Ogni misura è composta di almeno tre dati: un numero, un'unità di misura, un'incertezza.

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1 Ogni misura è composta di almeno tre dati: un numero, un'unità di misura, un'incertezza. Corso di laurea in Tossicologia Misure ripetute forniscono dati numerici distribuiti attorno ad un valore centrale indicabile con un indice (indice di localizzazione o di posizione). A seconda dei casi si potrà adottare l'uno o l'altro indice in base all'esperienza. Indici di localizzazione Media aritmetica: x = Σ i x i /N dove x i sono i risultati delle N misure. "Scarto dalla media" o scarto: (x i - x). La media aritmetica costituisce il legame (vincolo) tra la somma dei dati (Σ x i ) ed il loro numero (N), e gode delle seguenti proprietà:

2 1) Σ (x i - x) = 0, per cui gli scarti indipendenti sono (N-1). Corso di laurea in Tossicologia 2) Σ (x i - x) 2 = minimo (metodo dei minimi quadrati). La media si applica direttamente alla curva normale dell errore, curva di Gauss, Frequenza dati x µ

3 Altri indici di posizione si applicano ad altri tipi di distribuzione, come questa di frequenze unimodali e modestamente asimmetrica: Corso di laurea in Tossicologia Frequenza dati x µ

4 b) MODA: valore cui corrisponde il massimo di frequenza. Corso di laurea in Tossicologia c) MEDIANA: valore che divide in due il campo di misura, quando i dati replicati sono ordinati in ordine crescente o decrescente, con metà dati a destra e metà a sinistra (media dei valori di mezzo se n è pari). Questi indici di posizione sono significativi in alcuni casi particolari, ma sono insensibili a quanto avviene ai margini. In una distribuzione di frequenze unimodale e moderatamente asimmetrica, gli indici di posizione sono legati fra loro secondo la relazione empirica:

5 [(MEDIA MODA) = 3 (MEDIA - MEDIANA)] Corso di laurea in Tossicologia Moda Mediana Media Un'estensione del concetto di mediana (valore che divide l'insieme dei dati in due parti uguali) è quello che riguarda i valori che dividono l'insieme in quattro parti uguali. Tali valori vengono chiamati "quartili".

6 I quartile II quartile III quartile IV quartile Corso di laurea in Tossicologia Allo stesso modo, vengono definiti "decili" e "percentili" i valori che dividono l'insieme dei dati rispettivamente in 10 e 100 parti uguali. d) MEDIA TRONCATA: si calcola come media aritmetica della porzione centrale dei dati ; vengono scartate (di solito simmetricamente) le code della distribuzione. e) MEDIA GEOMETRICA: rappresenta il prodotto di N numeri. Media geometrica = N π i x i i = 1 N Il simbolo π indica il prodotto di tutti i valori.

7 Corso di laurea in Tossicologia In relazione alla diversa sensibilità ai dati aberranti, la media ne è influenzata, la mediana non è influenzata dalla loro presenza, la media troncata rappresenta un compromesso tra le prime due, in quanto si basa su un numero consistente di dati ma non usa gli estremi del campione, tra i quali si possono trovare i valori aberranti. Indici di dispersione a) CAMPO DI VARIAZIONE: Il modo più semplice per indicare la variabilità di un insieme di dati, è di esprimerlo come differenza tra il più grande (valore massimo) ed il più piccolo (valore minimo) dei dati sperimentali o misure. b) DEVIAZIONE MEDIA (Mean Deviation): MD = [ x i x ]/N

8 Viene definita anche «scostamento semplice medio assoluto dalla media aritmetica» Corso di laurea in Tossicologia c) DEVIAZIONE STANDARD: (x i x) 2 d) VARIANZA: s 2 = [ (x i - x) 2 ] / (N-1) (N-1) La deviazione standard, chiamata anche scarto quadratico medio, viene indicata con s. s è cioè la radice quadrata dei quadrati degli scarti dalla media aritmetica divisi per il numero di gradi di libertà. La varianza di un insieme di dati è definita come il quadrato della deviazione standard.

