WESTERN BLOOT. Dott.ssa Angelucci C.B.

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1 WESTERN BLOOT Dott.ssa Angelucci C.B.

2 Cosa e un Western Blot? Una tecnica in cui le proteine sono, inizialmente, separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Con questa tecnica una proteina viene identificata mediante una reazione specifica con un anticorpo. Dott.ssa Angelucci C.B.

3 Tecnica Immunochimica Mediante anticorpi (immunoglobuline) è possibile rilevare la quantità di antigene (proteine, polisaccaridi e acidi nucleici) sfruttando il riconoscimento specifico di un determinante antigenico (epitopo). Dott.ssa Angelucci C.B.

4 Citofluorimetria Western, Southern e Northern Blot FIA Alpha Screen RIA Anticorpo Immuno-microscopia ELISA Dott.ssa Angelucci C.B.

5 Gli anticorpi sono proteine prodotte dalle cellule B del sistema immunitario. Esistono cinque classi di anticorpi che appartengono alla categoria delle molecole proteiche dette Immunoglobuline: A, E, G, M, D. La loro produzione, da parte delle cellule plasmatiche, è provocata dall introduzione nell organismo di una sostanza estranea, l antigene (Ag), avente determinate caratteristiche fisico-chimiche. L antigene è riconosciuto per queste particolarità dai siti di combinazione dell anticorpo.

6 Consistono di due frammenti: il frammento Fc e il frammento Fab. IgG Fab= Frammento legante l Ag Fc= Frammento cristallizzabile Il frammento Fc, in un dato animale, è sempre lo stesso in tutti gli anticorpi. Il frammento Fab, invece, è variabile, riconosce e si lega ad un epitopo dell antigene Dott.ssa Angelucci C.B.

7 Forze non covalente Forze non elettrostatiche Legami ad idrogeno origine Attrazione tra cariche opposte Idrogeno condiviso tra atomi elettronegativi (N,O) Forze di Van der Waals Oscillazioni delle nuvole elettroniche attorno alle molecole polarizzano in modo opposto gli atomi adiacenti Forze idrofobiche I gruppi idrofobici interagiscono sfavorevolmente con l acqua e tendono ad associarsi per escludere le molecole d acqua. L attrazione avviene anche per le forze di Van der Waals Dott.ssa Angelucci C.B.

8 La tecnica immunochimica si basa sull interazione antigene-anticorpo Primo anticorpo detto anche primario: si distingue in policlonale e monoclonale Secondo anticorpo detto anche secondario: generalmente marcato con un tracciante

9 Anticorpi primari: si distinguono in policlonali e monoclonali. Anticorpi policlonali: quando un antigene viene iniettato in un animale (topo, coniglio, capra) viene prodotta una miscela di anticorpi. Migliaia di parti diverse (epitopi) dell antigene sono coinvolte nell attivazione di migliaia di cloni di cellule B, ciascuno producente un anticorpo diverso. Questi anticorpi sono chiamati policlonali perché hanno specificità diverse verso epitopi diversi. Anticorpi monoclonali: gli anticorpi monoclonali sono anticorpi identici diretti contro un epitopo specifico di una proteina. Sono prodotti da un clone derivato da una singola cellula. Anticorpo primario antigene

10 Sono anticorpi marcati, diretti contro il frammento Fc, che consentono di rilevare l avvenuto legame all antigene e quindi la presenza dell anticorpo primario. Vantaggi uso anticorpi secondari: Anticorpi secondari 1. Amplificazione del segnale, aumento sensibilità del saggio. 2. Il secondario può essere usato contro tutti gli anticorpi primari prodotti nello stesso organismo (es. contro tutti i primari prodotti in coniglio) Amplificazione del segnale Anticorpo secondario Anticorpo primario

11 Anticorpi primario 1 2 POLICLONALI Epitopi sull antigene Topo inoculato con l Ag opportuno Siero contenente l Ab policlonale Dott.ssa Angelucci C.B.

