BEIA Helicobacter pylori IgA 20996

Transcript

1 BEIA Helicobacter pylori IgA Edizione 20/04/2013 Solo per uso professionale TECHNOGENETICS SRL N Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

2 INTRODUZIONE Il kit BEIA Helicobacter pylori IgA è un test immunoenzimatico qualitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o nel plasma umano degli anticorpi di classe IgA specifici verso il batterio Helicobacter pylori. SIGNIFICATO CLINICO Nel 1983 Warren e Marshall identificarono, in pazienti affetti da gastrite, un nuovo patogeno batterico gram-negativo che fu denominato Helicobacter Pylori. In seguito sono stati eseguiti diversi studi allo scopo di chiarire il rapporto tra l infezione batterica e patologie gastriche croniche. E stato dimostrato che il patogeno è associato all ulcera peptica, alla gastrite cronica di tipo B ed alla duodenite. Inoltre è stato dimostrato che, in pazienti affetti da gastrite, l eliminazione del batterio portava alla guarigione della lesione anatomica. Le procedure diagnostiche dirette alla rilevazione dell organismo e della patologia gastrica prevedono normalmente delle tecniche invasive (gastroscopia), tuttavia si può osservare nel paziente infetto una risposta immuno-specifica. Il test sierologico rappresenta quindi un metodo alternativo, rapido e semplice rispetto alla tecnica bioptica.numerosi studi hanno evidenziato che la concentrazione delle IgG anti Helicobacter pylori, anche se nella fase iniziale può non correlare con la severità della malattia, gioca un ruolo importante nella fase successiva di monitoraggio del trattamento terapeutico. Oltre alle IgG anche le IgA possono essere presenti e la loro rilevazione può essere di ausilio per dirimere i casi dove la determinazione delle IgG ha dato valori dubbi. Recentemente numerosi studi hanno evidenziato la correlazione tra proteine ad alto peso molecolare ( KDa ) codificate dal gene CagA ed un maggior rischio di sviluppare cancro allo stomaco ed ulcere duodenali. Pertanto la determinazione delle IgG anti-caga si rivela un test sicuramente molto sensibile per diagnosticare tali patologie. PRINCIPIO DEL METODO Il test BEIA Helicobacter pylori IgA è un dosaggio immunoenzimatico in micropozzetti. I micropozzetti di polistirene sono rivestiti con gli antigeni rappresentativi dell Helicobacter pylori. I campioni da esaminare vengono incubati nei micropozzetti; le IgA del campione si legano Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

3 formando un complesso antigene-anticorpo. Dopo eliminazione mediante lavaggio dei componenti del siero non legati alla fase solida, la presenza di IgA anti-helicobacter pylori viene rilevata attraverso il legame con un anticorpo monoclonale anti-iga umane coniugato con perossidasi. Dopo allontanamento del coniugato enzimatico non legato, viene aggiunto il substrato-tmb che, per azione dell enzima presente sulla fase solida, sviluppa una colorazione azzurra. L aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione e provoca il viraggio del colore dall azzurro al giallo. La densità ottica letta a 450/620 nm è direttamente proporzionale alla quantità di IgA specifiche presenti nel campione in esame. CONTENUTO DELLA CONFEZIONE La confezione è sufficiente per 96 determinazioni. Componente SORB A Strip da 8 micropozzetti frazionabili 12x8x1 CONTROL - B Controllo Negativo 1 x 2 ml CAL CO C Calibratore Cut-Off 1 x 2 ml CONTROL + D Controlo Positivo 1 x 2 ml DIL SPE E Diluente Campioni BEIA System 1 x 120 ml BUF WASH 20X F Tampone di Lavaggio 1 x 100 ml CONJ G Coniugato 1 x 13,5 ml SUBS TMB H Substrato-TMB 1 x 13,5 ml H2SO4 I Soluzione Stoppante 1 x 25 ml Istruzioni per l uso 1 A. Strip sensibilizzate Strip sensibilizzate con antigeni purificati da Helicobacter pylori inattivato, in busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in micropozzetti singoli. B. Controllo negativo Siero umano negativo per anticorpi IgA anti-helicobacter pylori. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

