UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI ROMA LA SAPIENZA FACOLTA' DI FARMACIA E MEDICINA. Corso di Laurea di I livello in Tecniche di Laboratorio Biomedico

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1 UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI ROMA LA SAPIENZA FACOLTA' DI FARMACIA E MEDICINA Corso di Laurea di I livello in Tecniche di Laboratorio Biomedico Tesi di laurea LA METODICA DI CITOINCLUSIONE NELLA DIAGNOSI PRECOCE DELLE NEOPLASIE DEL PANCREAS Sviluppo e comparazione della tecnica del citoincluso vs citologia convenzionale RELATORE LAURENDA CORRELATORE Andrea Testa Alì Angelica Roberto Virgili Matr A/A

2 Alla mia Famiglia, a Alessio e a tutti quelli che mi hanno sempre sostenuto in questo arduo percorso. Grazie per avermi saputo ascoltare, rincuorare e incoraggiare in ogni momento.

3 INDICE Introduzione Pag. 1 1 Il Pancreas e la sua anatomia Pag Anatomia Macroscopica Pag Anatomia Microscopica Pag.7 2 Patologie del Pancreas Pag Patologie Benigne Pag Patologie Maligne: Neoplasie Esocrine del Pancreas Pag Neoplasie Solide del Pancreas: Carcinoma Duttale Pag Neoplasie Endocrine del Pancreas Pag.23 3 Approccio Diagnostico, Stadiazione e Accenni Terapeutici Pag Diagnostica di Laboratorio Pag Tecniche di Imaging Pag Il ruolo dell EUS Pag EUS-FNA Pag.35 4 La tecnica del Cell Block Pag Allestimento del Cell Block Pag Scraping Cell Blocks Pag Scraping Cell Blocks vs Conventional Cell Blocks Pag La tecnica del Cell Block verso i sistemi automatizzati:

4 Cellient Automated System Cell Block Pag Principi di funzionamento di Cellient Automated System Cell Block Pag Cellient Automated System Cell Block: Vantaggi e limiti Pag Blocchi tradizionali vs Blocchi Cellient Pag Indagini Immunoistochimiche applicate alla tecnica del Cell Block Pag Cellient Cell Block Automatizzato vs Cell blocks tradizionali: un confronto delle caratteristiche morfologiche nelle colorazioni Immunoistochimiche Pag.53 5 Istochimica Pag.55 6 Metodiche Accessorie: Immunoistochimica Pag Preparazione dei campioni Pag Indagini immunoistochimiche nelle Neoplasie Solide del Pancreas Pag.64 7 Metodiche Accessorie: Biologia Molecolare Pag La Medicina di Laboratorio Partner indispensabile nella gestione del Paziente Oncologico Pag Alterazioni Genetiche nelle Neoplasie del Pancreas Pag Marcatori Tumorali e Medicina Personalizzata nelle Neoplasie del Pancreas Pag.72

5 8 Prospettive future per le Neoplasie Pancreatiche Pag.75 9 Applicazione della tecnica del Cell Block nella routine laboratoristica per la diagnosi precoce delle neoplasie del Pancreas Pag L impatto della Citologia Agoaspirativa con Ago Sottile nella diagnosi e nel trattamento delle lesioni solide Pancreatiche nella corrente pratica clinica Pag Obiettivi dello studio Pag Materiale e Metodi Pag Allestimento manuale, Processazione e Taglio del Cell Block Pag Protocollo manuale della tecnica Immunoistochimica ( IHC) Pag Tecniche di biologia molecolare: Pirosequenziamento Pag Risultati dello studio Pag Discussione Pag Conclusioni Pag Tavole fotografiche e grafici Pag Sitografia e Bibliografia Pag.111

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7 INTRODUZIONE Il carcinoma del pancreas occupa la decima posizione per incidenza in Europa, dove rappresenta il 2.6% di tutti i tumori maschili e femminili. Nel 2006 sono stati diagnosticati circa nuovi casi in tutta Europa. Esistono sostanziali differenze geografiche rispetto all'incidenza annua del carcinoma pancreatico. Il tasso di incidenza più alto si registra negli Stati Uniti, in particolar modo tra la popolazione nera maschile (15 %). In Europa i tassi di incidenza annua sono compresi tra l'8.7 e 7.3% per quanto riguarda la popolazione maschile e tra 5.7 e 4.5% nella popolazione femminile. I tassi più bassi riguardano in genere i Paesi africani e asiatici. Fa eccezione il Giappone, dove negli ultimi decenni si è osservato un sostanziale incremento dei tassi di incidenza, con tassi attualmente simili a quelli degli Stati Uniti (Figure 1 e 2). Negli uomini, i tassi specifici per età sono una volta e mezzo superiori rispetto alle donne. L'incidenza aumenta sensibilmente con l'età da un 1.5 %/anno nei pazienti con anni di età a 55 %/anno nei pazienti anziani con più di 65 anni (Figura 3). Il carcinoma pancreatico è l ottava causa principale di morte correlata a malattia neoplastica in entrambi i sessi in Europa, dove si registrano circa decessi annui (Figura 4). Sulla base dei dati portati nei Registri Italiani dei Tumori, si osserva un incremento, di incidenza, sia tra la popolazione femminile, sia tra quella maschile, con tassi di mortalità piuttosto stabili. Tale incremento è in parte ascrivibile al perfezionamento e alla diffusione delle procedure diagnostiche. Per quanto riguarda gli Stati Uniti, i dati riportati dal SEER relativamente al periodo non presentano differenze significative. Tra tutti i pazienti oncologici, la prognosi di quelli affetti da cancro del pancreas è una delle più sfavorevoli. Alla luce dei dati dello studio EUROCARE, relativamente ai casi - 1 -

8 diagnosticati in Europa nel periodo , la sopravvivenza a 5 anni è stata del 5% (Figura 5). La sopravvivenza a 5 anni è risultata più alta nei pazienti con età compresa tra 15 e 44 anni, con un 13%, rispetto al 5%, o anche meno, registrato nel gruppo di pazienti dai 55 anni in avanti. I dati sono simili in entrambi i sessi. Non si sono registrate variazioni nel tempo relativamente alle percentuali della sopravvivenza a 1, 3 e 5 anni. Nella maggior parte dei casi, i pazienti presentavano tumori in stadio relativamente avanzato e non resecabili. Tale miglioramento è stato imputato al maggior numero di resezioni effettuate e al perfezionamento, nel tempo, delle tecniche di resezione chirurgica. L importanza di questo tumore è accresciuta dal fatto che la sopravvivenza ad un anno si assesta intorno al 21%, mentre quella a 5 anni non supera il 6%. Il miglioramento degli strumenti diagnostici, che ha ridotto l intervallo di tempo tra l inizio dei sintomi e la diagnosi di malattia, non sembra averne migliorato la prognosi. Nonostante i progressi nella ricerca, per la diagnosi di molte malattie, in particolare per il cancro, è necessaria ancora una valutazione microscopica di un campione di cellule. Per fare diagnosi, i patologi cercano alterazioni nella struttura delle cellule e modifiche nella composizione e l'organizzazione dei tessuti. È ovviamente un vantaggio poter effettuare una diagnosi o definire una terapia, basata sul campione bioptico più piccolo possibile: più piccola è la biopsia, minori sono i rischi e le complicazioni per il paziente. La citologia è il campo che utilizza la più piccola "microbiopsia" possibile per la diagnosi. La speranza della citologia è poter fornire un campione piccolo ma diagnostico. Minimizzando i rischi e le complicazioni per rilevare alcune malattie, la citologia può essere inoltre utilizzata per il controllo della malattia