9 Corso di laurea in Tossicologia Quando il numero di dati sperimentali disponibili è molto elevato (al limite tende ad infinito) la deviazione standard è definita dalla relazione: σ = [ (x i x) 2 ] / N dove x i è la misura iesima, x µ è la media e N il numero di prove. Nel caso più frequente, in cui i dati sperimentali sono limitati, la deviazione standard viene stimata attraverso la grandezza s definita dalla relazione: s = [ (x i x) 2 ] / (N 1) dove N-1 rappresenta i gradi di libertà. Si utilizza s, al posto di σ per evidenziare il fatto che, avendo a disposizione una serie limitata di dati, non si ha la pretesa di calcolare la deviazione standard, ma solo di darne una valutazione che risulterà tanto più attendibile quanto maggiore è il numero di prove effettuate.

10 Proprietà della deviazione standard o dello scarto quadratico medio Corso di laurea in Tossicologia Se la variabile x ha distribuzione normale con media x e varianza s 2, allora: a) Il 68,27% dei casi è compreso tra x s e x + s (cioè una deviazione standard da ogni parte della media). b) Il 95,45% dei casi è compreso tra x 2s e x + 2s (cioè due deviazioni standard da ogni parte della media). c) Il 99,73% dei casi è compreso tra x 3s e x + 3s (cioè tre deviazioni standard da ogni parte della media).

11 Corso di laurea in Tossicologia Quando N tende ad infinito, il valore medio delle misure sperimentali (in assenza di errori sistematici) tende al valore vero, convenzionalmente indicato con µ, mentre la deviazione standard stimata s (o campionaria) tende alla deviazione standard della popolazione σ. Il valore di s (deviazione standard campionaria) indica la imprecisione di una misura ed è legata agli errori casuali. Quindi l imprecisione, di solito, viene espressa come deviazione standard (s) e descrive l accordo tra due o più misure replicate, cioè la vicinanza reciproca delle misure all interno di un insieme di misurazioni e risulta correlata agli errori casuali.

12 Corso di laurea in Tossicologia Più utile può essere l espressione della imprecisione (come ripetibilità o riproducibilità) in termini di coefficiente di variazione o deviazione standard relativa percentuale (RSD%), cioè di imprecisione percentuale : CV = RSD % = [s / x] x 100 È chiaro che ad un piccolo CV corrisponde poca dispersione dei dati attorno ad un valore medio e quindi un elevata precisione ed una bassa imprecisione. Il Laboratorio può stimare la imprecisione del proprio metodo effettuando misure replicate dello stesso materiale di controllo nella stessa serie analitica (ripetibilità, imprecisione entrosaggio), oppure in serie analitiche differenti (riproducibilità, imprecisione tra-saggi).

13 Corso di laurea in Tossicologia È evidente che la ripetibilità risulterà migliore della riproducibilità; infatti, nella replica dello stesso campione in serie analitiche differenti, concorreranno ad aumentare la variabilità anche cause di errore (differenze nelle condizioni sperimentali del saggio, differenze nei reattivi) che non sono presenti quando le misure vengono replicate all interno della stessa serie analitica. Per lo stesso motivo la riproducibilità calcolata da replicati eseguiti in un periodo molto lungo potrà risultare più elevata rispetto a quella stimata da replicati eseguiti in un intervallo di tempo relativamente più breve. Dispersione o Range: è un altro termine che spesso viene utilizzato per descrivere la precisione di un insieme di risultati replicati. Esso è la differenza tra il valore più grande e quello più piccolo dell insieme.

14 La deviazione standard di risultati calcolati Propagazione dell errore nelle somme e differenze Corso di laurea in Tossicologia L esempio seguente dimostra come si ottiene la deviazione standard di una somma e di una differenza. ESEMPIO: Si consideri la somma [0.50 (± 0.02) (± 0.03) 1.97 (± 0.05) = 2.63 (±?) L incertezza associata al risultato potrebbe essere uguale a 0.10 nel caso in cui i segni delle tre deviazioni standard fossero tutti positivi o tutti negativi. E anche possibile che le incertezze possano combinarsi per dare un errore uguale a zero.