4 C. Calibratore Cut-off Siero umano a concentrazione nota di anticorpi IgA anti- Helicobacter pylori. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all uso. D. Controllo positivo Siero umano positivo per anticorpi IgA anti-helicobacter pylori. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. E. Diluente Campioni BEIA System Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante e Tween 20. Reagente pronto all'uso. F. Tampone di Lavaggio Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene 0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti. G. Coniugato Soluzione contenente anticorpo monoclonale anti-iga umane, marcato con perossidasi. Reagente pronto all'uso. H. Substrato-TMB Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante (rosa). Reagente pronto all'uso. I. Soluzione Stoppante Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8 C al riparo dalla luce. Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata sull etichetta. REAGENTI INTERCAMBIABILI Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il Substrato-TMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit della linea BEIA. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

5 MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm. Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di micropiastre. Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 1000 µl. Provette monouso e normale vetreria da laboratorio. Acqua distillata o deionizzata. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente (18-25 C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi. Evitare l'essiccamento dei micropozzetti. Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita. Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti diversi. Cambiare il puntale tra un campione e l altro. Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad azzurro, il reagente non deve essere utilizzato. Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione del campione. Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire. Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle pipette e del lettore. AUTOMAZIONE Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

6 PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA). Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni possono essere conservati a 2-8 C. In caso contrario, aliquotare i campioni e congelarli a - 20 C. Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l uso di campioni lipemici, torbidi ed emolizzati. I campioni devono essere opportunamente diluiti con il Diluente Campioni BEIA System prima del dosaggio. Vedi esecuzione del test. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Tampone di Lavaggio Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata o deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile 15 giorni se conservato a 2-8 C e comunque non oltre la data di scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di Lavaggio concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si solubilizzano portando il reagente a 37 C prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per eseguire i lavaggi dell'analisi in corso. CICLO DI LAVAGGIO Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi manualmente. 1. Svuotare completamente i pozzetti. 2. Riempirli con 300 µl di tampone di lavaggio. 3. Svuotare i pozzetti. 4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli. 5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti al termine del lavaggio. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

7 ESECUZIONE DEL TEST Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno minuti a C). 1. Diluire (1:81) i campioni in esame con il Diluente Campioni BEIA System (esempio 10 µl di siero e 800 µl di Diluente Campioni BEIA System). Agitare su Vortex. 2. Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione del numero di campioni in esame, dei Controlli e del Calibratore cut-off (vedi il paragrafo Schema del dosaggio ). Richiudere accuratamente la busta. 3. Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero prediluito in esame, dei Controlli e del Calibratore cut-off. 4. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 5. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Coniugato. 7. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Substrato-TMB. 10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 15 minuti. 11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun pozzetto 100 µl di Soluzione Stoppante. 12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm. CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA Le condizioni che consentono l accettazione dei risultati sono : il rapporto tra la DO del Controllo positivo la DO del Calibratore Cut-off deve essere > 1,5 il rapporto tra la DO del Controllo negativo e la DO del Calibratore Cut-off deve essere < 0,3 Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

8 Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute ed alla gestione di eventuali non conformità. CALCOLO DEI RISULTATI Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l index anticorpale (I.A.) con la seguente formula: DO campione Index Anticorpale (I.A.) = DO Calibratore Cut-off Per il Calibratore Cut-off calcolare, se eseguito in multiplo, il valore medio di densità ottica (mdo). I seguenti valori devono essere considerati solo come un esempio e non devono essere usati in luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore. Esempio di calcolo: 1ª DO 2ª DO mdo I.A. Controllo negativo 0,125 0,081 0,103 0,20 Calibratore Cut-off 0,511 0,503 0,507 Controllo positivo 1,095 1,072 1,083 2,14 Campione A 0,170-0,34 Campione B 0,710-1,40 Campione C 1,058-2,09 Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