9 Proprio per questo, si afferma sempre più nella diagnosi delle lesioni pancreatiche, l utilizzo dell EUS-FNA (ecografia endoscopica con possibilità di eseguire aspirazione con ago sottile) dotata di alte prestazioni diagnostiche e basso tasso di complicanze. Questa tecnica presenta un buon profilo di sicurezza, un ottima possibilità di rilevare e biopsare lesioni di dimensioni < a 10 mm con accesso a sedi difficili. Tutti questi fattori contribuiscono all aumento della performance diagnostica. Prelevato il materiale, si procede convenzionalmente con l allestimento dei classici strisci citologici. Oggi, i campioni citologici allestiti in questi frangenti possono essere non solo i classici strisci ma anche campioni per la citologia liquida, campioni che saranno poi allestiti con tecniche per scopi innovativi. Tra queste possiamo annoverare quella del CELL BLOCK. Ad esempio un campione basilare è anche il liquido di lavaggio dell ago utilizzato per l aspirazione. Questo, allestito con la tecnica del CB, contribuisce alla riduzione di perdita di materiale potenzialmente diagnostico. Il CELL BLOCK si è affermato come strumento diagnostico a partire dal 1947, anche se le prime applicazioni di questa tecnica risalgono al Oggi, l allestimento dei campioni con questa tecnica nella diagnosi del carcinoma del pancreas, a differenza dei convenzionali strisci citologici, permette di eliminare quasi tutti i limiti collegati a questi ottenendo un miglioramento nella diagnosi con la possibilità di applicare metodiche accessorie come l immunoistochimica, atta a ottenere ad esempio definizione di malignità, studiare neoplasie metastatiche e biomarcatori tumorali, e la biologia molecolare, infatti proprio grazie agli enormi progressi nella conoscenza dei meccanismi molecolari e cellulari della malattia neoplastica e alla volontà di dare attuazione ai principi della medicina personalizzata in ambito oncologico, si sono create le premesse e le aspettative per un salto di - 3 -

10 qualità nell informazione di laboratorio, che oggi giorno gioca un ruolo sempre maggiore e impegnativo nella gestione del paziente oncologico, ruolo che si estrinseca in modo paradigmatico negli ambiti della prevenzione, diagnosi precoce, monitoraggio della terapia ed infine nel follow up a lungo termine

11 CAPITOLO1 IL PANCREAS E LA SUA ANATOMIA 1.1 Anatomia macroscopica Il pancreas (Figura 6) è una grossa ghiandola di forma allungata, rassomigliante ad una lingua più spessa nella sua porzione mediale, accolta nella concavità del duodeno,, con cui si trova in stretta contiguità ed al quale è connessa da un dotto escretore (Wirsung). È più sottile e schiacciata nella sua porzione laterale che si spinge fino all'ilo della milza, in direzione antero-superiore rispetto alla testa. Si trova compreso tra le prime due vertebre lombari (L1 L2), la coda risale sino alla 7ª costa. È un organo retro peritoneale, quindi è una ghiandola profonda con una posizione in una zona molto protetta del corpo proteggendola così da insulti e questo spesso rende difficile la diagnosi di malattia. Misura circa cm dalla testa alla coda in età adulta, anche se il suo tessuto esocrino tende a diminuire con l'avanzare dell'età diventando atrofico, è largo 4 cm e spesso 2 cm. È di colore rosa salmone pallido con consistenza nodulare e superficie lobulata. Il parenchima del pancreas (morbido e friabile) è distinto in quattro parti che prendono il nome di testa, collo, corpo e coda, cui si deve aggiungere il processo uncinato, che ha una differente origine embriologica rispetto alle altre porzioni (Figura 7). Il pancreas è mantenuto stabile nella sua posizione dal duodeno, che ne accoglie la testa, dal peritoneo parietale posteriore, che lo riveste solamente nella superficie anteriore, e dal "legamento pacreaticolienale", che ne fissa la coda all'ilo della milza. La testa è la porzione più spessa e voluminosa della ghiandola, si trova accolta nella concavità duodenale, in alcuni casi parte della testa - 5 -

12 del pancreas è letteralmente incorporata nella parete duodenale. E' quasi completamente ricoperta dal peritoneo; Il collo è la prosecuzione laterale della testa, è più stretto e sottile di questa e si continua lateralmente con il corpo. Il corpo è una porzione allungata e appiattita della ghiandola che ne forma gran parte del suo prolungamento laterale, è lungo, infatti, 8-10 cm. La sua forma triangolare in sezione ne fa distinguere tre facce (antero-superiore, antero-inferiore e posteriore) e tre margini (superiore, anteriore e inferiore). La coda è l'estremità laterale della ghiandola e ne forma solo una piccola porzione, lunga mediamente 2,5 cm. Presenta un margine laterale arrotondato ed è situata tra i due foglietti del legamento lienorenale. Non è ricoperta dal peritoneo. Il processo uncinato si estende lateralmente ed inferiormente alla testa del pancreas. Il pancreas ha una ricca circolazione derivata da rami dell'arteria celiaca e della mesenterica superiore. Le arterie pancreaticoduodenali anteriori e posteriori superiori nascono come rami dell'arteria gastroduodenale, ramo dell'arteria celiaca. Le arterie pancreaticoduodenali anteriori e posteriori inferiori nascono dall'arteria mesenterica superiore. Questi vasi usualmente sono situati in un solco tra la testa del pancreas ed il duodeno e forniscono rami ad entrambi gli organi. L'altra importante irrorazione arteriosa del pancreas deriva dall'arteria splenica, che dà origine a numerosi piccoli rami ed usualmente a tre rami maggiori: la pancreatica dorsale, la pancreatica magna e la «cauda pancreatis». Il drenaggio venoso fluisce interamente nel sistema venoso portale. Le vene pancreatiche drenano la coda ed il corpo del pancreas e si uniscono alla vena splenica. Le vene pancreaticoduodenali decorrono - 6 -

13 vicino alle corrispondenti arterie e sboccano o nella vena splenica o direttamente nella vena porta. I linfatici del pancreas sono situati in vicinanza delle arterie e delle vene corrispondenti. La maggior parte dei linfatici affluisce ai linfonodi pancreatico-splenici; alcuni sfociano nei linfonodi pancreatici duodenali ed alcuni in quella preaortici vicino all'origine dell'arteria mesenterica superiore. L'innervazione viscerale efferente del pancreas è fornita dai nervi vaghi e dai nervi splancnici attraverso il plesso epatico e celiaco. Le fibre efferenti dei vaghi attraversano questi plessi senza contrarre sinapsi e terminano nei gangli parasimpatici situati nei setti interlobulari del pancreas. Le fibre postgangliari innervano acini, isole e dotti. Le fibre del sistema autonomo, sia afferenti che efferenti, sono situate in prossimità dei vasi sanguigni del pancreas. Poco nota è sulla distribuzione delle fibre afferenti viscerali nell'uomo. Esse decorrono, probabilmente, attraverso i nervi splancnici sino ai tronchi simpatici, ai rami comunicanti, ai nervi ed ai gangli spinali. Si ritiene che i vaghi contengano alcune fibre afferenti viscerali. 1.2 Anatomia microscopica Il pancreas è funzionalmente suddiviso in una parte esocrina, preponderante (che rappresenta il 97-99%) formata dagli acini pancreatici e in una endocrina (1-3%) costituita dalle isole di Langerhans. Il pancreas esocrino (Figura 8) è una ghiandola composta tubuloacinosa ramificata, suddivisa in due lobuli da sepimenti connettivali lassi che si dipartono dalla sua capsula e in cui decorrono i vasi sanguigni, i vasi linfatici e i nervi. Ciascun lobulo pancreatico è suddiviso in centinaia di acini, costituiti da raggruppamenti cellulari - 7 -