12 Produzione di anticorpi policlonali L anticorpo può essere prodotto contro cellule batteriche vive o morte (uccise al calore per 30 minuti in modo da esporre le molecole che costituiscono la parete), contro specifici prodotti batterici come tossine o enzimi e contro frazioni cellulari specifiche (ribosomi, oligosaccaridi, lipoproteine, glicoproteine) [Hampton et al., 1990]. Ciò può essere ottenuto in diversi modi: - con iniezioni endovenose multiple con dosi crescenti di antigene (con tempi brevi tra un iniezione ed un altra per evitare la distruzione dell antigene da parte del sistema immunitario).

13 - con iniezioni sottocutanee o intramuscolari: tale metodica garantisce un lento rilascio dell antigene nel sangue assicurando, con un minor numero di iniezioni di richiamo, una presenza continua per diverse settimane [Hampton et al., 1990]. Generalmente le procedure di immunizzazione più rapide portano ad un minor titolo ma ad una maggior specificità dell antisiero. Le principali globuline ottenibili con i normali metodi sono IgM ed IgG. La determinazione del titolo di un anticorpo è data dalla massima diluizione del siero alla quale è ancora osservabile una reazione anticorpo-antigene (Ab-Ag).

14 PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI Immunizzazione di animali Raccolta del plasma contenente gli anticorpi Purificazione iniziale (precipitazione) Aggiunta di stabilizzanti, conservanti Purificazione con cromatografia (scambio ionico) Filtrazione sterile Prodotto liquido Liofilizzazione Prodotto in polvere

15 Anticorpi primario MONOCLONALI 1 1 Epitopi sull antigene Singoli antigeni 1 milza Linfociti produttori di anticorpi Cellule di mieloma Ibridomi selezionati e clonati In vitro propagazione In vivo Anticorpo monoclonale specifico Dott.ssa Angelucci C.B.

16 Produzione di anticorpi monoclonali Per anticorpi monoclonali si intende una popolazione omogenea di anticorpi prodotti da un clone cellulare (ibridoma) ottenuto per fusione di cellule immunoproduttrici con cellule di mieloma maligno, dotate di specificità verso un solo epitopo dell antigene immunizzante [Pelckzar et al., 1982; Eisen, 1993]. La fusione tra i linfociti B (provenienti dalla milza e dai linfonodi di un animale immunizzato) e il mieloma di topo, viene ottenuta per intervento di un promotore di fusione di membrana, come il polietilenglicole. Le cellule ibride, o ibridomi, vengono coltivate in vitro dove continueranno a produrre anticorpi monospecifici e a moltiplicarsi. Il terreno su cui sono allevati gli ibridi è di tipo selettivo conosciuto con il nome di HAT, che proprio per la sua composizione, inibisce la crescita sia dei mielomi che delle cellule della milza non fuse, ma non dell ibridoma che completa le due linee parenterali.

17 Applicazione degli anticorpi monoclonali Reagenti precisi per ricerca Tipizzazione tissutale Analisi sierologiche Manipolazione risposte immunitarie Trattamento malattie autoimmuni Applicazione degli anticorpi monoclonali Diagnosi ed epidemiologia agenti infettivi Identificazione dei prodotti dei geni oncogeni Potenziamento del rigetto tumorale Purificazione di sostanze presenti in microquantità (cromatografia per affinità) Diagnostica di tumori e metastasi in vivo

18 A cosa serve il Western Blot? Qual è la proteina che mi interessa? SDS-PAGE e Western blot ? Quanta proteina di interesse c è? 100 mg di proteina mg Densità ottica % Densità ottica y = -0, ,5912x R= 0, mg di proteina Dott.ssa Angelucci C.B.

19 Principio del Western blotting - SDS-PAGE -Trasferimento blotting delle proteine dal gel ad una membrana (nitrocellulosa o Polivinilidene Fluoruro, PVDF) (allestire il sandwich) -saturazione (blocking) della membrana (latte, BSA, gelatina) -Incubazione con il I anticorpo -Incubazione con il II anticorpo, coniugato con un tracciante - rilevazione Dott.ssa Angelucci C.B.

