VITAMINA D E AUTOIMMUNITA A. ANTICO

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1 VITAMINA D E AUTOIMMUNITA A. ANTICO

2 Produzione di vitamina D 2 e vitamina D 3 VITAMINA D gruppo di pro-ormoni ormoni liposolubili derivati del ciclopentanoperidrofenantrene. due sono le forme principali con attività biologica simile: radiazione solare ultravioletta B colecalciferolo (D 3 ) (lunghezza d'onda fra 290 e 315 nm) forma naturale, sintetizzato negli animali dal 7-deidrocolesterolo per esposizione alla luce del sole ergocalciferolo (D 2 ) Deriva da ergosterolo (lieviti e piante), forma sintetica della vitamina D2 utilizzata per vitaminizzare gli alimenti. Bikle, D. J Clin Endocrinol Metab 2009 Copyright 2009 The Endocrine Society

3 VITAMINA D D 2 + D 3 25-idrossilasi epatiche CYP27A1 CYP2R1 CYP3A4 calcifediolo - 25(OH)D 3 CYP2J3 anche in altri tessuti come paratiroide rene, e nei cheratinociti è stata dimostrata l attività delle 25- idrossilasi.

4 REGOLAZIONE SISTEMA ORMONALE VITAMINA D Meccanismo di trasporto 1alfa-idrossilazione renale calcitriolo Interazione con il recettore specifico calcifediolo Dusso AS et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005

5 MECCANISMO DI TRASPORTO Vitamin D Binding Protein (DBP) glicoproteina circolante 5% dei siti di legame accolgono vit D e i suoi metaboliti svolge un ruolo di tamponamento dei livelli ematici di vit D con sottrazione della stessa dal catabolismo e/o dall azione azione Megalina è localizzata nel tubulo renale prossimale riassorbe il complesso 25(OH)D-DBP DBP filtrato dal rene conserva i livelli circolanti di 25(OH)D favorisce l attivazione l dello stesso da parte di 1-alfa 1 idrossilasi renale

6 Ruolo della Megalina e DBP-3 intracellulare nella consegna e idrossilazione di 25(OH)D 25(OH)D legato alla DBP è filtrata dal rene e captata dalle cellule dei tubuli prossimali attraverso endocitosi Megalina mediata. La DBP è degradata e 25(OH)D rilasciato è consegnato a 1 alfa-idrossilasi da IDBP-3 o reimmesso in circolazione legato a DBP Dusso AS et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005

7 BIOATTIVAZIONE VITAMINA D 1α-idrossilasi renale garantisce il ristretto range di concentrazione normale del calcitriolo: è controllata da ipocalcemia restrizione dietetica di fostati PTH Calcitonina GH IGF1 regolatori positivi regolatori negativi fibroblast growth factor 23 (FGF 23) frizzled-related protein 4 (FRP-4) matrix extracellular phosphoglycoprotein (MEPE) prodotto del gene Klotho 1,25(OH)2D3

8 BIOATTIVAZIONE VITAMINA D Dusso AS et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005

9 BIOATTIVAZIONE VITAMINA D Siti di produzione extrarenale di 1,25(OH) 2 D Colon Cellule dendritiche Cellule endoteliali Cervello Ghiandola mammaria Insule pancreatiche Ghiandole paratiroidee Placenta Prostata Cute il gene che controlla l espressione l e l attivitl attività di 1α-idrossilasi 1 negli altri tessuti o cellule è identico a quello renale (locus cromosomiale 12q13.1-q13.3) q13.3) in essi l enzima l è regolato molto diversamente in base alle funzioni autocrine/paracrine di 1,25(OH) 2 D 3 prodotto localmente

10 BIOATTIVAZIONE VITAMINA D l espressione e attivazione di 1α-idrossilasi extrarenale è controllata da fattori locali (citochine e fattori di crescita) Nei macrofagi è stimolata da INFgamma, LPS e infezioni virali. Nelle DC è associata allo stadio di maturazione delle stesse cellule. nei macrofagi e in DC non è soggetta a un feedback negativo 1,25(OH) 2 D 3 -mediato La sintesi di 1,25(OH) 2 D 3 dipende dai livelli dei precursori circolanti