14 sferici e unità secernenti della ghiandola. Da ciascun acino parte un dotto preterminale che confluisce in un dotto intralobulare e molti dotti intralobulari confluiscono a formare un dotto intercalare che a sua volta si getta in dotti di calibro sempre maggiore sino a sboccare nel condotto pancreatico principale o in quello accessorio. Il calibro del condotto pancreatico principale (il dotto di Wirsung, che scorre all interno del pancreas centralmente, più vicino alla faccia posteriore che a quella anteriore seguendo la forma della ghiandola con un percorso leggermente sinuoso) si dirige dalla coda verso la testa passando da 1 mm nella coda a 3 mm nella testa, in virtù della necessità di accogliere quantità sempre maggiori di succo pancreatico. Giunto presso la testa il condotto pancreatico principale piega inferiormente per poi curvare di nuovo verso destra e collegarsi con il condotto coledoco, proveniente dal fegato e cistifellea, formando una struttura più espansa detta ampolla epatopancreatica comune (o ampolla del Vater). Anche nella testa il condotto pancreatico comune riceve condotti lobulari, di calibro maggiore rispetto a quelli di corpo e coda, che lo raggiungono con una disposizione quasi radiale. A sua volta l'ampolla del Vater sbocca nella parete postero-mediale della seconda porzione del duodeno, rappresentando lo sbocco comune della bile e del succo pancreatico nell'intestino. Un secondo dotto pancreatico accessorio (dotto del Santorini) è spesso presente, con il compito di raccogliere il succo pancreatico della porzione anteriore della testa del pancreas, con un calibro notevolmente inferiore rispetto al condotto principale, con cui è collegato da condotti secondari di piccolo calibro. Questo normalmente ha uno sbocco separato rispetto al dotto principale. In generale, però, entrambi i dotti presentano notevole variabilità anatomica. Il succo pancreatico, secreto dal pancreas esocrino ha un carattere basico a causa dell'elevato contenuto in ioni bicarbonato e contiene enzimi proteolitici (come - 8 -

15 tripsina,chimotripsina, elastasi), enzimi glicolitici (amilasi), enzimi lipolitici (lipasi pancreatiche), nucleasi, ribonucleasi e desossiribonucleasi. Le cellule centro acinose, dotate di forma piramidale, sono poste appunto al centro dell acino. La loro funzione concerne la produzione di ioni bicarbonato e il trasporto dell'acqua. Possiedono un nucleo tondeggiante in cui è comune reperire due nucleoli, circondato ai lati e alla base da un reticolo endoplasmatico rugoso particolarmente sviluppato data la loro funzione secretoria, un reticolo endoplasmatico liscio discretamente sviluppato, molti mitocondri, soprattutto nella regione basale, numerosi ribosomi, piuttosto sviluppato l'apparato di Golgi, mentre nella porzione apicale della cellula si riscontrano quasi sempre grandi granuli sferici contenenti sostanze elettrondense, i granuli di zimogeno, con dimensioni alquanto variabili. Lo zimogeno in questo caso è un cocktail di numerosi proenzimi, in forma inattiva che costituiscono il succo pancreatico. Disperse tra le cellule degli acini e dotti pancreatici si riscontrano occasionalmente cellule neuroendocrine. La loro funzione, anche se non del tutto compresa sembrerebbe quella di facilitare lo svuotamento della secrezione nei dotti e sono regolate da stimolazione ormonale. L attività secretoria del pancreas è regolata da ormoni duodenali: la secretina, rilasciata nel momento in cui il chimo entra nel duodeno che stimola la secrezione di succo pancreatico (costituito da tamponi, principalmente bicarbonato di sodio, che contribuisce ad innalzare il ph del chimo); la colecistochinina che controlla la produzione e secrezione di enzimi pancreatici come l amilasi pancreatica, che scinde i carboidrati, lipasi pancreatica, che scinde i lipidi e cosi via. Tra gli enzimi proteolitici, che rappresentano il 70% della produzione totale degli enzimi pancreatici i più abbondanti sono la tripsina, chimo tripsina e carbossipeptidasi che scindono le proteine riducendole a piccoli - 9 -

16 peptidi e amminoacidi. Gli enzimi pancreatici sono piuttosto potenti e le cellule pancreatiche si difendono attraverso la secrezione di prodotti in forma inattiva, i proenzimi, attivati da altri enzimi nel tubo intestinale evitando così la digestione del pancreas. Quindi il pancreas produce più di venti enzimi di digestione diversi, che digeriscono il cibo digerendo la sua struttura esterna. La degradazione del cibo nei suoi elementi di base è necessaria perché esso possa essere assorbito dall intestino, infatti, in assenza di secrezione pancreatica le proteine, i carboidrati e lipidi non possono essere digeriti e assorbiti causando poi una serie di sintomi come gonfiore addominale, crampi ect.. Il pancreas endocrino (Figura 9) è costituito dalle isole di Langerhans, ammassi cellulari di forma tondeggiante costituiti da cordoni, distribuiti in particolare nella coda e nel corpo della ghiandola. Non possiedono vasi linfatici ma sono percorse da un fitto plesso di capillari fenestrati in cui riversano i loro ormoni e possiedono una ricca innervazione. Sono stati identificati cinque tipi cellulari all'interno di ciascuna isola di Langerhans. Le cellule α sono disposte alla periferia dell'isola, sono piuttosto numerose (15-20% del totale) e secernono glucagone, le cellule β sono le più abbondanti (65-80%), poste perlopiù centralmente nelle isole e secernono insulina, le cellule δ sono rare (3-10%), distribuite uniformemente e secernono somatostatina, le cellule F (o cellule PP) molto rare (1-2%) spesso sono quasi tutte raggruppate in una singola zona periferica dell'isola e secernono il polipeptide pancreatico (PP) ed infine le cellule ε sono rarissime (meno dell'1%) e secernono grelina. Le cellule α hanno forma romboidale, le cellule δ sono spesso tondeggianti con un unico prolungamento citoplasmatico mentre le F sono tendenzialmente piramidali. Le terminazioni nervose presenti alla base della membrana plasmatica delle cellule delle isole di Langerhans possono essere colinergiche, adrenergiche o noradrenergiche. Le

17 terminazioni adrenergiche stimolano la secrezione di glucagone ed insulina, quelle noradrenergiche inibiscono il rilascio d insulina, mentre le colinergiche possono agire coordinatamente per regolare il rilascio di somatostatina e polipeptide pancreatico. Il pancreas endocrino è perciò deputato alla regolazione del metabolismo del glucosio attraverso la secrezione di glucagone e insulina nel sangue. Il glucosio è la principale sorgente di energia per la maggior parte delle cellule corporee e in condizioni di normalità è l unica fonte di energia disponibile per i neuroni. Quando la glicemia supera i valori di normalità le cellule β rilasciano insulina, stimolando il trasporto del glucosio e il suo utilizzo da parte delle cellule bersaglio, determinando un aumento della velocità della sintesi proteica, un aumento nella sintesi e accumulo dei trigliceridi da parte delle cellule adipose e a livello epatico e muscolare scheletrico aumenta la formazione di glicogeno (che rappresenta la forma di deposito del glucosio). Quando la glicemia scende sotto i valori normali, la secrezione di insulina viene soppressa e le cellule α rilasciano glucagone e le riserve energetiche sono mobilizzate, infatti, il muscolare scheletrico e il fegato convertono il glicogeno in glucosio, il tessuto adiposo rilascia acidi grassi e le proteine vengono scisse in amminoacidi convertiti dal fegato in glucosio che può essere rilasciato in circolo e quindi la glicemia rientra nei range di normalità. L interazione insulina glucagone stabilizza la glicemia e previene la competizione tra il tessuto nervoso e gli altri tessuti per l approvvigionamento del glucosio. Quindi i livelli ematici di glucosio sono attentamente regolati ed è fondamentale mantenere questo equilibrio. Importante è ricordare che solo una piccolissima quota di glucosio una volta entrata in circolo rimane integra nell organismo e che normalmente non viene escreto con l urina. Un disordine legato al metabolismo del glucosio è il diabete mellito, caratterizzato da iperglicemia, glicosuria e poliuria