20 Tipologie di Blotting Wet Transblot system Semidry system Dott.ssa Angelucci C.B.

21 Come preparare il sandwich Dott.ssa Angelucci C.B.

22 Trasferimento su carta di nitrocellulosa Casting nero Casting bianco Partendo dal casting nero: 1 spugna 2 fogli di carta Gel Membrana 2 fogli di carta 1 spugna Nell assemblaggio si colloca nero nella direzione del nero, bianco nella direzione del rosso. Le proteine, cariche negativamente, corrono verso il polo positivo Tampone di trasferimento (1L): 3.03 g Tris, g glicina, 800 ml H 2 O, 200 ml MeOH. Dott.ssa Angelucci C.B.

23 Apparato WET TransBlot Gel Membrana Carta assorbente Spugna - Catodo + Anodo Tampone di trasferimento Dott.ssa Angelucci C.B.

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27 Semidry system - Catodo Carta assorbente Spugna Corrente Proteine Gel Membrana + Anodo Dott.ssa Angelucci C.B.

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31 Confronto tra i due sistemi Spugna-cassetta - Carta da filtro Gel Membrana Tampone + Apparato Semidry WET Trans Blot Vantaggi: veloce, economico (meno buffer) Svantaggi: efficienza di trasferimento limitata (dimensione gel, % acrilammide, peso molecolare) Dott.ssa Angelucci C.B.

32 Western blotting 1. Preparazione del sandwich (scelta supporto: PVDF, nitrocellulosa) 2. Blotting (wet o semidry; 1h a 100 V oppure o/n a 30 V) 3. Immunodetection (blocking, incubazione con Ab specifico e con Ab secondario per la detection) Dott.ssa Angelucci C.B.

33 Dopo trasferimento: Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards, Bio Rad Dott.ssa Angelucci C.B.

34 Rosso Ponceau La colorazione tramite rosso di ponceau è utilizzata per rilevare e colorare le proteine su acetato di cellulosa, PVDF e membrane di nitrocellulosa. La procedura è reversibile e non invasiva e permette ulteriori test di carattere immunologico sul campione. Il limite minimo per l identificazione è di 250 ng di proteina in gel di poliacrilamide. Il colorante è fortemente elettronegativo e si lega ai gruppi amminici della proteina, oltre che alle regioni non covalenti e non polarizzate. Preparazione: 10 ml H 2 O distillata 0.3 ml acido acetico glaciale g Ponceau S Fino a 30 ml con H 2 O distillata Dott.ssa Angelucci C.B.

35 Versare circa 5-10 ml di soluzione di Rosso Ponceau nella vaschetta messa su un agitatore oscillante per 5 min, recuperare il colorante e decolorare con acqua distillata fino a quando non siano visibili le bande.

36 Rosso Ponceau: a cosa serve? Questo passaggio serve per valutare l'efficienza del trasferimento, la presenza di bolle, evidenziare l'area di lavoro le linee di corsa. Queste informazioni sono utili per tagliare la membrana e ridefinire l'area utile, separare le varie linee o verticalmente o orizzontalmente, destinando a trattamenti diversi i vari pezzi.

37 Detecting the protein specific antibodies: -Blocking the membrane with 5-10% nonfat dried milk in PBS for 1 hour or overnight at 4 C with shaking. -Wash in PBS with 0.1% Tween-20, 3 X, and 10 min for each time. -Incubate with Primary Antibody in 1% BSA in PBS for 1 hour at room temperature or overnight at 4C by shaking. -Wash in PBS with 0.1% Tween-20, 3 X, and 10 min of each time -Incubate with secondary antibody (peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG, etc.) following the manufacturer s instruction, usually 1:200 to 1:2000; 1 hour at room temperature - Wash in PBS with 0.1% Tween-20, 3 X, and 10 min of each time

38 Il marcatore deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, abbassando il limite di rivelazione del metodo. Isotopi radioattivi ( 125 I, 3 H). Molecole fluorescenti. Molecole chemiluminescenti. Enzimi determinabili con substrati: - cromogeni - fluorescenti - chemiluminescenti