9 INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi: I.A. INTERPRETAZIONE > 1,1 0,9 0,9 1,1 Il campione è da considerare POSITIVO per la presenza di anticorpi di classe IgA anti- Helicobacter pylori Il campione è da considerare NEGATIVO per la presenza di anticorpi di classe IgA anti- Helicobacter pylori ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare DUBBIO per la presenza di anticorpi di classe IgA anti-helicobacter pylori Va tenuto presente che: - il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di classe IgA. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato infettivo; - una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo test, ma va fondata sull insieme dei dati clinici disponibili; - dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione, eventualmente col conforto di test di conferma o di II livello; - risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test su un prelievo successivo; col confronto con un test di riferimento. PRESTAZIONI DEL KIT Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo previsto dal fabbricante. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

10 SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ Sensibilità e specificità sono state valutate confrontando le prestazioni del kit BEIA Helicobacter pylori IgA nei confronti di un kit già immesso sul mercato con prestazioni accettabili (EIA Helicobacter pylori IgA). BEIA Helicobacter p. IgA EIA Helicobacter p. IgA Da questi dati si ottiene: Sensibilità relativa 87,3% Specificità relativa 91,7% Concordanza 90,4% SPECIFICITÀ ANALITICA Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10 mg/ml di emoglobina, fino a 1 mg/ml di bilirubina e fino a 30 mg/ml di trioleina. L uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati viene comunque sconsigliato. RIPETIBILITÀ La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata valutando un campione negativo con I.A. < 0,5 e due campioni positivi rispettivamente con I.A. di circa 1,5 e 2,0. I campioni sono stati replicati 6 volte per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse per l intra-assay ed 1 replicato per seduta in ciascuna di 12 diverse sedute per l inter-assay. Sono stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori al 15 % per il campione negativo ed inferiori al 10 % per i due campioni positivi. LIMITAZIONI Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgA specifiche. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

11 PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le operazioni previste per l'esecuzione del test. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell area di laboratorio designata. Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca. Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni indossando guanti monouso e camici. Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio. Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici di lavoro eventualmente contaminate. Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento secondo le norme vigenti. Controllare periodicamente il grado di contaminazione dell'ambiente di lavoro e degli operatori. Reagenti contenenti siero I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati e trovati negativi per HbsAg, anti-hcv ed anticorpi anti-hiv. Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele. Reagenti pericolosi Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritante per gli occhi e per la pelle S26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un medico. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

12 SCHEMA DEL DOSAGGIO Preparare i reattivi e portarli a temperatura ambiente Diluire i campioni 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System Dispensare : L di Controllo Negativo in singolo o doppio L di Calibratore Cut-off in doppio L di Controllo Positivo in singolo o doppio L di campioni prediluiti in singolo o doppio Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Coniugato Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Substrato-TMB Incubare 15 minuti a T.A. (18-25 C) Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm A CN P3 B CN P4 C CCO P5 D CCO E CP F CP G P1 H P2 Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

13 BEIA Helicobacter pylori IgA Version 20/04/2013 For professional use only TECHNOGENETICS SRL Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