15 Corso di laurea in Tossicologia Nessuna di queste possibilità è verosimile quanto una combinazione che dia luogo ad un incertezza intermedia tra questi estremi. Può essere statisticamente dimostrato che la deviazione standard più probabile per una somma e per una differenza è data dalla radice quadrata della somma delle varianze assolute individuali: S y = s a 2 + s b 2 + s c 2 dove s y è la D.S. del risultato ed s a, s b, s c sono le D.S. dei tre termini della somma. Nell esempio precedente la D.S. sarà data da: Sy = (±0.02) 2 + (±0.03) 2 + (±0.05) 2 = ± 0.06 E la somma potrà essere riportata come 2.63 ± 0.06

16 Propagazione dell errore nei prodotti e nei quozienti Corso di laurea in Tossicologia L esempio seguente dimostra come si ottiene la deviazione standard di un prodotto o di un quoziente. ESEMPIO: Si considerino i seguenti calcoli: 4.10 (±0.02) x (±0.0001) 1.97 (±0.04) = (±?) Occorre sottolineare che le D.S. di due numeri di questo calcolo sono più grandi del risultato stesso. Allora, ovviamente, noi non possiamo ottenere la D.S. desiderata dalla combinazione diretta delle incertezze, come nell addizione o sottrazione.

17 Per i prodotti ed i quozienti è necessario valutare la deviazione standard relativa del risultato delle D.S. relative dei numeri coinvolti nel calcolo. Quindi: Corso di laurea in Tossicologia Qui la D.S. relativa del risultato (s y ) r è uguale alla radice quadrata della somma dei quadrati delle D.S. relative dei singoli numeri. Perciò:

18 Corso di laurea in Tossicologia E per ottenere la D.S. assoluta del risultato: S y = y (±0.029) = (±0.029) = ± L incertezza nel risultato può essere indicata dalla notazione: ±

19 Corso di laurea in Tossicologia Per i calcoli che coinvolgono le quattro operazioni, devono essere valutate per prime le incertezze associate con le somme e con le differenze.

20 Corso di laurea in Tossicologia

21 Livelli di fiducia Corso di laurea in Tossicologia Il valore esatto della media per un campione appartenente ad una popolazione di dati non può mai essere determinato con assoluta precisione perché richiederebbe un infinito numero di misure. La teoria statistica ci permette comunque di fissare dei limiti attorno ad una media sperimentale x nei quali il valore vero µ si trova con una certa probabilità. Questi limiti sono denominati limiti di fiducia e l intervallo da essi definito è noto come intervallo di fiducia. L estensione dell intervallo di fiducia, che deriva dalla deviazione standard del campione, dipende dall accuratezza di s.

22 I limiti di fiducia definiscono quindi un intervallo attorno ad x che con una certa probabilità contiene µ. Corso di laurea in Tossicologia L intervallo di fiducia è, a sua volta, definito dai limiti di fiducia. Il livello di fiducia fissa i limiti entro cui deve trovarsi il valore vero. L espressione generale per i limiti di fiducia (LF) di una singola misura è data dall equazione: LF per µ = x Per la media di N misure si utilizza l errore standard della media σ/ N al posto di σ, per cui LF per µ = x zσ/ N zσ

24 Quando non si conosce σ, ma si dispone di s, che essendo ottenuto da un piccolo insieme di dati, può essere piuttosto incerto e quindi affetto da notevole variabilità. Corso di laurea in Tossicologia Come conseguenza, non disponendo di una buona stima di σ, i limiti di fiducia saranno necessariamente più ampi. Per tenere in considerazione la variabilità di s, si utilizza l importante parametro statistico t (t di Student), definito dall equazione: t = x - µ s Il valore di t dipenderà dal livello di fiducia desiderato ed anche dal numero di gradi di libertà utilizzati nel calcolo di s.

26 I limiti di fiducia per la media x di N misure replicate possono essere derivati da t attraverso l equazione: Corso di laurea in Tossicologia LF per µ = x t s N

27 TESTS DI SIGNIFICATIVITÀ Corso di laurea in Tossicologia Definizione di test di significatività: Un test di significatività è un metodo statistico che consente di stabilire se più risultati siano o meno significativamente diversi. Si parte sempre da una ipotesi nulla H 0, che è l ipotesi che non ci sia differenza significativa tra i risultati confrontati. Si stabilisce quindi se l ipotesi nulla è vera o falsa al livello di confidenza scelto.

28 Corso di laurea in Tossicologia Principali test di significatività: t-test per la verifica dell esattezza. F-test per la verifica della precisione. Q-test per la verifica di dati anomali. Test 2 χ per la verifica della normalità di una distribuzione.