18 Distinguiamo due tipi di DM: di tipo 1 detto anche insulino dipendente e di tipo 2 detto anche insulino indipendente. Nel primo la causa primaria è un inadeguata produzione di insulina. In genere si manifesta in età adolescenziale e proprio per questo è stato definito diabete giovanile. Nel secondo caso colpisce prevalentemente gli anziani e proprio per questo è chiamato diabete senile. È caratterizzato da una resistenza all insulina, a causa in genere di una riduzione dei recettori per l insulina. Se il pancreas viene rimosso del tutto chirurgicamente sia l insulina che il glucagone non sono più prodotti e ciò va tenuto presente e corretto con la terapia medica di supporto. La produzione d insulina ed enzimi pancreatici è un processo che può avvenire separatamente e se viene danneggiato uno non è detto che risulti alterata anche la funzione dell altro. Le due componenti (esocrina ed endocrina) quindi svolgono un lavoro sinergico

19 CAPITOLO 2 PATOLOGIE DEL PANCREAS In passato i disordini del pancreas erano diagnosticati lungo il decorso della malattia e quindi non era possibile eseguire interventi significativamente positivi per la prognosi mentre oggi questo è cambiato grazie a esami più complessi e prospettive multiple integrate concentrate a identificare e seguire passo per passo i vari disordini. La corretta digestione e l'assorbimento delle sostanze nutritive sono fondamentali per la salute. Le malattie pancreatiche sono talvolta associate a malnutrizione grave, o a forme più lievi di malnutrizione. Sfortunatamente, questo non è stato ben studiato. 2.1 Patologie benigne Le principali patologie non maligne del pancreas sono rappresentate da pancreatite acuta e cronica. La pancreatite acuta si caratterizza per lesioni infiammatorie localizzate al pancreas od ai tessuti peripancreatici: edema, necrosi, necrosi emorragica, steatonecrosi. Nella maggior parte dei casi, la malattia si limita agli stadi di edema e steatonecrosi. In questa fase, le lesioni sono generalmente considerate reversibili, mentre non vi è accordo sulla reale reversibilità di necrosi estese. Più facilmente la necrosi, specie se estesa, può andare incontro a sovra infezione o essere seguita dalla formazione di raccolte liquide peripancreatiche. Queste ultime possono a loro volta risolversi spontaneamente, persistere (dando poi origine ad una pseudocisti necrotica) e/o infettarsi. Mentre vi è evidenza che una pancreatite acuta ad eziologia biliare non evolve praticamente mai verso una forma cronica, lo stesso non può dirsi per le pancreatiti acute alcoliche e solo l'osservazione

20 prolungata negli anni di questi pazienti potrà fornire le informazioni utili per un corretto inquadramento diagnostico. La pancreatite cronica è definita dalla presenza di fibrosi, distruzione del parenchima esocrino e, negli stadi avanzati, distruzione del tessuto endocrino. Essa è nelle fasi iniziali frequentemente complicata da episodi di pancreatite acuta, responsabili di crisi dolorose recidivanti. Con il passare del tempo, compare un'insufficienza esocrina (steatorrea) ed endocrina (diabete), mentre le crisi dolorose acute diminuiscono, fino a scomparire. Vengono distinte due forme di pancreatite cronica: la pancreatite cronica calcificante, in cui sembra svolgere un ruolo fondamentale nella sua patogenesi il deficit assoluto o relativo della "pancreatic stone protein" (PSP), o proteina stabilizzatrice pancreatica, che neutralizza lo ione calcio fisiologicamente presente in eccesso nel succo pancreatico; la pancreatite cronica ostruttiva è secondaria all'ostruzione del dotto di Wirsung, a tumori pancreatici o ampollari, a pseudocisti necrotiche, cicatrici dovute ad una pancreatite acuta o ad un traumatismo. I due maggiori problemi collegati alla pancreatite cronica sono: una non corretta digestione dei nutrienti dovuta alla perdita delle cellule acinose e perdita del controllo dei livelli di glicemia (causando diabete mellito) ma anche fibrosi, sclerosi e dilatazione dei dotti. Nel 1986 un patologo australiano evidenziò che nella maggior parte dei casi nessun organismo infettivo veniva ritrovato nel pancreas infiammato e che la causa maggiormente probabile di lesioni e infiammazioni era l attivazione prematura di enzimi digestivi causando un auto digestione del pancreas. Questa teoria fu notevolmente rafforzata nel 1996 quando fu evidenziato che mutazioni che colpiscono il gene tripsinogeno, che codifica per l enzima tripsina, determinano un eccessiva attivazione di questo causando una

21 pancreatite ereditaria, che si manifesta inizialmente come una pancreatite acuta, avanza fino a manifestarsi come cronica arrivando in alcuni casi a neoplasie pancreatiche. La tripsina è una delle molecole più importanti che il pancreas produce ed è fondamentale per la digestione del cibo. Normalmente il pancreas espelle tripsinogeno che arriva all intestino dove si mescola con il cibo e viene attivato in tripsina. Nel pancreas il tripsinogeno si trova in forma inattiva. Se si attiva in tripsina digerisce il pancreas stesso causando lesioni e infiammazioni. Vennero perciò identificate mutazioni significative che causano tutti i tipi di pancreatite sia acute che croniche. Alcune di queste mutazioni sono di carattere generale ma ci sono geni specifici che aumentano il rischio di pancreatiti, tra questi ricordiamo PRSS1 (tripsinogeno cationico o protease serine 1); CFTR, il gene della fibrosi cistica; SPINK1 che codifica per l inibitore della secrezione pancreatica della tripsina; CTRC chimo tripsina e CASR recettore sensibile al calcio. Questa lista è soggetta a continui studi. Importante è ricordare che la pancreatite acuta e cronica sono strettamente correlate e che questi geni lavorano per evitare che il tripsinogeno passi in forma attiva nel pancreas e evitare gravi danni nel momento dell attivazione inattivandolo rapidamente. Altre forme di patologie pancreatiche non maligne comprendono malattie genetiche, infarto per la perdita di flusso sanguigno (che si verificano durante la pancreatite acuta), la sostituzione del tessuto pancreatico con tessuto adiposo, formazione di cisti, il blocco del dotto pancreatico e l'infiammazione da condizioni autoimmuni e infezioni (da virus, batteri o parassiti). Fondamentali sono stati gli studi sulla pancreatite che hanno permesso di capire che fondamentali sono i fattori genetici, così come anche gli stili di vita ma non di meno sono i fattori ambientali, per poter determinare ad esempio un attacco

22 di pancreatite acuta alimentando speranze che i farmaci o altre strategie possano eliminare o limitare gli attacchi pancreatici. Questi studi, effettuati sull uomo hanno permesso di arrivare a delle scoperte che non si sarebbero ottenute con studi su animali di laboratorio, perciò una chiave fondamentale è rappresentata dai pazienti. 2.2 Patologie maligne: Neoplasie esocrine del Pancreas Tra le patologie maligne un posto di rilevanza aspetta al carcinoma del pancreas. La ragione per cui il carcinoma del pancreas è così letale è perché difficile da rilevare precocemente, produce velocemente metastasi, è resistente alla terapia, e provoca la morte anche con una massa tumorale relativamente piccola (il che significa che un piccolo tumore può anche essere fatale). La migliore speranza per curare il cancro del pancreas è la diagnosi precoce e l'intervento chirurgico, anche se gli specialisti sono concentrati sulla diagnosi precoce, perché scoprire il cancro al pancreas in una fase in cui la chirurgia può essere eseguita avviene solo in una minoranza dei casi. La crescita tumorale dipende da diversi fattori, quindi lo stato del sistema immunitario, l età del paziente e lo stato di salute generale hanno un ruolo fondamentale. Negli ultimi anni i ricercatori hanno evidenziato che questi tumori esprimono alcuni fattori di crescita (chiamati growth factor) come anche particolari alterazioni (mutazioni) di alcuni geni ereditari. Queste modificazioni sono probabilmente responsabili della resistenza del tumore alla chemioterapia e alla radioterapia. La ricerca in questo senso è di fondamentale importanza per poter sviluppare nuove terapie contro questo male