14 INTENDED USE The BEIA Helicobacter pylori IgA kit is a qualitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of IgA antibodies to Helicobacter pylori, in human serum or plasma samples. CLINICAL RELEVANCE In 1983 Warren and Marshall identified, in patients with gastric disease, a new gram-negative pathogenous bacterium, which was denominated Helicobacter pylori. Afterwards many works were carried out to correlate the bacterial infection with the gastric disease. It has been demonstrated that the Helicobacter pylori infection is related with peptic ulcer, type B chronic gastritis and duodenitis. Moreover it has been demonstrated that, in patients with gastric disease, the bacterium eradication gave the recovery from the anatomic lesion. The microrganism can be isolated and diagnosed with invasive techniques (gastroscopy); it is possible to diagnose the infection with a serologic assay as it has been observed an immunospecific answer by the microrganism. Many studies have pointed out that the IgG and/or IgA antibodies concentration is a predective value to diagnose the Helicobacter pylori infection. Moreover it has been demonstrated that the IgG and IgA fall significantly after successful antibacterial therapy. Recently it has been demonstrated the correlation between the presence of antibodies to proteins with high molecular weight ( kda), expressed by the gene CagA, and pathologic states like duodenal ulcer and gastric cancer. So the IgG anti-caga determination is a sensitive test to point out these pathologies. PRINCIPLE OF THE ASSAY The BEIA Helicobacter pylori IgA kit is a qualitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific IgA antibodies to Helicobacter pylori, in human serum or plasma. During the first incubation, only anti-helicobacter pylori specific antibodies present in serum or plasma bind to the inner surface of the wells coated with the Helicobacter pylori antigen. After the first incubation the wells are washed to remove non-reactive serum components. During the second incubation a monoclonal antibody anti-human IgA conjugated with horseradish peroxidase (HRP) is added. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

15 After a second washing cycle, a Substrate-TMB solution is dispensed into the wells in order to detect specific antibodies during a subsequent incubation. The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution which changes to yellow the blue colour developed into the wells. The amount of colour is directly proportional to the specific IgA anti-helicobacter pylori concentration in the patient samples. KIT COMPONENTS Package size: 96 tests. Component SORB A Coated Strip 12x8x1 CONTROL - B Negative Control 1 x 2 ml CAL CO C Cut-off Calibrator 1 x 2 ml CONTROL + D Positive Control 1 x 2 ml DIL SPE E Sample Diluent BEIA System 1 x 120 ml BUF WASH 20X F Wash Buffer 1 x 100 ml CONJ G Conjugate 1 x 13,5 ml SUBS TMB H Substrate-TMB 1 x 13,5 ml H2SO4 I Soluzione Stoppante 1 x 13,5 ml Istruzioni per l uso 1 A. Coated strips Breakable strips coated with purified inactivated Helicobacter pylori antigens, packed in sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal. B. Negative Control Negative human serum for IgA antibodies anti-helicobacter pylori. Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. C. Cut-off Calibrator Human serum, containing IgA antibodies anti-helicobacter with known concentration. Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

16 D. Positive Control Positive human serum for IgA antibodies anti-helicobacter pylori. Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. E. Sample Diluent BEIA System Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % w/w Sodium azide and Tween 20. Ready to use reagent F. Wash Buffer Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di Kathon CG and Tween 20. See Preparation of reagents. G. Conjugate Monoclonal anti-human IgA antibody conjugated with horseradish peroxidase. Ready to use reagent. H. Substrate-TMB Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered solution. Contains pink dye. Ready to use reagent. I. Stop Solution 1N Sulphuric acid solution. Ready to use reagent. STORAGE OF REAGENTS Store all reagents at 2-8 C avoiding exposure to light. Do not use reagents after the expiry date indicated on the label. INTERCHANGEABLE REAGENTS The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop Solution are common to all BEIA kits. MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED Microplate reader with 450/620 nm filters. Manual or automated microplate washing device. Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L. Disposable pipettes and normal glassware. Distilled or deionised water. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