11 Sistema endocrino della Vitamina D Norman, A. W Am J Clin Nutr 2008

12 Distribuzione tessutale di VDR 1. Adiposo 2. Surrene 3. Osso 4. Midollo osseo 5. Cervello 6. Ghiandola mammaria 7. Cellule neoplastiche 8. Cartilagine 9. Colon 10. Ovaio 11. Epididimo 12. Follicolo pilifero 13. Intestino 14. Rene 15. Fegato 16. Polmone 17. Linfociti T e B 18. Muscolo cardiaco 19. Muscolo embrionale 21. Osteoblasto 22. Cellule pancreatiche β 23. Ghiandole paratiroidee 24. Parotide 25. Ipofisi 26. Placenta 27. Prostata 28. Retina 29. Cute 30. Stomaco 31. Testicolo 32. Timo 33. Tiroide 34. Utero

13 INTERAZIONE COL RECETTORE SPECIFICO: VDR Gli effetti biologici di 1,25(OH) 2 D 3 sono mediati da VDR: appartiene alla superfamiglia dei recettori ormonali nucleari modulanti l espressione genica delle cellule bersaglio È composto da una singola catena polipeptidica di 427 aa e 3 domini funzionali: C-terminale che lega l ormone La parte DNA legante N-terminale per i processi di trascrizione Dusso, A. S. et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005

14 Legame VDR-1,25(OH) 2 D 3 Dusso, A. S. et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005

15 BIOAZIONI GENOMICHE NON CLASSICHE Inibizione della crescita cellulare Regolazione dell apoptosi Controllo della differenziazione cellulare Prevenzione della trasformazione neoplastica Controllo del sistema renina-angiotensina angiotensina Controllo della secrezione dell insulina Controllo della funzione muscolare Controllo del sistema nervoso Modulazione della risposta immune

16 Legame VDR-1,25(OH) 2 D 3 Norman A W Endocrinology 2006

17 Aspetti strutturali di 1,25(OH) 2 D 3 Norman A W Endocrinology 2006

18 MODULAZIONE DELLA RISPOSTA IMMUNE 1,25(OH) 2 D 3 agisce interferendo su fattori di trascrizione nucleare NF-AT e NF-kB direttamente legandosi a elementi che rispondono alla Vitamina D (VDRE) nelle regioni promotrici dei geni delle citochine Esercita effetti prodifferenziativi su: Antigen Presenting Cells (APC) Cellule dendritiche monociti macrofagi Linfociti T e B Cellule NK

19 REGOLAZIONE DELLA RISPOSTA IMMUNE immunità innata La risposta immune innata coinvolge l attivazione l di Toll Like Receptor (TLR) nei PMN, monociti, macrofagi, nelle cellule epiteliali (epidermiche, gengive, intestino, vagina, vescica e polmone) L attivazione di TLR induce la produzione di peptidi antimicrobici, la catelicidina e molecole O 2 reattive che uccidono il microrganismo L espressione di catelicidina è indotta da 1,25(OH)D sia nelle cellule della linea mieloide sia nelle cellule epiteliali Bikle, D. J Clin Endocrinol Metab 2009

20 REGOLAZIONE DELLA RISPOSTA IMMUNE immunità adattativa Induzione di DC tolleranti che aumentano Treg CD4+ CD25+ Foxp3 e inibiscono Th1/Th17 APC (monociti, macrofagi, cellule dendritiche) Arresto differenziazione e maturazione delle DC e loro capacità di produrre mediatori proinfiammatori (IL-12p40( che eterodimerizza per formare sia IL-12 sia IL-23 ) Aumento secrezione IL-10 e espressione ILT3 Soppressione dell espressione espressione delle molecole MHC di classe II su APC Soppressione dell espressione espressione delle molecole costimolatorie (CD40,CD80, CD86)

21 Cutolo, M. Rheumatology 2008 REGOLAZIONE DELLA RISPOSTA IMMUNE immunità adattativa Linfociti T Inibizione della proliferazione antigene-stimolata dei Th1 e della secrezione di citochine di tipo Th1 (,IFN-γ,IL,IL-2) IL-12, e IL-17 da parte di Th17 Aumento della produzione di IL-4, IL-5, IL-10 e dello sviluppo di Th2 attraverso un effetto diretto su CD4+ nativi Aumento della frequenza dei Treg La sintesi attiva di 1,25 (OH) 2 D 3 Modula funzione e fenotipo di APC Inibisce lo sviluppo dei Th1 Induce Treg e T NK Linfociti B Induzione di apoptosi e inibizione di proliferazione, generazione di B memoria, differenziazione in plasmacellule e produzione di immunoglobuline T NK Stimolazione delle funzioni regolatorie