23 L individuazione e l utilizzazione dei fattori di rischio potrebbero permettere da un lato una prevenzione primaria della malattia, dall altro una diagnosi precoce ed un trattamento più efficace. I Fattori di rischio riconosciuti per il tumore del pancreas sono: -il fumo di sigaretta che rappresenta il carcinogeno più chiaramente implicato, cui è attribuibile il 30% circa dei casi. La somministrazione prolungata di nitroderivati presenti nel tabacco, attraverso interazioni con il DNA, può provocare alterazioni genetiche, come l attivazione dell onco-gene K-ras, con conseguente sviluppo della neoplasia. La maggior parte dei carcinogeni presenti nel fumo di sigaretta sono in primo luogo attivati da un ristretto numero di specie di citocromo P- 450, tra cui CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1 e CYP3A, e successivamente metabolizzati dalla glutatione-s-transferasi (GST). I polimorfismi del gene CYP1A1, in particolare, sono stati associati ad un aumentato rischio di tumori correlati al tabacco (polmone e vescica). In letteratura sono riportati pochi dati, al riguardo, sul carcinoma del pancreas. Ad esempio è stato riscontrato un aumentato livello di addotti aromatici nel DNA nei pazienti con il cancro pancreatico in correlazione alla mutazione omozigote MspI del CYP1A1, associata ad una aumentata attività dell'enzima e probabilmente questo gene svolge un ruolo secondario nella carcinogenesi pancreatica. Tra le particelle del fumo di sigaretta ci sono i chinoni che entrano nel ciclo redox generando specie reattive dell'ossigeno che, a loro volta, potrebbero danneggiare il DNA nucleare. Il danno ossidativo del DNA nucleare può essere riparato dall'azione di enzimi, tra i quali quelli codificati dai geni XRCC1 e XRCC3 ( X-ray repair cross complementing). Alcuni polimorfismi di questi geni sembrano correlati con una diversa attività enzimatica;

24 -Patologie regresse: uno stato infiammatorio prolungato come pancreatite ereditaria/cronica e una pregressa gastrectomia determinano una maggiore incidenza del tumore; -l'obesità e la dieta, infatti l assunzione eccessiva di grassi alimentari e di alcool e il consumo di carne sono stati correlati all insorgenza della neoplasia; di contro, è stato riscontrato un effetto protettivo di frutta, proteine vegetali e legumi. Infatti l incidenza del tumore del pancreas è anche stata correlata a diversi fattori legati alla dieta. Il cibo e la dieta hanno un ruolo importante nella prevenzione delle cause del tumore pancreatico. Recentemente, la World Cancer Research Fund and the American Institute for Cancer Research (AICR) ha pubblicato un rapporto approfondito sui dati relativi alla dieta, all attività fisica e alla prevenzione dei tumori, alla luce di una revisione sistematica di 318 pubblicazioni, che ha portato alle seguenti conclusioni:esiste una forte evidenza che il grasso corporeo, il grasso addominale e altri fattori sono probabili cause di tumore pancreatico.di conseguenza, fattori come l attività fisica e la sedentarietà, la densità energetica del cibo e delle bevande, l allattamento al seno ecc sono tutti correlati al rischio di sviluppare un tumore pancreatico. I cibi ricchi di folati hanno un ruolo protettivo e Il folato ricopre un ruolo importante nella sintesi e nella riparazione; -Il diabete di tipo 2 di lunga durata aumenta il rischio di circa il 50%. Il ruolo diretto dell insulina e lo stress ossidativo determinato dall iperglicemia, sono stati oggetto di diversi studi e i risultati ottenuti meritano ulteriori approfondimenti; -Fattori occupazionali: Le attività lavorative in miniera, nel campo della lavorazione del metallo, della gomma, nelle segherie, negli impianti chimici, di carbone e nell'industria petrolchimica sono state indicate come possibili fattori di rischio, così come l'esposizione a

25 solventi, naftilamine, benzidina e bifenile policlorinato utilizzati nei trasformatori; -Età e sesso: Il carcinoma del pancreas colpisce più o meno in egual misura maschi e femmine. Questo dato trova spiegazione nell aumento di frequenza del carcinoma del pancreas soprattutto nel sesso femminile, probabilmente collegato ad un aumento del consumo di sigarette da parte delle donne. La ratio correlata al sesso suggerisce che gli ormoni sessuali abbiano un ruolo nello sviluppo del carcinoma pancreatico; -il tipo di gruppo sanguigno A / B / AB (O è di protezione); -Fattori genetici: Più recentemente, è stato riconosciuto anche il ruolo di alcuni fattori genetici nello sviluppo del carcinoma pancreatico ed è importante anche la storia familiare. Si calcola che il 5-10% circa dei casi sia collegato a fattori genetici. Tra le condizioni strettamente correlate vi sono il carcinoma pancreatico familiare (FPC), del quale non è ancora nota la mutazione causale; la pancreatite ereditaria, nella quale il rischio aumenta di volte; la poliposi adenomatosa familiare; l atassia teleangectasia e la sindrome multipla atipica familiare del melanoma (Familial Atypical Multiple Mole-Melanoma Syndrome, FAMMM). Il riconoscimento della familiarità nel tumore del pancreas apre nuove prospettive nel campo della consulenza genetica e della diagnosi precoce. Le neoplasie pancreatiche si distinguono in base alle loro caratteristiche morfologiche, fenotipiche e molecolari. Queste proprietà riflettono la tendenza alla differenziazione nella direzione di una o più delle tre linee di differenziazione, riscontrabili nel pancreas normale: duttale, acinare ed endocrina. La differenziazione di linea è l elemento cruciale che determina sia le caratteristiche biologiche sia il comportamento clinico di una determinata neoplasia pancreatica. Tutta via c è una notevole

26 discrepanza tra la prevalenza delle diverse linee. Tale discrepanza trova oggi spiegazione con l ipotesi di una derivazione comune da cellule staminali, che si localizzerebbero nel comparto "duttale". Nella classificazione dell Organizzazione Mondiale della Sanità, le neoplasie del pancreas sono distinte in tre gruppi a comportamento biologico differente: benigno, ad incerto potenziale di malignità ed a comportamento maligno. 2.3 Neoplasie solide del Pancreas: Carcinoma Duttale Il carcinoma duttale del pancreas (Figura 10) è stato definito il "killer silenzioso" per il suo decorso silente e per il successivo comportamento esplosivo ed altamente letale. Rappresenta l 80/90% delle neoplasie pancreatiche e di queste solo il 15/20 % è suscettibile a resezione chirurgica. Importante è ricordare che il cancro del pancreas purtroppo non ha sintomi specifici che possano suggerirne la diagnosi in una fase precoce della malattia. Spesso la presenza di perdita di appetito e il dimagrimento possono essere gli unici campanelli di allarme della malattia. Il carcinoma duttale della testa pancreatica, rappresenta due terzi dei casi. Macroscopicamente, è di solito caratterizzato da una massa solida, a margini infiltrativi, di colorito biancastro e consistenza duro-lignea. Più raramente, può presentare un aspetto disomogeneo e talora "cistico" per l effetto di modificazioni regressive, di tipo necroticoemorragico. Il carcinoma della testa pancreatica si associa di solito a stenosi del coledoco terminale e del dotto di Wirsung e, nelle fasi avanzate, può estendersi alla papilla di Vater ed infiltrare il duodeno

