TRILLIUM DIAGNOSTICS. Leuko64 Test per il Rilevamento di Risposte Infiammatorie Sistemiche Acute

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1 Test per il Rilevamento di Risposte Infiammatorie Sistemiche Acute i Informazioni sul Prodotto h LK (75 test) ; LK (250 test) V Per Uso Diagnostico in Vitro SOMMARIO E PRINCIPIO D'IMPIEGO L'espressione del CD64 sui neutrofili aumenta rapidamente nelle applicazioni sia in vitro, sia in vivo in poche ore, a opera di mediatori di infiammazione come l'interferone gamma e il G-CSF (1-3). Lo stesso cambiamento si osserva in risposta a infezione o lesione di tessuto documentata, indicando la relazione tra la misurazione dell'espressione del CD64 sui neutrofili e la presenza di tali condizioni negli esseri umani (4-14). Il kit di analisi Leuko64 TM utilizza una miscela di tre anticorpi monoclonali con specificità su CD64 (cloni 22 e 32.2) e CD163 (clone Mac2-158). L'uso di due anticorpi per differenti epitopi del CD64 potenzia il rapporto segnale/rumore del test e fornisce un meccanismo per ridurre al minimo la variazione da lotto a lotto nel segnale di fluorescenza del reagente. L'aggiunta dell'anticorpo monoclonale al CD163, un antigene specifico del monocita, aumenta la specificità di identificazione della sottopopolazione di leucociti, semplificando così l'algoritmo di ricerca dei cluster del software Leuko64 QuantiCALC e consentendo l'identificazione delle popolazioni interne di controllo positivo e negativo. L'uso del software automatizzato elimina la variazione inerente all'analisi standard soggettiva in list-mode del flusso citometrico. Per la standardizzazione della quantificazione del CD64 cellulare viene utilizzata una sospensione di sfere fluorescenti, che permette la tracciabilità in conformità al materiale di riferimento standard NIST SRM 1932 (RM 8640) e consente di ridurre al minimo le differenze tra lotto e lotto nei kit di analisi Leuko64. I risultati del Test Leuko64 sono riportati come Indice PMN CD64 (parametro diagnostico) e come indici di CD64 e CD163 dei monociti. APPLICAZIONE Le versioni LK e LK del kit di Test Leuko64 TM sono state progettate specificamente per l'uso con i seguenti citometri di flusso: Beckman Coulter XL, Beckman Coulter FC-500, Beckman Coulter Navios, BD Biosciences FACScan, BD Biosciences FACSCalibur e BD Biosciences Cantos. Tel: Fax: info@trilliumdx.com

2 DESTINAZIONE D'USO Il kit di analisi Trillium Diagnostics Leuko64 TM deve essere utilizzato per la misurazione dei livelli di espressione del CD64 sui leucociti neutrofili insieme ad altre analisi di laboratorio e valutazioni cliniche come ausilio per la diagnosi in vitro di infiammazioni sistemiche acute e lesioni tissutali, ad esempio causate da danni tissutali, infezioni o sepsi. Trillium Leuko64 TM è destinato ad uso diagnostico in vitro solo da parte di personale qualificato. COMPONENTI DEL KIT Miscela di anticorpi monoclonali murini (contiene soluzione salina Reagente A tamponata con 0,5% albumina sierica bovina purificata (BSA) e 0,01% di azoturo di sodio). Soluzione Lisante Trillium con concentrazione 10X (contiene cloruro di Reagente B ammonio) Sospensione di sfere in polistirene da 5-6 µm marcate con rosso Reagente C StarFire TM e isotiocianato di fluoresceina (FITC), (contiene <0,1% di azoturo di sodio e 0,01% di Tween 20). Utilizzato per analizzare i file list-mode della citometria a flusso e Leuko64 TM calcolare gli Indici di CD64 sui leucociti. Il CD allegato contiene anche Software tutorial per la formazione degli utenti e l'uso ottimale del kit di analisi Leuko64 TM. REAGENTI E MATERIALI NECESSARI MA NON INCLUSI Acqua Distillata Provette in polistirene monouso 12x75 Citometro di Flusso Micropipette per dosare 5uL, 50uL e 1mL Agitatore Vortex Computer per analisi dei file list-mode CAMPIONI Il Test Leuko64 TM richiede solo 50µL di sangue intero anticoagulato; EDTA, eparina, citrato di sodio, o ACD sono anticoagulanti compatibili con questo sistema di test. I