22 Livelli decisionali 1,25(OH) 2 D 3, forma attiva dell ormone, non è il composto ideale da dosare per valutare lo stato della vitamina D: livelli circolanti circa mille volte più bassi di quelli di 25(OH)D 3 vita media di sole ore carenza di vitamina D aumenta i livelli di PTH che normalizza i livelli 1,25(OH) 2 D 3, rendendo il dosaggio inutile per valutare lo stato della vit D 25(OH)D 3 è il metabolita usato per stabilire lo stato della vitamina D: È la forma circolante più predittiva in quanto non attiva e scarsamente regolata ha una emivita di circa settimane

23 Livelli decisionali 25(OH)D < 20 ng/ml : carenza ng/ml : insufficienza > 30 ng/ml : valori auspicabili Sono stabiliti sulla base dell osservazione che: L assorbimento del calcio intestinale nelle donne in menopausa è massimo se si portano i livelli di 25(OH)D a 32ng/mL La concentrazione di PTH negli adulti raggiunge il nadir quando i valori di vitamina D sono > 32ng/mL I bambini hanno lo stesso fabbisogno degli adulti L intossicazione da vitamina D si definisce la concentrazione > 150 ng/ml associata a ipercalcemia, ipercalciuria e spesso iperfosfatemia Holick MF, Chen TC, Am J Clin Nutr 2008

24 Test clinici per il dosaggio di 25(OH)D If the medical community is to make progress in correcting widespread hypovitaminosis D, 25OHD measurement must be standardized. Binkley N et al, J Clin Endocrinol Metab 2004 Alto grado di variabilità tra metodi e tra laboratori che usano lo stesso metodo dovute alle diverse tecnologie utilizzate, alcune delle quali prevedono purificazione del campione prima della quantificazione finale alla mancanza di materiali di riferimento su cui realizzare la standardizzazione Roth HJ et al, Ann Clin Biochem 2008

25 Test clinici per il dosaggio di 25(OH)D Radioimmunoassay (RIA) Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) Cromatografia liquida-spettroscopia di massa (LC-MS) Chemiluminescenza (CLIA) Enzyme ImmunoAssay (EIA) HPLC è considerato un metodo di riferimento ma è indaginoso e scarsamente standardizzato LC-MS si sta affermando come procedura standardizzata, strumento costoso, procedura richiede tempi lunghi CLIA e EIA sono i più utilizzati nei laboratori di medie dimensioni

26 Assay method on LIAISON (CLIA) 25 OH Vitamin D TOTAL è un CLIA per la determinazione quantitativa di 25(OH)D Metodo diretto, competitivo 1 st incubation, OH Vitamin D è dissociata da DBP e si lega ad uno specifico anticorpo in fase solida 2 nd incubation, 10 Tracer 25 OH vitamin D è aggiunto legato a isoluminolo Gli anticorpi policlonali usati sono gli stessi impiegati per the DiaSorin RIA assays, la specificità anticorpale è simile Il totale riconoscimento dei metaboliti idrossilati D 2 and D 3 assicura un reale follow-up per la terapia The 25 OH Vitamin D antibody shows no reactivity to the 3-epi 3 form of 25 hydroxyvitamin D 3 Singh RJ et al, J Clin Endocrin Metabol 2006

27 Correlazione con RIA LIAISON 25 OH Vitamin D Total (ng/ml A total of 109 samples was Vitamin D TOTAL and by a tested by LIAISON 25 OH radioimmunoassay method (RIA). The resulting regression equation was: LIAISON = 1.19 (RIA) ; R = RIA (ng/ml)

28

29 Carenza di Vitamina D Aumenta l insorgenza l e la mortalità per cancro Garland CF et al. Am J Public Health 2006 Aumenta l insorgenza l di malattie cardio-vascolari Krause R et al. Lancet 1998 Aumenta il rischio di sviluppare disturbi del SNC McGrath J et al. Schizophr Res 2002 Aumenta il rischio di insorgenza di malattie autoimmuni Ponsonby AL et al. Toxicology 2002