39 Scelta del marcatore Tracciante limite di rivelazione TRACCIANTE SEGNALE 125 I dpm Enzima Assorbanza Luminescenza Fluorescenza Amplificazione ciclica del segnale Molecola Fluorescente Molecola Chemiluminescente Fluorescenza mv

40 Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? L attività catalitica dell enzima permette di amplificare il segnale analitico. Un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto. S E La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante L enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

41 Traccianti enzimatici Enzima Sistema di rivelazione Metodologia analitica Perossidasi H 2 O 2 /cromogeno Spettrofotometria H 2 O 2 /luminolo Chemiluminescenza Fosfatasi alcalina 4-nitrofenilfosfato Spettrofotometria 4-metilumbelliferone-fosfato AMPPD* Fluorimetria Chemiluminescenza b-galattosidasi 2-nitrofenolo Spettrofotometria 4-metilumbelliferone 2-naphthyl-b-Dgalactopyranoside Fluorimetria Chemiluminescenza * 3-(2 -spiroadamantyl)-4-methoxy-4-(3 -phosphoryloxy)-phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD or m-amppd) (Ling Yue and Ya-Jun Liu. J.Chem. Theory Comput., 2013, 9 (5), pp )

42 Traccianti enzimatici: un po di storia 1941 Coons: Anticorpi marcati con fluoresceina per localizzare antigeni in sezioni di tessuto 1966 Nakane: Anticorpi marcati con enzimi 1970 Sternberger: Perossidasi erossidasi-anti Perossidasi erossidasi (PAP) 1981 Hsu: Avidin Biotin Complex (ABC) 1984 Cordell:: Alkaline Phosphatase Anti Alkaline Phosphatase (APAAP)

43 Colorazione Indiretta Colorazione Diretta II anticorpo marcato con il tracciante I anticorpo I anticorpo marcato con il tracciante antigene antigene elevata sensibilità versatilità costo maggiore tempi più lunghi costo minore rapidità scarsa sensibilità Dott.ssa Angelucci C.B.

44 1) Saturazione dei siti aspecifici con il latte non grasso 2) I anticorpo specifico per l albumina 3) II anticropo coniugato con la perossidasi di rafano 4) Sviluppo del colore per aggiunta del substrato con formazione di prodotto Dott.ssa Angelucci C.B.

45 Chemiluminescenza ECL Dott.ssa Angelucci C.B.

46 La Chemiluminescenza (ECL) La chemiluminescenza è la luminescenza emessa nel corso di una reazione chimica, generalmente un ossidazione. Nel caso del Luminolo la reazione di ossidazione può avvenire in presenza di H 2 O 2 e O 2 atmosferico hn Dott.ssa Angelucci C.B.

47 Procedura di Staining con Anticorpi Colorazione Diretta luminolo + H 2 O 2 HRP luminolo ox hn Colorazione Indiretta luminolo + H 2 O 2 luminolo ox HRP hn Dott.ssa Angelucci C.B.

48 Biotina-streptavidina Una procedura che sfrutta il vantaggio dell interazione specifica ad alta affinità tra la biotina e la streptavidina. Prevede l uso di un Ab biotinilato e preparazioni marcate con streptavidina Il sistema Streptavidina-Biotina si basa sulla affinità fra la streptavidina, una glicoproteina con PM di circa D presente nell albume (avidina) oppure prodotta dallo streptomyces avidinii e la biotina, piccola molecola vitaminica. In particolare la biotina si lega ai gruppi aminici -NH 2 degli Anticorpi di modo che più molecole di biotina corrispondono a ciascuna molecola di Ig Streptavidin