campioni di sangue rimangono accettabili per un massimo di 8 ore se conservati a temperatura ambiente (18-22C) o per 48 ore se refrigerati (2-8C). PREPARAZIONE DEI CAMPIONI 1. Diluire la soluzione lisante Trillium con concentrazione 10X (Reagente B) in proporzione 1:10, miscelando 1 parte di Reagente B concentrato con 9 parti di acqua distillata filtrata. Il ph finale della soluzione ottenuta deve essere pari a 7,40 + 0,05. Miscelare un volume sufficiente per il numero previsto di prove (ogni campione richiede 1,0 ml). La soluzione lisante Trillium 1X o diluita è stabile per una settimana a temperatura ambiente (20-26 C) o 30 giorni in frigorifero (2-8 C). 2. La soluzione lisante Trillium diluita deve essere usata ad una temperatura compresa tra 20 C e 37 C. Una soluzione fredda può causare una riduzione della lisi e condizioni di test non ottimali. 3. Etichettare una provetta di polistirene da 12 x 75 mm per ogni campione da analizzare. 4. Dispensare 50µLdi Reagente A Leuko64 TM in ogni provetta. 5. Pipettare 50µL di campione di sangue anticoagulato ben miscelato con conta dei leucociti <25 x 10 9 cellule/l (diluire se necessario) alla provetta corrispondente contenente il Reagente A; miscelare o vortexare delicatamente; poi incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente (18-22 C). Tel: Fax: info@trilliumdx.com LK64-V A4 EN Pagina 2 di 8

3 6. Aggiungere 1 ml di soluzione lisante Trillium 1X (Reagente B diluito) in ogni provetta e vortexare abbondantemente. Incubare per 15 minuti al buio a temperatura ambiente. Eseguire il vortex in modo intermittente facilita il processo di lisi. 7. Aggiungere 5 ml di sfere Leuko64 TM (Reagente C) in ogni provetta, vortexare ed analizzare con il citometro di flusso seguendo il protocollo di preparazione dello strumento e di analisi descritto di seguito. I campioni preparati e non analizzati immediatamente devono essere tenuti a 2-8 C e al riparo dalla luce fino al momento dell'analisi. L'analisi mediante citometria di flusso deve essere eseguita entro 4 ore dalla marcatura. PREPARAZIONE DEL CITOMETRO DI FLUSSO Prima di analizzare il primo campione, un protocollo di acquisizione dovrà essere impostato sul citometro di flusso. Le sfere Leuko64 TM (Reagente C) saranno utilizzate per la calibrazione dei guadagni dello strumento e per impostare le tensioni di esercizio. Affinché il software automatizzato possa funzionare correttamente, è imperativo seguire i passaggi elencati di seguito nell'ordine specificato. Per ulteriori informazioni, consultare le esercitazioni sul CD del software Leuko64 QuantiCALC. 1. Preparare una provetta in polistirene da 12 x 75 mm contenente 5 µl di sfere Leuko64 TM (Reagente C) in 0,5 ml di soluzione lisante Trillium 1X (Reagente B diluito in rapporto 1:10 con acqua distillata filtrata, ph 7,40 + 0,05). Questa sospensione di sfere sarà utilizzata per impostare la dispersione della luce e la tensione di fotomoltiplicazione ottimale del citometro di flusso. 2. Nella modalità di acquisizione del citometro di flusso (Utenti Beckman Coulter XL, FC500 o Navios - cfr. di seguito), impostare 5 istogrammi a due parametri: FS (lin) vs SS (log) FL3 (beads) vs SS (log) CD64 FITC vs SS (log) CD163 PE vs CD64 FITC CD163 PE vs SS (log) E 3 istogrammi a un parametro: FL1 - CD64 FITC FL2 - CD163 PE FL3 (o PMT con filtri configurati per rilevare la luce a 685 nm) NOTA: Gli strumenti Beckman Coulter XL, FC500 e Navios devonoavere i parametri di acquisizione selezionati nel seguente ordine: P1 = FALS P4=log PE P2 = log side scatter P5=log PMT per segnale 685 P3 = log FITC nm (di norma FL4) 3. Disattivare tutte le impostazioni di compensazione e di soglia. 4. Impostazioni di Tensione per Tutti gli Strumenti, tranne BDB FACSCanto II. (Utenti FACSCanto II: consultare le istruzioni riportate di seguito) Nota: Impostare tutti i parametri logaritmici per la visualizzazione a 4 decadi nel software di raccolta dati del citometro di flusso prima dell'acquisizione Eseguire la sospensione delle sfere e apportare le seguenti correzioni sugli istogrammi a un parametro (vedi schema) Il centro del picco sull'asse FL1 (FITC) deve essere centrato sul canale 100 (all'inizio della terza decade dell'intensità di fluorescenza). Tel: Fax: info@trilliumdx.com LK64-V A4 EN Pagina 3 di 8