30 Carenza di Vitamina D e MAI aumentato rischio per Diabete tipo I, S. M., A.R., LES - Stene LC et al, Diabetologia Ponsonby A et al, Toxicology 2002 Bambini trattati con vitamina D nel primo anno di vita, seguiti per 31 anni, mostrano una riduzione di insorgenza di Diabete tipo I del 78% rispetto a coetanei non trattati - Hypponen E et al, Lancet 2001 Donne trattate con > 400 UI di vitamina D/die mostrano una diminuzione del rischio di sviluppare S.M. e A.R. > 40% - Munger KL et al, Neurology Merlino LA et al, Arthritis Rheum 2004

31 Diabete autoimmune tipo I macrofagi e T citotossici CD8+ regolati dai Th1 IL-12 dipendenti 1,25 (OH) 2 D 3 da sola riduce l incidenza l dell insulite e previene lo sviluppo del Diabete se somministrata ai topi NOD da 3 settimane di età; a 8 settimane è efficacie solo associata a IS Mathieu C et al, Academic Press 1997 NOD Analogo 1,25(OH) 2-16,23Z-diene-26,27-6fluoro-19-nor D 3 (BXL-219) capace da solo di bloccare il decorso della malattia diabetica nei NOD adulti per la sua aumentata stabilità metabolica: arresta la maturazione di DC inibisce la produzione di IL-12 e l infiltrazione l Th1 aumenta la frequenza dei Treg nei linfonodi pancreatici che inibisce la risposta Th1 vs IA-2 ristabilisce la capacità di Th1 di rispondere ai segnali che inducono apoptosi Gregori G et al, Diabetes 2002 arresta la progressione immunologica e previene l insorgenza l clinica del Diabete sopprimendo la produzione di chemochine da parte delle cellule beta capaci di richiamareth1 effettori nelle n insule pancreatiche Giarratana et al, J Immunol 2004

32 GASTRITE AUTOIMMUNE Th-1 effettori patogenetici CD4+ CD25- riconoscono un epitopo sulle subunità dell ATPase Hanno capacità citolitiche, perforina e Fas- Fas ligando mediate, regolate da restrizione genica MHC indotta Causano citolisi e apoptosi di APC: le cellule parietali possono agire come APC (aumento molecole MHC, espressione CD 80 CD86) Stimolano la produzione di autoanticorpi da parte dei B presenti nella mucosa D Elios MM, Gastroenterol 2001

33 GASTRITE AUTOIMMUNE ATPase MHC Rilascio di ATPase nel turn-over cellulare Disegno dello studio:? Mimetismo molecolare tra Hp e ATPase e/o spreading epitopico Determinare la prevalenza dello stato di 25(OH)D nei pazienti con GAI diagnosticata istologicamente ATPase T cells ATPase B cells confrontarlo con 25(OH)D di una popolazione di riferimento delineata sulla nostra realtà confrontarlo con 25(OH)D di pazienti che presentano patologie gastriche correlate FI B cells Anti ATPase Anti-FI

34 Metodo indiretto di Kairisto Modello statistico per la stima dell intervallo di riferimento che elabora dati derivanti da soggetti non di riferimento ipotizzando che gran parte dei fino a 50 risultati provenienti da pazienti non ricoverati derivano da accertamenti di Orig. distr. tutti Femmine Maschi anni >50 anni screening e si riferiscono a individui senza patologia correlata Observations: Rappresenta Mean: un approccio 21,30 interessante 21,27 nella 21,24 stima dell intervallo 24,35 di 20,75 riferimento quando è possibile utilizzare campioni molto numerosi SD: 12,76 12,44 14,13 13,74 12,52 Lower ref. limit: 5,3 5,3 Vantaggi4,9 6,4 5,2 Underl. La percentile: procedura è semplice 2,72% ed economica 2,70% 2,52% 2,59% 2,69% Upper ref. I limiti limit: sono derivati 45 da dati ottenuti 47,4 nelle stesse 40,3 condizioni 44,5preanalitiche, 41,7 con le stesse Underl. modalità analitiche e nella stessa popolazione in cui saranno utilizzati percentile: 97,50% 97,50% 97,54% 97,54% 97,53% È possibile ripartire i risultati sulla base di variazioni biologiche (età, sesso )