27 Il carcinoma del corpo e della coda tende invece ad invadere il retroperitoneo, lo stomaco, il colon, l omento, la milza ed i surreni. Microscopicamente, il carcinoma del pancreas è caratterizzato dalla presenza di strutture simil-duttali disperse in una ricca matrice stromale desmoplastica. La componente ghiandolare ricalca, in misura variabile, i caratteri dell epitelio colonnare dei dotti pancreatici, ma non possiede caratteri distintivi rispetto all epitelio del sistema biliare o della papilla di Vater. Il grading della neoplasia, basato su criteri citoarchitettonici, prevede tre gradi: G1, presenza di strutture tubulari ben differenziate; G2, strutture tubulari moderatamente differenziate; G3, strutture ghiandolari scarsamente differenziate. La reazione desmoplastica conferisce alla neoplasia una consistenza lignea ed in casi particolari un aspetto definito a "cicatrice". La desmoplasia induce una considerevole riduzione del letto vascolare, che costituisce uno dei segni utili per la diagnosi differenziale radiologica tra tessuto normale e carcinoma. Tra le varianti istologiche (Sono considerate varianti istologiche quelle neoplasie che presentano una seppur minima componente di adenocarcinoma duttale classico) ricordiamo: -carcinoma mucinoso non-cistico, definito anche carcinoma colloide, a causa dell elevata componente mucinosa parzialmente circondata da cellule neoplastiche cuboidali ben differenziate; - carcinoma adenosquamoso, caratterizzato da una componente neoplastica ghiandolare e da una porzione, di almeno il 25% di carcinoma squamoso con un comportamento clinico estremamente aggressivo; - carcinoma indifferenziato, neoplasia costituita da una popolazione neoplastica che non mostra distinta differenziazione verso strutture

28 riconoscibili, con scarsa formazione vagamente pseudoghiandolare e soltanto attraverso l utilizzo della morfologia molecolare si può riconoscere l esatta natura di questa neoplasia; - carcinoma indifferenziato a cellule giganti di tipo similosteoclastico, caratterizzato dalla presenza di una componente epiteliale neoplastica costituita da elementi mononucleati e da una componente reattiva di cellule giganti simil-osteoclasti; - carcinoma a cellule chiare, composto prevalentemente da cellule pleomorfe a citoplasma chiaro ricco di glicogeno, talora associato ad una componente intraduttale; - carcinoma a cellule mucosecernenti ad anello con castone, costituito da una prevalenza di cellule mucosecernenti; la diagnosi differenziale con un carcinoma gastrico o mammario deve sempre essere considerata prima di formulare la diagnosi di primitività pancreatica; - carcinoma misto duttale-endocrino, caratterizzato dalla presenza di una componente endocrina > 30%, strettamente commista alla componente ghiandolare neoplastica. Poiché il carcinoma del pancreas indipendentemente dallo stadio di malattia in cui viene scoperto è una malattia fatale, il poterlo riconoscere nella sua fase pre-invasiva è estremamente importante ed attualmente l unico modo per poterlo curare. Si riconoscono tre distinte lesioni non-invasive: la prima rappresenta un reperto microscopico e comprende tutta una serie di modificazioni comprese nella categoria delle neoplasie pancreatiche intraepiteliali (PanIN), mentre le altre due sono lesioni macroscopicamente e radiologicamente visibili e sono rappresentate dalle neoplasie papillari mucinose intraduttali (IPMN) e dalle neoplasie cistiche mucinose (MCN). Per quanto concerne le Neoplasie pancreatiche intraepiteliali

29 (Pancreatic Intraepithelial Neoplasms, PanIN), queste sono lesioni considerati precursori del carcinoma invasivo e sono classificati in tre distinti gradi (PanIN-1A-B; PanIN-2; PanIN-3) in relazione al livello di displasia, fino a raggiungere il grado di carcinoma in situ (Figura 11). Attualmente, solo le lesioni tipo PanIN-3 devono essere riportate nel referto patologico, poiché per le lesioni PanIN-1 e PanIN-2 non ci sono prove sufficientemente consolidate per considerarle lesioni che possano comportare un rischio significativo di ulteriore progressione. Infatti, lesioni tipo PanIN-1 sono presenti nel 40% dei pancreas di pazienti non portatori di carcinoma, mentre quelle di tipo PanIN-3 sono associate alla presenza di carcinoma invasivo nel 30-50% dei casi. Si ritiene quindi che lesioni di tipo PanIN-3 abbiano una significativa importanza clinica nella progressione verso il carcinoma invasivo; resta tuttavia difficile stabilirne l esatta incidenza per l impossibilità di identificarle clinicamente. Le prove del loro significato neoplastico risiedono nel fatto che la maggior parte delle anomalie, riscontrate nel carcinoma invasivo, sono presenti in tutte le lesioni di tipo PanIN, con una frequenza che riflette i diversi gradi di atipia: mutazioni di K-ras, anomalie della telomerasi ed iperespressione di p21 e mutazioni di p53, ect Neoplasie endocrine del Pancreas La parte endocrina della ghiandola pancreatica produce ormoni. Questi vengono immessi nel circolo sanguigno regolando diversi meccanismi del nostro metabolismo. Gli ormoni sono messaggeri di importanti funzioni cellulari. Se le cellule che producono gli ormoni venissero danneggiate vi sarebbe uno squilibrio nella produzione ormonale. La produzione ormonale del pancreas dipende dalla

30 funzione di cellule speciali che possono anche essere sede di tumori con conseguente alterata produzione di ormoni. Come per ogni altra neoplasia vi sono forme benigne, borderline o maligne. Rappresentano l 1-2% dei tumori del pancreas. Sono in genere sporadici e possono insorgere anche in sindromi ereditarie come MEN1 e VHL. I tumori endocrini si dividono in due categorie: tumori funzionanti e non funzionanti. I tumori funzionanti sono neoplasie che producono correttamente l ormone che la cellula originaria è deputata a secernere e dunque si manifestano con i sintomi provocati dall abnorme produzione dell ormone in questione. I tumori non funzionanti sono tumori che originano dalle isole di Langerhans e non sono ormonosecernenti con sintomatologia aspecifica. I sintomi generali sono simili a quelli dei tumori esocrini del pancreas. Nei tumori funzionanti si associano i sintomi dell iperproduzione degli ormoni. Tra i tumori endocrini ricordiamo: insulinoma, caratterizzato da una prevalente e inappropriata secrezione di insulina; gastrinoma, tumore a prevalente secrezione di gastrina; vipoma a prevalente secrezione di VIP(vaso instestinal polipeptide); glucagoma, a prevalente secrezione di glucagone; somatostinoma, a prevalente secrezione di somatostatina