4 Il centro del picco sull'asse FL2 (PE) deve essere centrato a ~ 20 (la prima tacca nella seconda decade dell'intensità di fluorescenza). Il centro del picco sull'asse FL3 deve essere centrato sul canale 100, o all'inizio della terza decade dell'intensità di fluorescenza. Sull'istogramma FS vs log SS, la popolazione delle sfere deve essere posizionata alla fine della terza decade del segnale log side scatter e vicino al canale 200 per il segnale forward o low-angle scatter (su scala 256, usare i canali da 25 a 50). Per gli Utenti di Tutti i Modelli Beckman Coulter, FACSCalibur e FACScan : **Impostazione della Tensione Per i Soli Utenti di BDB FACSCanto II : I citometri di flusso BD FACSCanto II richiedono istruzioni di installazione alternative a causa delle differenze nella visualizzazione della scala logaritmica di fluorescenza, una caratteristica unica del software di raccolta dati FACSDiva utilizzato sul Canto II. CD64 FITC CD163 PE Starfire Red SSC Log Nota: Impostare tutti i parametri logaritmici per la visualizzazione a 4 decadi nel software di raccolta dati del citometro di flusso prima dell'acquisizione. Eseguire la sospensione delle sfere e apportare le seguenti correzioni sugli istogrammi a un parametro (vedi schema): Il centro del picco sull'asse FL1 (FITC) deve essere centrato sul canale 3000 (la seconda tacca della terza decade dell'intensità di fluorescenza). Il centro del picco sull'asse FL2 (PE) deve essere centrato in prossimità della fine della seconda decade dell'intensità di fluorescenza. Il centro del picco sull'asse FL3 deve essere centrato sul canale 3000 (la seconda tacca della terza decade dell'intensità di fluorescenza). Sull'istogramma FS vs log SS, la popolazione delle sfere deve essere posizionata alla fine della terza decade del segnale log side scatter e sul canale per il segnale forward o low-angle scatter. Solo per gli Utenti BD FACSCanto II: CD64 FITC CD163 PE Starfire Red SSC Log Tel: Fax: info@trilliumdx.com LK64-V A4 EN Pagina 4 di 8

5 5. La soglia per escludere piastrine e detriti di globuli rossi sarà impostata sul log SS utilizzando i linfociti. Il discriminatore sul log SS dovrebbe essere impostato all'immediata sinistra della popolazione linfocitaria. Non utilizzare un set discriminatorio con il forward scatter, poiché le sfere vengono escluse dall'acquisizione. 6. Le impostazioni di acquisizione e di immagazzinamento devono essere regolate per consentire la raccolta di eventi ungated. Impostare la risoluzione a 1024 è generalmente consigliato, ma è obbligatorio quando si utilizzano i citometri Beckman Coulter Cytomics FC500 o BD Biosciences FACSCanto. 7. Salvare le impostazioni e il modello di acquisizione. Ripetere i passaggi 4-7 con qualsiasi nuovo lotto di Leuko64 TM o dopo la manutenzione dello strumento. ANALISI FILE IN MODALITÀ DI ELENCAZIONE (LIST-MODE) Installare il software in dotazione Leuko64 QuantiCALC sul Macintosh o PC che sarà utilizzato per l'analisi dei dati. Seguire le istruzioni per l'analisi dei dati in modalità elencazione contenuti nella Guida del software. NOTA: Il software è specifico per ogni lotto e i protocolli in uso variano in base al modello. Sarà richiesto di effettuare la selezione appropriata. STRATEGIA DI CONTROLLO QUALITÀ PER IL TEST LEUKO64 TM L'analisi utilizza popolazioni di cellule autologhe nel campione del paziente per i controlli positivi e negativi, ottimizzando la valutazione delle variabili pre-analitiche. La popolazione linfocitaria, che non presenta l'espressione del CD64 e del CD163, serve come una popolazione di controllo negativo e assicura l'aggiunta dei reagenti appropriati, rilevando inoltre l'eventuale presenza di