Regional Center on Endocrine Hereditary Tumors, AOUC, Department of Internal Medicine, University of Firenze

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1 Approccio ribonomico allo studio di una malattia genetica rara e complessa che predispone al cancro: la sindrome MEN1 come modello E Luzi Regional Center on Endocrine Hereditary Tumors, AOUC, Department of Internal Medicine, University of Firenze

2 La Neoplasia Endocrina Multipla di tipo 1 (MEN1; MIM#131100) è caratterizzata dalla presenza di tumori delle paratiroidi, del pancreas endocrino e dell ipofisi anteriore, ed include oltre 20 diverse combinazioni di tumori endocrini e non endocrini

3 Il gene MEN1 umano comprende 10 esoni distribuiti lungo una regione di 7kb nel cromosoma 11q13. Il gene MEN1 codifica per una proteina, menin, di 67kDa.

4 Il trascritto principale MEN1 mrna e di 2.8 kb ma almeno sei trascritti alternativi sono stati caratterizzati con variazioni nella regione 5 -UTR. Menin e espressa ubiquitariamente con ortologhi in vertebrati e invertebrati ma senza alcuna omologia con altre proteine o sequenze note eccetto 3 segnali di localizzazione nucleare (NLSs) alla estremita C-terminale.

5 Mutazioni germinali del gene MEN1 sono presenti in circa l 90% dei pazienti MEN1. La perdità di eterozigosità (LOH) al locus 11q13 è stata riscontrata in tumori MEN1

6 La contemporanea presenza di LOH e mutazioni germinali inattivanti nei pazienti MEN1 suggerisce che il gene MEN1 e un oncosoppressore in accordo con il modello two hit postulato da Knudson.

7 Sono state descritte mutazioni: 23% non-senso; 9%splice-sites, 41% delezioni o inserzioni frameshift, 6% delezioni o inserzioni in-frame, 20% missense e 1% delezione totale. Un totale di 24 differenti polimorfismi del gene MEN1 sono stati riportati (12 nella regione codificante, 9 negli introni, 3 nella regione 3 -UTR). Il 10%-30% dei pazienti MEN1 non ha mutazioni nella regione codificante ne nei siti di splicing cosicche le mutazioni potrebbero cadere nelle regioni 5 -UTR e/o 3 UTR, negli introni o essere fenocopie.

8 La questione fondamentale che si pone nella Sindrome MEN1 e la tessuto-specificita della tumorigenesi. Perche, in un sindrome tumorale ereditaria, le manifestazioni cliniche sono limitate ai tessuti endocrini, adiposo e dell epidermide mentre menin e espressa in tutti i tessuti? Una ipotesi e che la tessuto-specificita sia governata da un meccanismo di controllo trascrizionale e/o post-trascrizionale.

9 A supporto di questa ipotesi ci sono due evidenze : Cellule linfoblastoidi eterozigoti: un meccanismo regolativo mantiene costante il livello di espressione della proteina wild-type. Menin-Serial Analysis of Chromatin Occupancy (SACO): menin si lega a regioni promotrici, codificanti e 3 -UTR. Menin stessa potrebbe regolare trascrizionalmente e/o post-trascrizionalmente il meccanismo di compensazione.

10 RUOLO DEL GENE MEN1, DEL SUO mrna E DELLA PROTEINA MENIN Fibroblasti di due pazienti MEN1 con due diverse mutazioni troncanti eterozigoti e in fibroblasti normali. I pazienti A e B sono due sorelle con mutazione germinale eterozigote, frameshift 738del4 nell esone 3, che introduce nella proteina un codone di stop prematuro. Il paziente C presenta una mutazione germinale eterozigote nonsense R460X nell esone 10.

11 MEN1 mrna expression

12 MEN1 mrna and menin expression in MEN1 parathyroid adenomas

13 sirna-mediated silencing of MEN1 mrna

14 Ribozyme-mediated silencing of MEN1 mrna

15 Band-shift assay of menin-men1 mrna binding Western blot of menin UV-crosslinking Western blot immunoprecipitation Menin -UV +UV +UV NSP SP Anti Menin IgI Menin control PROBE 2.9kb In vitro menin recognized its mrna and specific RNA-proteins complexes bound to MEN1 mrna in MEN1 patient fibroblast extracts.

16 TargetScan analysis predicted MEN1 3 -UTR as a putative target for the mir-24a TGA MEN1 3 -UTR 818 nt AAAAAAA Predicted consequential pairing of target region (top) and mirna (bottom)) Position of MEN1 3' UTR hsa-mir-24 ΔGtotal = '...CAGCCUAUGAGCAUCCUGAGCCC... 3' GACAAGGACGACUU-GACUCG HS: AUCCUGAGCCCCG Mm: AUACUGAGCCUCG Rn: AUACUGAGCCUCG Cf: AUCCUGAGCCCUG = -256,40 mir-24a binds also p27, TGF-beta, caspase 8, p16, all involved in MEN1 tumorigenesis

17

18 micrornas AS TUMOR SUPPRESSORS OR ONCOGENES

19 The MEN1 3 -UTR is a target for mir-24a Northern blot of mir-24a Western blot of menin mir-24a menin 5S actin 1 1 : 2 -O-MeRNA AS24-a 2 : 2 -O-MeRNA ASMuta4-a 3 : pre-mircontrol 4 : pre-mir24-a 2 3 4

20 Expression of mir-24 and menin protein in MEN1 tissues Northern blot of mir-24a Western blot of menin 5S menin actin mir-24a : sporadic insulinoma 2: MEN1 insulinoma 3: MEN1 gastrinoma 4: MEN1 pancreatic cancer 5: normal pancreas of MEN1 patient

21 Control of microrna biogenesis

22 mirnas involved in feedback motifs. Some biological processes involve stochastic decisions, which make use of noise. Gene regulatory networks involving positive and negative feedback have the potential to control the effects of noise, by buffering its impact on gene expression. Computational analysis has suggested that mirnas are overrepresented in gene regulatory networks, suggesting that they confer useful regulatory possibilities.

23 CONCLUSIONI La tessuto-specificita'della tumorigenesi MEN1 potrebbe originare da perturbazioni del feedback regolativo costituito mir-24-menin-men1 mrna sotto forma di complesso ribonucleoproteico (RNA REGULON) L interazione del mir-24 con altri geni coinvolti nella tumorigenesi MEN1 potrebbe essere alla base di un meccanismo EPISTATICO che governa la complessita della patologia. Questi risultati hanno un importante significato funzionale per la comprensione della sindrome MEN1 e lo sviluppo di una RNA-based therapy per il controllo della tumorigenesi nei pazienti MEN1

24 RNA-based therapy in MEN1 syndrome

25 REGIONAL CENTER FOR HEREDITARY ENDOCRINE TUMORS Prof.ssa.Maria Luisa Brandi Laboratory of Molecular Genetics Clinicians Dott.ssa Francesca Marini Dott. Alberto Falchetti Dott.ssa. Silvia Carbonell Sala Dott.ssa. Laura Masi Dott.ssa. Isabella Tognarini Dott.ssa. Federica Cioppi Dott.ssa. Gianna Galli Dott.ssa. Antonietta Amidei and all the other lab members! Prof. FrancescoTonelli S.O.D. Chirurgia Generale