17 WARNINGS AND PRECAUTIONS Bring all reagents to room temperature (18-25 C) before use. Only take the quantity necessary for the assay. Avoid wells drying. Use clean glassware. Use a clean disposable pipette tip for each reagent. Use a clean disposable pipette tip for each sample. If the Substrate-TMB shows a change from pink to blue colour, discard the reagent. For repeated assays, each time provide for new diluted samples. Every analytical run should include control samples in order to validate the results, according to criteria and procedures established by each laboratory. Periodical maintenance and calibration of pipettes and microplate reader are required. AUTOMATION The test can be performed on automated ELISA processor. Please refer to specific instrument manual for proper applications. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The test can be performed on serum or plasma (heparin EDTA). Specimens may be stored refrigerated at 2-8 C up to 5 days. For longer storage they should be aliquoted and stored frozen at 20 C. Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed, lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be pre-diluted with Sample Diluent BEIA System prior to assay. See assay protocol. PREPARATION OF REAGENTS Wash Buffer (20 X) Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when stored at 2-8 C; in any case, do not use it after expiry date printed on the original label. If crystallization occurs in the concentrated Wash Buffer, Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

18 warm the solution to 37 C before diluting. Only dilute the quantity necessary for the assay. WASHING CYCLES Both using a microplate washer and washing the plate manually, perform the following steps. 1. Empty the wells 2. Fill them with 300 µl of Wash Buffer. 3. Empty the wells 4. Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles 5. Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the washing cycles. ASSAY PROTOCOL Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least minutes at C. 1. Dilute the samples to be assayed (1 :81) with the Sample Diluent BEIA System (i.e. 10 µl of serum and 800 µl of Sample Diluent BEIA System). Shake on Vortex. 2. Select the number of strips required for the assay according to the number of samples to be assayed, Controls and the Calibrator Cut-off (see paragraph Summary of protocol below). Reseal the pouch. 3. Dispense 100 µl of Negative and Positive controls, Calibrator Cutoff and of the diluted samples. 4. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. 5. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 6. Dispense 100 µl of Conjugate in each well. 7. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. 8. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 9. Dispense 100 µl of Substrate-TMB in each well. 10. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 15 minutes. 11. Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µl of Stop Solution into each well. 12. Read the optical density in bi-chromatism at 450/620 nm. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

19 CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS RUN VALIDATION CRITERIA Criteria used to validate the obtained results are the following: The ratio of the OD for Positive Control to the OD for the Calibrator Cut-off must be > 1.5 The ratio of the OD for Negative Control to the OD for the Calibrator Cut-off must be < 0.3 If the above criteria are not met, the run is invalid and the results cannot be reported without a documented critical review of the data. The non conformity must be addressed and treated according to each laboratory s Quality Assurance procedures. Each lab should establish and follow its own internal Quality Control procedures and use the QC results to validate runs and manage non conformities. CALCULATION OF RESULTS In order to correlate the analytical results to the immunity of the sample results should be determined calculating the antibody index (A.I.) using the following formula: O.D. sample Antibody Index (A. I.) = O.D. Cut-off Calibrator For the Cut-off Calibrator calculate, if assayed in duplicate, the mean OD value (mod). The data below show typical results for the test. These data are intended as an example only and should not be used to calculate results from another run. 1 st O.D. 2 nd O.D. mo.d. A.I. Negative Control Cut-off Calibrator Positive Control Sample A Sample B Sample C Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

20 INTERPRETATION OF RESULTS Results from our clinical trials, performed on samples representative of the European population, suggest the following interpretative criteria: A.I. > 1.1 < INTERPRETATION Sample should be considered POSITIVE for the presence of anti-helicobacter pylori IgA antibodies. Sample should be considered NEGATIVE for the presence of anti-helicobacter pylori IgA antibodies. GREY ZONE: Sample should be considered BORDERLINE for the presence of anti-helicobacter pylori IgA antibodies. Please consider that: - the test only detects specific IgA antibodies. It cannot per se and univocally be referred to as evidence of infection; - a medical decision cannot be made on the basis of a single test result but should be grounded on all the available clinical data; discrepancies in clinical data should be clarified prior to final decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level tests; - results within grey zone should be made clear: re-testing the same sample; testing a sample from another collection from the same patient; comparing the results with those of a reference test. PERFORMANCE DATA Warning: Data below do not represent the performance specifications of the kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is within such specifications, as intended by the manufacturer. SPECIFICITY AND SENSITIVITY The diagnostic sensitivity and specificity were evaluated comparing the BEIA Helicobacter pylori IgA results versus an established EIA commercial kit (EIA Helicobacter pylori IgA) with acceptable performances. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