31 CAPITOLO 3 APPROCCIO DIAGNOSTICO, STADIAZIONE E ACCENNI TERAPEUTICI La diagnosi del carcinoma del pancreas è sempre difficile e spesso tardiva, specialmente nelle forme che si presentano con sintomatologia sfumata ed aspecifica. La diagnosi e la stadiazione preoperatoria procedono in modo parallelo. Sono definite linee guida essenziali per una corretta diagnosi e stadiazione e per la scelta dei provvedimenti terapeutici più efficaci per il singolo paziente. Come in altri tumori solidi si utilizza il sistema TNM 2002 che suddivide la neoplasia in tumore primitivo (T), tumore con linfonodi regionali (N) e tumore con metastasi a distanza (M) da cui consegue il raggruppamento in sette stadi: -stadio 0: carcinoma in situ: il tumore è limitato alle cellule di rivestimento del pancreas (TisN0M0); -stadio IA: il tumore è circoscritto al pancreas, ha un diametro pari o inferiore a 2 cm e non si è diffuso ad altri organi (T1N0M0); -stadio IB: il tumore è circoscritto al pancreas e ha un diametro superiore ai 2 cm (T2N0M0); stadio IIA: il tumore si è diffuso ai tessuti e agli organi adiacenti, ma non ha coinvolto l asse celiaco o l arteria mesenterica superiore, e non ha invaso i linfonodi (T3N0M0); -stadio IIB: il tumore può aver compromesso anche i tessuti e gli organi adiacenti e ha invaso i linfonodi (T1-T3N1M0); -stadio III: il tumore interessa l asse celiaco o l arteria mesenterica e i linfonodi regionali (T4 ogni NM0); -stadio IV: il tumore, indipendentemente dalle dimensioni, può aver compromesso anche organi e tessuti adiacenti al pancreas o i linfonodi e si è diffuso a distanza (ogni T ogni NM1)

32 Giacché la prognosi e la sopravvivenza sono strettamente correlate alla possibilità che la neoplasia sia radicalmente resecabile, non resecabile, o metastatica. La prognosi dei pazienti sottoposti a resezione radicale per adenocarcinoma pancreatico dipende da diversi fattori. Il fattore prognostico principale rimane l'intervento chirurgico radicale, unitamente alla presenza di margini di resezione negativa. Lo stadio patologico costituisce un altro parametro importante. Fattori prognostici meno determinanti sono le caratteristiche biologiche. Il volume ospedaliero e l'abilità del chirurgo rappresentano un aspetto difficilmente trascurabile. Il programma di follow up deve, pertanto, essere concertato con il singolo paziente. Le proposte terapeutiche si basano sul concetto che l unico atto terapeutico in grado di influenzare sensibilmente la prognosi del cancro del pancreas è la chirurgia. Purtroppo al momento della diagnosi solo nel 20 25% dei pazienti si può intervenire con l intento di ottenere un intervento radicale e questo è dovuto alla spiccata invasività locale e a distanza, infatti nella maggior parte dei casi al momento della diagnosi lo stadio della neoplasia è così avanzato che sono possibili solo provvedimenti palliativi. Nelle neoplasie localmente avanzate o metastatiche occorre procedere con l agoaspirato per via ecografia o eco endoscopica con lo scopo di ottenere una diagnosi istologica che permette di utilizzare il chemioterapico più appropriato. I tumori resecabili devono essere sottoposti ad intervento chirurgico demolitivo con l intento di asportare radicalmente la neoplasia. Di recente, in pazienti selezionati definiti Pazienti a basso rischio chirurgico con malattia avanzata, cioè pazienti, che per le condizioni generali potrebbero teoricamente giovarsi di un trattamento chirurgico radicale ma nei quali al momento della diagnosi la malattia risultava avanzata e quindi giudicati non resecabili viene proposto il

33 trattamento neoadiuvante. La terapia NEOADIUVANTE è principalmente basata sull associazione di chemioterapia + radioterapia. Attualmente questo trattamento permette di rendere operabili fino al15% dei pazienti che non potevano giovarsi della chirurgia al momento della diagnosi. I trattamenti neoadiuvanti sono oggetto dì trials clinici miranti a valutare sia la loro efficacia terapeutica in associazione alla chirurgia radicale e sia la loro efficacia nei pazienti con malattia localmente avanzata. Il gold standard del trattamento per i pazienti affetti da tumore pancreatico resecabile è ormai ben definito e si compone di chirurgia radicale seguita da chemioterapia adiuvante sistemica. 3.1 Diagnostica di laboratorio Le indagini che possono essere prescritte per diagnosticare un tumore al pancreas sono le seguenti: -esami di laboratorio, tra cui ricordiamo: -pannelli metabolici per valutare la funzionalità del pancreas. Le funzioni del pancreas sono le seguenti: produrre enzimi per la digestione, produrre bicarbonato per neutralizzare l'acido gastrico produrre insulina per segnalare cellule nel corpo di utilizzare le sostanze nutritive dal sangue in previsione di digestione e l'assorbimento del cibo. Tra i test più importanti annoveriamo il test di valutazione della Secrezione enzimatica Il metodo consiste ne misurare la secrezione pancreatica per un tempo di circa 90 minuti (a seconda del test) dopo stimolazione del pancreas con un ormone (es. CCK) o dopo un pasto. Il problema di questo test è che è difficile e costoso

34 Un altro test fondamentale è il dosaggio di elestasi fecale. Questo test misura uno degli enzimi digestivi normalmente secreto dal pancreas. Il vantaggio è che è più comodo e meno costoso, ma non è molto sensibile, e rileva solo disfunzioni pancreatiche più gravi. Un altro enzima importante da testare è l amilasi prodotto dalle cellule del pancreas per favorire la digestione degli alimenti nell organismo. Poiché non è prodotta solo dal pancreas per diagnosticare la corretta funzionalità del pancreas occorre identificare solo la parte prodotta da questo organo. Questo enzima viene eliminato molto velocemente dall organismo e quindi spesso l amilasi si presenta con valori di normalità nel sangue ma alterati nelle urine. E quindi si dosa l amilasi totale nel sangue, gli isoenzimi pancreatici, l amilasi nelle urine (amilasuria) e la lipasi. Un altro test è quello per valutare la secrezione di Bicarbonato, eseguito per diagnosticare pancreatite cronica. Viene eseguito stimolando il pancreas con secretina e il succo viene raccolto per l'analisi. La quantità di fluido che viene secreto non è importante quanto la concentrazione di bicarbonato, che deve essere> 80 meq. Infine ricordiamo il test per valutare la Secrezione insulinica poiché la secrezione di insulina dalle cellule insulari del pancreas è fondamentale per mantenere la glicemia nei range di normalità. Nella maggior parte dei casi si lavora su dieta e farmaci per mantenere la glicemia nel range di normalità; -esami di routine; -markers tumorali, dosati con metodi immunometrici sfruttando anticorpi che riconoscono in modo specifico un dato marcatore attraverso un tracciante (radioisotopo, enzimi, sostanze fluorescenti o chemioluminesctenti) che vi è legato. Tra questi ricordiamo il Ca 19-9 o GICA che rappresenta il marcatore di riferimento per il carcinoma pancreatico e risulta positivo in oltre l 80% dei casi di malattia avanzata. Il suo dosaggio è raccomandato in fase di valutazione

35 dell estensione del tumore e di monitoraggio post-operatorio. Molte cautele devono essere poste nell interpretazione dei risultati forniti dal dosaggio del Ca 19-9 a causa di frequenti riscontri di false positività, essendo numerosissime le situazioni che possono comportare un incremento (pancreatiti acute e croniche, patologie epatiche, infiammatorie del colon-retto, e dell apparato respiratorio).e importante ricordare che la valutazione del CA19.9 è spesso gravata da non uniformità metodologiche che ostacolano il confronto dei risultati ottenuti in laboratori differenti. Un altro marcatore che può essere dosato è il CA 50, che è un carboidrato strettamente correlato al Ca 19-9 con un utilità equivalente a questo. I livelli di Ca50 non sono elevati nel siero normale, ma risultano aumentati in alcuni pazienti(in meno del 12%) con una malattia epatica di natura benigna, patologia infiammatoria dell intestino e colangite sclerosante. Il suo utilizzo ha mostrato una soddisfacente sensibilità nella diagnostica delle neoplasie pancreatiche e dei carcinomi del colon, ed è risultata significativa la correlazione dei suoi livelli sierici con la stadiazione La sua attendibilità è sovrapponibile a quella del Ca 19-9 e in alcuni casi superiore a quella del CEA (antigene carcinoembrionario). Quest ultimo è un marcatore tumorale correlato al tumore pancreatico utile esclusivamente come strumento di monitoraggio della malattia; -altri metodi di biologia molecolare (Attività telomerasica; K-ras; geni soppressori p16, p53 (sono comunque tutti metodi sperimentali). 3.2 Tecniche di Imaging La diagnostica per immagini deve quindi rispondere non solo dell identificazione della lesione neoplastica, ma anche della corretta stadiazione della malattia, per ridurre le laparotomie esplorative