29 t-test per il confronto di una media con un valore noto f Corso di laurea in Tossicologia t t oss oss x t tab < t tab > t tab s n x x noto x x + t + t oss x tab s n s n t oss = x noto s l ipotesi nulla è accettata, cioè non vi è differenza significativa tra x e x noto al livello di confidenza scelto. l ipotesi nulla è rigettata, cioè vi è differenza significativa tra x e x noto al livello di confidenza scelto. n x Il livello di confidenza P scelto, ovvero il livello di significatività α scelto, e il valore di n determinano il valore numerico di t tab. Il t-test è un test di esattezza.

32 Upper critical values of the F distribution For numerator degrees of freedom and denominator degrees of freedom 5% significance level Corso di laurea in Tossicologia

36 k \ α Corso di laurea in Tossicologia

37 Il Metodo dei Minimi Quadrati per la Corso di laurea in Tossicologia realizzazione di Curve di Calibrazione La maggior parte dei metodi analitici è basata su una curva di calibrazione ricavata sperimentalmente, in cui viene riportata una quantità misurata (y) in funzione della concentrazione nota (x) di una serie di standard. y x

38 Corso di laurea in Tossicologia Esiste una tecnica statistica, chiamata Analisi di Regressione, che consente di ottenere tale retta in maniera obiettiva, e di specificare le incertezze associate al suo utilizzo. Normalmente, a causa degli errori indeterminati associati al processo di misurazione, non tutti i punti si trovano esattamente sulla retta. Di conseguenza, è necessario cercare di derivare la retta migliore che interpoli i punti. Consideriamo la procedura di regressione più semplice, il metodo dei minimi quadrati.

39 Corso di laurea in Tossicologia Per applicare questo metodo deve esistere una relazione lineare tra la variabile misurata (y) e la concentrazione dell analita (x). Questa relazione è espressa come: y = a + bx a intercetta (sull asse delle y) b coefficiente di regressione, pendenza della retta La deviazione verticale di un punto dalla retta è chiamato residuo.

40 Corso di laurea in Tossicologia Assorbanza 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, ,5 1 1,5 2 2,5 Concentrazione Residuo = y i (bx i + a) La linea costruita con il metodo dei minimi quadrati è tale da minimizzare la somma dei quadrati dei residui corrispondenti a tutti i punti.

41 Corso di laurea in Tossicologia Si può dimostrare che per l equazione di questa retta, che è del tipo y = a + bx, il coefficiente angolare b (coefficiente di regressione) è dato dalla relazione. b = Σ (x i x) (y i y) Σ (x i x) 2 Dove x i sono tuti i valori della variabile indipendente x ed y i quelli della variabile dipendente y. L intercetta a si ottiene poi dall equazione: a = y - bx

42 Corso di laurea in Tossicologia Per stabilire fino a che punto l equazione di regressione calcolata con il metodo dei minimi quadrati può essere usata al fine di trovare un valore di x conoscendo quello di y, si calcola un particolare parametro, chiamato coefficiente di determinazione. R 2 = [ Σxy (Σx)(Σy)/n ] 2 [ Σx 2 (Σx) 2 /n] [ Σy 2 (Σy) 2 /n] R 2 può assumere valori compresi tra 0 ed 1. Se R 2 = 1 esiste una perfetta relazione lineare fra x ed y, per cui ad un determinato valore di x corrisponde uno ed un solo valore di y.

43 Corso di laurea in Tossicologia La radice quadrata del coefficiente di determinazione è il coefficiente di correlazione: r = R 2 r può assumere valori compresi tra -1 ed +1 Un coefficiente di correlazione > 0,99 viene considerato in indicatore di linearità

44 β-carotene negli oli di semi (λ = 464nm) Corso di laurea in Tossicologia Abs Abs ppm STD 5 3, ,00 STD 4 1, ,00 STD 3 0,3747 2,00 a = 0,01751 STD 2 0,1134 0,50 b = 0,17327 STD 1 0,0412 0,25 r = 0, ,0000 3,5000 3,0000 2,5000 2,0000 1,5000 1,0000 0,5000 0,0000 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 ppm y = 0, ,1733x R 2 = 0,9999

45 β-carotene negli oli di semi (λ = 464nm) Corso di laurea in Tossicologia x = (y - a)/b conc (ppm) = (Abs - 0,0175)/0,1733 Abs ppm girasole 0,0304 0,1 mais 0,1771 0,9 zucca 0,9713 5,5

46 LA SENSIBILITÀ Corso di laurea in Tossicologia La sensibilità di un metodo indica quanto esso sia sensibile alle variazioni di concentrazione di un analita. Può essere individuata attraverso la pendenza (b) della retta.