21 BEIA Helicobacter p. IgA EIA Helicobacter p. IgA From which the following table can be calculated: Relative Sensitivity 87.3% Relative Specificity 91.7% Agreement 90.4% ANALYTICAL SPECIFICITY No interference has been observed in samples with haemoglobin up to 10 mg/ml, bilirubin up to 1 mg/ml, triolein up to 30 mg/ml. Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be used. REPEATABILITY The within-run and run-to-run variability were determined using one negative sample with A.I. < 0.5 and two positive samples, containing value of A.I. about : 1.5 and 2.0. These samples were tested 6 times per single run in 12 different analytical runs for the within-run and 1 time per single run in 12 different analytical runs for the run-to-run. Coefficients of variation lower than 15% have been obtained for the negative sample and 10% for the two positive samples. LIMITATIONS Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens may affect the detectable levels of specific IgA. GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the procedural directions. Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab. Do not pipette solutions or samples by mouth. Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and samples. Avoid direct contact. Wash hands thoroughly after assay. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

22 Thoroughly clean working area with proper detergent solutions. Collect solid and liquid waste material in proper containers and provide for disposal according to the local regulations. Periodically check contamination level of operators and rooms. Reagents containing serum All components of human origin have been tested and found negative for HbsAg, anti-hcv and anti-hiv antibodies. Since no known test can guarantee, however, that products derived from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other infectious diseases, these reagents should be handled as hazardous material. Hazardous Reagents Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritating to eyes and skin. S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water, and seek for medical advice. Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

23 SUMMARY OF PROTOCOL Prepare reagents and take them to room temperature. Pre-dilute samples 1:81 with Sample Diluent BEIA System Dispense: 100 L of Negative Control in single or duplicate 100 L of Cut-off Calibrator in duplicate 100 L of Positive Control in single or duplicate 100 L of pre-diluted samples in single or duplicate Incubate 30 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Conjugate Incubate 30 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Substrate-TMB Incubate 15 minutes at R.T. (18-25 C) Dispense 100 L of Stop Solution Read the O.D. at 450/620nm A NC P3 B NC P4 C CCO P5 D CCO E PC F PC G P1 H P2 Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013

24 REFERENCE - BIBLIOGRAFIA - Warren J.R. & Marshall B. ( 1983 ) Lancet : Johnson B.J. et al. ( 1986 ) Gut 27, Rathbone B.J. et al. ( 1986 ) Gut 27, Mitchell H.M. ( 1988 ) Medical J. Australia 149, Goodwin C.S. ( 1988 ) Lancet : Goodwin C.S. et al. ( 1989 ) Int. J. Syst. Bacteriol. 39 : Wyatt J.L. et al. ( 1989 ) Scand. J. Gastroenter. 24 ( Sup 160 ) : Loffield RJLF et al. ( 1989 ) Lancet : Forman D. et al. ( 1990 ) Int. J. Cancer 46 : Nomura A. et al. ( 1991 ) N. Engl. J. Med. 325 : Seppala K.M. et al. ( 1992 ) Scand. J. Gastroenter. 27 : Kosunen T.U. et al. ( 1992 ) Lancet 339 : Tee W. et al. ( 1995 ) J. Clin. Microbiol. 33 (5) : Cover T.L. et al. ( 1995 ) J. Clin. Microbiol. 33 ( 6 ) : Wilcon M.H. et al. ( 1996 ) J. Clinical Pathology 49 : Ching C.K. ( 1996 ) Am. J. Gastroenter. 91 (5) : Stephens J.C. et al. ( 1996 ) J. Immunologicals Methods 190: Pag BEIA Helicobacter pylori IgA Ed. 20/04/2013