35 Metodo indiretto di Kairisto Distribuzione di riferimento osservazioni Cittadella (PD) 45,39 Vicenza 45,33 Latisana 45,47 Udine 46,04 Lower ref. limit: 5.42 Underl. percentile: 2.70 Upper ref. limit: Underl. percentile: 97.5 Mean: 21,78 SD: 13.12

36 % 30.0 Vit. D ng/ml Media % 75% 50% % tutti Femmine Maschi fino a 50 anni >50 anni 10% percentili tutti Femmine Maschi fino a 50 anni >50 anni 90% 36,0 35,8 37,0 40,4 35,1 75% 26,6 26,6 26,6 31,2 25,9 50% 17,1 17,3 16,5 21,0 16,5 25% 8,7 8,8 8,3 12,9 8,1 10% 3,0 3,0 3,0 7,4 3,0

37 Gruppo di controllo Range età (n soggetti) patologia Media (ng/ml) DS (ng/ml) < 10 anni (49) controllo anni (79) Controllo 25,3 12, anni (84) anni (163) Controllo Controllo Nessuna terapia e/o malattia metabolica Soggetti living indoor Media percentile 67.1% 73.5% 58.0% 62.9% Paratormone nei limiti di norma

38 100.0% 90.0% 80.0% rachitsmo percentili 70.0% 60.0% 50.0% 40.0% 30.0% osteoporosi 20.0% 10.0% 0.0% < 10 anni età Media ± DS ng/ml Media percentile 1 < 10 anni 22.9 ± % 35.3% 89% ± % 39.6% 92% ± % 10.0% 89% ± % 27.2% 88% da a

39 Casistica Cittadella concentrazione media vitamina D Range età (n soggetti) patologia Media (ng/ml) DS (ng/ml) Media percentile anni (163) Controllo 21,3 12,2 62.8% anni (54) anni (42) Flogosi linfocitaria aspecifica 22,2 13,5 APCA + 40% 65.4% tiroide 21% Hp+ Gastrite autoimmune 9,8 5,6 29.5% anni (21) Gastrite atrofica multifocale ,4 34.3%

40 100.0% 90.0% 80.0% 70.0% percentili 60.0% 50.0% 40.0% 30.0% 20.0% 10.0% 0.0% control APCA+ GAI HP+ patologia media ± DS ng/ml Media percentile controllo (20-80) 21.3 ± % 27.2% 88% Apca+ (20-80) 22.2 ± % 26.0% 91% GAI (37-80) 9.8 ± % 11.6% 46% Gastrite Hp+ (20-80) 11.3 ± % 10.0% 59% da a

41 Interazioni batterio-ospite nella patogenesi dell infezioni da H. pylori

42 VITAMINA D La vitamina D, liposolubile, viene inglobata nelle micelle formate dall'incontro dei lipidi idrolizzati con la bile,, entra nell'epitelio epitelio intestinale per diffusione passiva dove viene incorporata nei chilomicroni i quali entrano nella circolazione linfatica. La quantità di calciferolo proveniente dagli alimenti è molto bassa e la maggior parte di vitamina D viene sintetizzata a livello cutaneo per azione della luce ultravioletta.

43 Holick M F Mayo Clin Proc CONCLUSIONI

44 CONCLUSIONI La concentrazione media di 25(OH)D nella nostra popolazione selezionata è 21.3 ng/ml (63% percentile) La concentrazione media di 25(OH)D nei pazienti con gastrite autoimmune è 9.8 ng/ml (30% percentile) La concentrazione media di 25(OH)D nei pazienti con gastrite da Hp è 11.3 ng/ml (34% percentile)

45 Ipotesi speculativa Soggetti geneticamente predisposti con Carenza/insufficienza cronica AZIONE Standardizzazione metodi livelli di 25(OH)D necessari per l omeostasi l immunologica negli adulti e bambini Aggressione autoimmune Vitamina D repleting Previene aggressione AZIONE Sperimentazione degli agonisti di VDR nell uomo Vitamina D repleting Non blocca aggressione Malattia autoimmune

46 PROBLEMI APERTI?

47 RINGRAZIAMENTI Davide Giavarina Antonio Fortunato Giuliano Soffiati Graziano Kodermaz

48 RINGRAZIAMENTI professione.. Amici

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