49 Il complesso avidina-biotina è costituito da una molecola di avidina che è legata a tre molecole di biotina che a loro volta sono legate alla perossidasi (perossidasi di rafano). Ogni molecola di avidina ha quattro siti di legame per molecole di biotina. Nel complesso avidina-biotina tre dei siti sono occupati da altrettante molecole di biotina, ciascuna legata ad una molecola di perossidasi, che è l enzima marker; il quarto sito è disponibile per formare un legame con una molecola di biotina legata all anticorpo secondario (anticorpo secondario biotinilato). Il complesso ABC è quindi un efficace dispositivo di rivelazione dell anticorpo secondario e consente un amplificazione del segnale: tre molecole di marker per ogni molecola di anticorpo secondario e più molecole di secondario si possono legare ad una di anticorpo primario. Schematic representation of the Avidin-Biotin Complex (ABC) staining method. In più ogni molecola dell enzima marker lega più di una molecola di biotina, per cui può fare da ponte tra il complesso che si è legato direttamente all anticorpo secondario biotinilato ed altri complessi liberi, amplificando ulteriormente il segnale. Lo sviluppo della reazione si ha aggiungendo un substrato per l enzima perossidasi.

50 Vantaggi: Alta affinità della streptavidina per la biotina, E possibile ottenere un elevato rapporto fluorocromo/enzimaproteina, Elevata amplificazione del segnale, La streptavidina coniugata è molto stabile, Un singolo coniugato marcato può essere utilizzato in molteplici metodiche, Basso costo

51 Western Blot (esempio) Lipossigenasi di Frumento Omogenato di frumento Dopo western blotting Lipossigenasi di frumento Lipossigenasi di soia Omogenato di soia Lipossigenasi di soia Dopo western blot Lectina Elettroforesi e western blotting gentilmente forniti dalla Dott.ssa M.Simonetti Dott.ssa Angelucci C.B.

52 . Southern Blot Analysis Questa tecnica prende il nome di Southern blotting in quanto ideata da Edwin Southern. Procedura: Isolare DNA genomico Digerirlo con enzima di restrizione specifico Elettroforesi dei frammenti di DNA su gel d agarosio Denaturare il DNA per separare i filamenti complementari Trasferire il DNA su membrana Ibridazione con una sonda marcata Visualizzazione del segnale (autoradiografia o colorimetria)

53 Capillary Transfer 1. A weigt of about 0.5 kg 2. A plate, made of glass, PVC or similar. 3. A stack of dry paper towels 4. A sheet of pre-wetted nylon blotting membrane with a double layer of pre-wetted gel blotting paper put on top 5. The gel 6. The wick: a double layer of pre-wetted gel blotting paper 7. A plate similar to 2 8. Two open containers filled with 0.4M NaOH 9.An supporting empty container, upside down.

54 Ibridazione la capacità di una molecola di acido nucleico a singolo filamento di formare una doppia elica con un'altra sequenza composta di basi a essa complementari Le sonde utilizzate possono essere: Oligonucleotidi a DNA marcati terminalmente con radioattivo, DNA a doppio filamento marcati in continuo con radioattivo, Oligonucleotidi a RNA marcati terminalmente con radioattivo

55 Dopo aver allestito il nostro Southern blot

56 Un frammento di restrizione contenente una specifica sequenza di basi può essere identificato ibridandolo con un filamento marcato di DNA complementare. Una miscela di frammenti di restrizione viene separata tramite elettroforesi su gel di agarosio, quindi si denatura il DNA portandolo nella forma a singola catena e lo si trasferisce su un foglio di nitrocellulosa ( blotting ) come descritto nella figura seguente: Elettroforesi Frammenti di DNA Trasferimento del DNA mediante blotting Aggiunta di una sonda di DNA marcata (ibridazione) Sonda di DNA rilevata Autoradiografia Gel di agarosio Membrana di nitrocellulosa Autoradiogramma

57 Dopo trasferimento del DNA mediante blotting i vari frammenti di DNA mantengono sulla nitrocellulosa le stesse posizioni che avevano nel gel. Le posizioni possono essere determinate esponendo il foglio a un filamento di DNA a singola elica di sequenza nota (detta probe o sonda) marcato (fluorescenti o radioattivi). La sonda si lega con un filamento complementare e l autoradiografia rivela quindi la posizione dell insieme ibridato (cioè del complesso frammento di restrizionesonda). In questo modo si può identificare un frammento particolare in mezzo a milioni di altri frammenti. Autoradiography is the use of X-ray (or occasionally photographic) film to detect radioactive materials. It produces a permanent record of the positions and relative intensities of radiolabeled bands in a gel or blot. Typically, biomolecules are labeled with 32 P or 35 S, and detected by overnight film exposure.