sostanze fluorescenti all'interno del campione diagnostico. La popolazione monocitaria, che presenta l'espressione costitutiva di CD64 e CD163, serve come controllo positivo per la marcatura adeguata dei campioni con il Reagente A. Consultare le brevi istruzioni per l'analisi dei dati in modalità list-mode nel file della Guida del software Leuko64 TM per ulteriori dettagli riguardanti i controlli negativi e positivi del test. NOTA: Il software è dotato di flag e direttive di regolazione t l H Y C MANIPOLAZIONE E CONSERVAZIONE Conservare le fiale in posizione verticale, ben chiuse e a una temperatura compresa tra 2 e 8C quando non utilizzate. Le fiale non aperte sono stabili fino alla data di scadenza indicata su ciascuna di esse e nel foglio illustrativo. Evitare cicli di riscaldamento e raffreddamento non necessari, dato che il test resta valido per un numero di cicli termici pari o inferiore a trenta (30). Proteggere il prodotto dal congelamento, da temperature superiori ai 30C e da periodi prolungati di esposizione a temperatura ambiente (18-26C) o alla luce. AVVERTENZA Tutti i componenti del presente kit contengono azoturo di sodio (<0,1% p/v). L'azoturo di sodio forma dei composti pericolosi e tossici se combinato con acidi o metalli. Manipolare con cautela. Smaltire le soluzioni contenenti azoturo di sodio in conformità alle norme in materia. Tel: Fax: info@trilliumdx.com LK64-V A4 EN Pagina 5 di 8

6 CONTROLLO DELLA QUALITÀ DEL PRODOTTO Le prestazioni e la specificità dei reagenti contenuti in questo kit sono valutate mediante i metodi di controllo qualità interni di Trillium. Il processo di produzione adotta sistemi di qualità e direttive di produzione conformi alle norme FDA QSR e ISO 13485:2003. LIMITAZIONI L'uso terapeutico di interferone gamma, G-CSF o agenti che modulano la risposta immunitaria innata, influisce sull'aumento dell'espressione dei CD64 sui leucociti e, di conseguenza, sull'interpretazione dell'analisi. I risultati del test Leuko64 TM non devono essere utilizzati come unica misura per la valutazione delle infiammazioni nei pazienti, ma possono essere utilizzati per monitorare l'effetto dei trattamenti. Per ottenere prestazioni ottimali ed evitare risultati imprecisi o inattendibili, è necessario conservare e utilizzare il prodotto e i campioni da testare in modo appropriato. La miscelazione incompleta della fiala con il reagente C prima dell'uso compromette sia la quantità prelevata, sia il materiale restante contenuto nella fiala. La scelta del protocollo dello strumento o del numero di lotto del kit errato al momento dell'avvio del software può compromettere la precisione dell'analisi dei dati in modalità di elencazione. Il software è specifico per ogni lotto e i protocolli in uso variano in base al modello. Accertarsi di selezionare gli elementi appropriati, quando richiesto. Un file di un campione ematico di un paziente affetto da leucopenia o neutropenia grave con meno di 200 eventi WBC rilevati dal software Leuko64 TM in una delle 3 categorie (PMN, Linfocita o Monocita) non può essere analizzato con il kit Leuko64 TM senza una notevole riduzione di precisione e accuratezza dell'indice PMN CD64. Un file con un conteggio sfere inferiore a 1000 deve essere analizzato per determinare la causa di tale valore, che potrebbe derivare da impostazioni errate dello strumento o da un campione di sangue non diluito con WBC >25 x 10 9 cellule/l. Alcuni strumenti per la citometria di flusso sono dotati di filtri che presentano una configurazione atipica, in cui FL1 non è riferito al segnale CD64 FITC e FL2 non è riferito al segnale CD163 PE; ciò può compromettere le prestazioni del software Leuko64 TM. Per informazioni sulla risoluzione di questo problema o di qualsiasi problema relativo al software, contattare il rivenditore dello strumento e l'assistenza tecnica Trillium Diagnostics. