifuga, microtomi, ed apparati per elettroforesi mono e bidimensionale" e tutti 'Ira gli apparati relarivi al trattamento sperimentale deglr animali di laboratorio. i servizi utilizzati di purtr"àtur" rilievo è lo Stabilirnento di Allevamento e Stabulazione il cui personale è direttamente gestito dal Dipartimento di Fisiopatologia, l\4edicina Sperimentale SaniÈ Pubbhca. Quadro 2. Risorse umane coinvolte piotesrùnaiita inoioiouata scientifica con esperlenza. tn colture cellulari e tecniche di biochimrcappl icate alla patologia epatica e Polnionare. E' richresta inoltre una buona conoscenza della lingua inglese I ritoro di studio I Atti"ite aa srroigere aii'irile.no àer piogetto Diploma Llniversitario Prelievo di organi e allestimento di colture primarie e secondarie biochimici per studi metabolicr - Dosaggio di isoprosani nei media di coltura e in fluidi biologici medrante gas cromatografi a-spettrometria dr massa Quadro 3. Programmnzione pluriennate delle attività fasi e sottoftrsi del Progetto Data prevista Data prevista iniztu attir.ità FASE I r 5i a) ldentificazione di recettori per isoprostani, in Particolare Per PGF:".. Note lsoprostant sul mrofibroblasti epattct La presenza di tali recetlori aprirebbe la strada a dei reali

6 tentattvterapeutlcl. b) Studio delle vre dr trasduzione del segnale messe in moto dal legame dell'8- epi-pgf con il suo recettore c) Valutazione dei livelli di isoprostanl plasmatici e urinari in soggetti affetti da epatopatie acute (soprattutto su base tossica) e croniche (soprattutto [e epatopatie alcoliche) FASE TI Messa punto di unl modello di fibrosi polmouare da bleomicina nel ratto. b) lsolamento e allestimento dr colture dr fibroblasti da polmoni di ratto. Dopo trattamento con isoprostani, nel Iotlgc delle concentrazioni ritrovate in vit'tt nelf intossi caziane da bleomicina' saranno valutati princrpali parametri fibrotici. c) Valutazione dei livelli di isoprostant nell'espirato condensato di soggettr affetti da varie patologie polmonari (COPD" asma, ARDSì -ft.s7o:t1o Individuazrone delle vie di trasduzione del segnale Aumentati livelli di isoprostan t plasmatici e urinari in alcune j forme di epatopatie. ln I collaborazione con la J sojlqpjl-slllnl t4l08i2012 I Aumentati livellidi isoprostani nel BAL di rattr intossicati con bleomicina. Eventuale correlaztone tra isoprostani nel BAL e contenuto di collagene polmonare. lncremento della sintesi di collagene da parte dei fibroblasti polmonari stimolati con isoprostani. Presenza di isoprostani nell'espirato condensato ln varle patologie polmonari dell'uomo. ln collaborazione con la Dott.ssa Sicnorini

7 Il Responsabile del Progetto Dott.ssa So.4cetta Gardi U {;"'--'(' 1 l Il Direttore del Dipartimento /Wa*+--t.\-.--.:: i,",;l /'- "ì\ -\. i-- : i- " l \'- \ i t \i. '{.', ' 'i ''.' t',i,." / "i.1 ".r,'...'

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