58 Radioactive Exposure of Film: Beta particles emitted by radionuclides penetrate film emulsions to a depth proportional to their energy. As these particles pass through the film, they activate the silver halide crystals in the emulsion. Activated crystals are detected by reduction to black silver grains in the development step. The activated silver halide crystals are not stable, although they can be stabilized by further exposure to b-particles, or to light. On average, a crystal will require 5 "hits" from either radioactive emissions or light to be stably activated, and thus detected. In order to compensate for this instability, autoradiography is often carried out at -70 C, which stabilizes the activated crystals, enhancing sensitivity. Additional sensitivity is gained by "preflashing" the film before use. The film is exposed to a microsecond burst of light which is calibrated to bring the crystals in the film to a partially stabilized, activated state. Preflashed film requires only one "hit" per grain deposited. This not only increases sensitivity but also ensures that the film signal will be linear with the amount of radioactivity, even at very low signal levels.

59 Fluorography Sensitivity of autoradiography can be greatly enhanced through the use of fluorography, which converts radioactive emissions into light. Light penetrates film more efficiently than beta particles and is therefore more readily detected. Various phosphor compounds are available which can be dried into a gel, and which absorb the energy from beta particles and re-emit it as light. Typical autoradiographic technique involves enclosing the gel or blot with X-ray film for at least 24 hours within an X- ray cassette. Development of the film reveals the gel or blot image. Note the use of radioactive or phosphorescent dots to record the orientation of the film.

60 Autoradiography: The Procedure 1 Prepare gel or blot. 2 Wrap wet samples in plastic wrap. 3 Tape the sample to the inside face of an X-ray cassette, with enhancement screens for 32 P if desired. It is essential to fasten the sample so that it does not move, because it must later be aligned with the exposed film. 4 Along one side, fasten a phosphorescent ruler or other orientation aid (radioactive dots). If a marker other than a ruler is used, be sure to include enough markers to unambiguously align the developed film to the sample. 5 In the dark or under safelight place one piece of X-ray film over the sample. For 35 S or 14 C, room temperature exposure is sufficient. For 32 P, intensifying screens require a temperature of -70 C for exposure. 6 Expose film. Use the tables above as a guide for length of exposure. A good rule of thumb is that bands must be detectable on a Geiger counter for overnight exposure to be sufficient. 7 To avoid condensation on the film allow the cassette to return to room temperature before opening. Develop the film according to manufacturer's instructions.

61 Utilizzata per: Determinare la presenza o assenza di specifici frammenti genici, E per lo studio della struttura e dell organizzazione di un gene Applicazioni: Analisi forense Diagnosi di malattie ereditarie (es. fibrosi cistica, distrofia muscolare, ecc.) Individuazione di agenti patogeni nelle infezioni Analisi filogenetiche Mappatura del genoma Controllo degli OGM

62 Vantaggio: Elevata specificità Svantaggio: Metodologia che richiede tempo. Richiede discrete quantità di DNA

63 La stessa procedura di analisi può essere seguita per individuare specifiche sequenze di RNA. La tecnica di analisi dell RNA è stata chiamata Northern blotting. Procedura: Isolare l RNA Applicazioni: studi sull espressione genica Per determinare la dimensione e la quantità di specifici RNA Elettroforesi dell RNA su gel (agarosio o PAGE) Trasferire l RNA su membrana Ibridazione con una sonda marcata Northern Blot Analysis Visualizzazione del segnale (autoradiografia o colorimetria)

64 Ibridazione DNA doppio filamento fusione DNA singolo filamento DNA si lega al filtro Membrana o filtro Incubare con la sonda marcata Lavare il DNA marcato non ibridizzato Autoradiografia

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66 Tutorials: Western Blot Southern blot Northern blot

67 Buon Studio