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI Ogni laboratorio dovrebbe stabilire un range di riferimento accettabile per ogni lotto di Leuko64 TM. Si prevede che l'intervallo di riferimento del laboratorio per l'indice PMN CD64 relativo a campioni di sangue sano sia 1,00. Generalmente, più acuta è la risposta infiammatoria sistemica, più alto risulta il valore dell'indice PMN (e Monocita) CD64. Gli intervalli di riferimento anticipati per gli indici CD163 e CD64 Monocita non sono stati stabiliti. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 1. Davis BH. Improved diagnostic approaches to infection/sepsis detection. Expert Rev Mol Diag 2005;5: Schiff D, Rae J, et al. Increased phagocyte CD64 expression and improved Fc-receptor mediated phagocytosis following in vivo recombinant human interferon-ɣ treatment of normal human subjects. Blood 1997;90: Tel: Fax: info@trilliumdx.com LK64-V A4 EN Pagina 6 di 8

7 3. Petroni KC, Shen L, Guyre PM. Modulation of human polymorphonuclear leukocyte IgG Fc receptors and Fc receptor-mediated functions by IFN-gamma and glucocorticoids. J Immunol 1988;140: Davis BH, Bigelow NC, et al. Neutrophil CD64 expression: potential diagnostic indicator of acute inflammation and therapeutic monitor of interferon- therapy. Lab Hematol 1995;1: Guyre PM, Campbell AS, et al. Monocytes and polymorphonuclear neutrophils of patients with streptococcal pharyngitis express increased numbers of type I IgG Fc receptors. J Clin Invest 1990;86: Ng PC, Lam HS. Diagnostic markers for neonatal sepsis. Curr Opin Pediatr 2006;18: Davis BH, Bigelow NC. Comparison of neutrophil CD64 expression, manual myeloid immaturity counts, and automated hematology analyzer flags as indicators of infection or sepsis. Lab Hematol 2005;11: Leino L, Sorvajarvi K, et al. Febrile infection changes the expression of IgG Fc receptors and complement receptors in human neutrophils in vivo. Clin Exp Immunol 1997;107: Davis BH, Olsen S, et al. Neutrophil CD64 is an improved indicator of infection or sepsis in emergency room patients. Arch Pathol Lab Med 2006;130(5): Van der Meer W, Pickkers P, et al. Hematological indices, inflammatory markers and neutrophil CD64 expression: comparative trends during experimental human endotoxemia. J Endotoxin Res 2007;13: Groselj M, Ihan A, Derganc M. Neutrophil and monocyte CD64 and CD163 expression in critically ill neonates and children with sepsis: comparison of fluorescence intensity and calculated Indexes. Mediators Inflamm 2008; 2008: Bhandari V, Wang C, et al. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a diagnostic marker. Pediatrics 2008;121: Hoffmann JJ. Neutrophil CD64 as a sepsis biomarker. Biochemica Medica 2011;21: Icardi M, Erickson Y, Kilborn S, et al. CD64 Index provides simple and predictive testing for detection and monitiroing of sepsis and bacterial infection in hospital patients. J Clin Microbiol 2009;47: US Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration. 29 CFR Parts , Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens; Final Rule. Federal Register 235: US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication (NIH) Washington: US Government Printing Office MARCHI Il software Leuko64 QuantiCALC è protetto da diritti d'autore ed è stato sviluppato in collaborazione tra VERITY SOFTWARE HOUSE Topsham, Maine, USA e, LLC Brewer, Maine, USA FACSCanto e FACScan sono marchi registrati di BD Biosciences San Jose, CA, USA Navios, Gallios Cytomics FC500 e XL sono marchi registrati di Beckman Coulter, Inc Brea, CA, USA Leuko64 è un test brevettato, coperto da brevetto USA N , brevetto giapponese N e richiesta di brevetto EPO N Tel: Fax: info@trilliumdx.com LK64-V A4 EN Pagina 7 di 8

8 ASSISTENZA CLIENTI M Trillium Diagnostics, LLC PO Box 67 Brewer, Maine, USA Tel Fax P Assistenza Tecnica info@trilliumdx.com Ordini via Telefono, Fax, o Sito Web su IQ Products BV Rozenburglaan 13a 9727 DL Groningen, Olanda Tel +31 (0) Fax +31 (0) Assistenza Tecnica marketing@iqproducts.nl Ordini orders@iqproducts.nl Sito Web Tel: Fax: info@trilliumdx.com LK64-V A4 EN Pagina 8 di 8