36 diagnostiche distinguendo i tumori resecabili, da quelli localmente avanzati e da quelli metastatici. L ecografia costituisce oggi la metodica diagnostica di primo livello per lo studio morfologico del pancreas, quale tecnica veloce, non invasiva, poco costosa, largamente disponibile e con un buon rapporto costo/beneficio. L ecografia facilita la diagnosi differenziale tra processo ostruttivo di origine tumorale o non tumorale. Si tratta di una tecnica operatore dipendente. La sensibilità dell ecografia varia tra 48% e 89%, risultando particolarmente ridotta quando la lesione presenta diametro < 2 cm ed in relazione alla sede ( testa < corpo < coda). Inoltre l ecografia è stata largamente usata negli anni precedenti per eseguire FNAB per la tipizzazione della lesione pancreatica, dimostrando una elevata sensibilità (61 94 %) con alta specificità. Pur tuttavia, le complicanze della metodica, non ultimo l elevato rischio di disseminazione delle cellule neoplastiche lungo il decorso dell ago o in cavità peritoneale, ne ha ridotto le indicazioni, con esclusione assoluta per i casi di neoplasia potenzialmente resecabile. L esame ecocolor-doppler per il coinvolgimento vascolare arterioso e venoso è essenziale per la valutazione di resecabilità chirurgica. L utilizzo di tale metodica ha dimostrato una buona sensibilità (sempre operatore dipendente) tra il 55% ed il 94%, ma anche elevata specificità (80-100%) ed accuratezza (81-95%). La TC spirale rappresenta a tutt oggi la tecnica d elezione (gold standard)per la stadiazione dell adenocarcinoma pancreatico infatti ci permette sia di stabilire le dimensioni del tumore del pancreas sia di individuare la presenza di lesioni secondarie a carico del fegato o altri organi vicini, consente di escludere la presenza di calcificazioni, contribuendo alla diagnosi differenziale con la pancreatite cronica e

37 per valutare i vasi principali adiacenti al pancreas, al fine di rilevare un'eventuale invasione. La sensibilità della TC nell identificazione dell adenocarcinoma pancreatico risulta elevata (89 97%). Con l avvento della TC Multidetettore si è ottenuto un ulteriore aumento dell accuratezza per la valutazione della resecabilità. La RM, che sfrutta campi magnetici variabili, presenta un accuratezza simile alla TC sia nella identificazione che nella stadiazione dell adenocarcinoma pancreatico. Il vantaggio della rm è quello di non esporre il paziente a radiazioni. Tuttavia, la TC rimane la tecnica più vantaggiosa in termini di costo-beneficio e in termini di tempo. L ERCP (colangiopancreatografia retrograda endoscopica) combina l uso di endoscopia e radiologia e svolge un ruolo centrale nella diagnosi e nel trattamento di molti disturbi del pancreas come pancreatite acuta e cronica, tumori benigni e maligni ect.. La sensibilità della metodica è del 95% ma il suo impiego deve essere selettivo a causa dell invasività della procedura. Quando i reperti della TAC o RNM sono dubbi, è opportuna la ERCP. Per quanto riguarda la TC-PET (tomografia ad emissione di positroni) il ruolo di questa recente tecnica è tuttora da verificare, ma le prospettive sembrano interessanti, dal momento che consente di identificare l elevata attività metabolica glucidica nel contesto di una focalità neoplastica. I primi dati con lo studio FDG PET (il fluorodesossiglucosio, un analogo del glucosio, utilizzato come tracciante nella PET)dimostrano una elevata sensibilità (98%),specificità (84%) ed accuratezza (93%), anche se questi risultati sono ancora aneddotici e peggiorano nei pazienti affetti da iperglicemie; infatti l FDG compete con il glucosio per il trasporto cellulare. Si segnalano pertanto falsi negativi per iperglicemie, oltre che falsi positivi per flogosi (pancreatite cronica)

38 Infine tutte le tecniche diagnostiche in nostro possesso non sono in grado attualmente di valutare con correttezza l estensione peritoneale della malattia; pertanto l esplorazione chirurgica o laparoscopica del peritoneo rappresenta atto fondamentale prima di ogni manovra chirurgica. Per quanto riguarda la biopsia, questa è fondamentale per la corretta diagnosi e indispensabile nella valutazione che precede il trattamento di forme non operabili chirurgicamente. Non indicata se il paziente è candidato alla stadiazione laparoscopico/loparotormica o se è resecabile a causa del rischio di disseminazione di cellule tumorali lungo il tragitto dell' ago. Per i tumori sospetti del pancreas la biopsia é obbligatoria. La biopsia può essere effettuata sotto guida ecografia o TC, utilizzando una tecnica di aspirazione con aghi di calibro La sensibilità è di circa l'80% e la specificità è quasi pari al 100%. Eventuali negativi sono principalmente imputabili ad errori nel prelievo del campione e la tecnica dipende largamente dall'abilità del radiologo e dell'anatomopatologo. Le complicanze, ancorché rare, includono la disseminazione del tumore e, pertanto, l'esame deve essere riservato ai pazienti candidati a intervento di chirurgia radicale o a terapia neoadiuvante. 3.3 Il ruolo dell EUS Nel corso degli ultimi 2 decenni, l ecografia endoscopica (EUS) si è evoluta fino a diventare uno strumento indispensabile per la valutazione delle patologie del pancreas. Sebbene la sensibilità di rilevamento del tumore è alta,è anche importante notare che ha un elevato valore predittivo negativo. Questo ha importanti implicazioni per il clinico perché significa che l EUS può attendibilmente escludere il cancro del pancreas e nella pratica clinica, il ruolo della TAC, risonanza magnetica, e EUS deve essere considerato complementare

39 L ecografia endoscopica (EUS) rappresenta la massima accuratezza circa l infiltrazione dell asse mesenterico-portale, non fornendo però informazioni sulla diffusione epatica e/o peritoneale. L EUS unisce alla potenzialità della visione endoscopica quelle dell ecografia, tramite un piccolo trasduttore di ultrasuoni montato sulla punta di un endoscopio (Figura 12) avendo quindi la possibilità di identificare lesioni anche di 2-3 mm e consentendo di rilevare con precisione alcuni parametri, considerati importanti fattori di rischio metastatico e, quindi, prognostici; in particolare ad esempio le dimensioni esatte del tumore, la profondità di invasione parietale e la presenza o meno di adenopatie secondarie loco-regionali. Sulla base di tutti questi parametri clinici, immunoistochimici e di staging loco-regionale, sarà possibile decidere il trattamento appropriato per quel paziente in termini di resezione solo endoscopica, resezione chirurgica miniinvasiva oppure resezione radicale. Inoltre, l EUS può essere usata per valutare la radicalità della resezione endoscopica e nel follow-up dei pazienti, dopo terapia resettiva. L EUS è ancora oggi la migliore metodica disponibile per l imaging del pancreas: portando il trasduttore ecografico ad alta frequenza in diretta vicinanza della ghiandola pancreatica, con le scansioni dal duodeno (testa del pancreas) o dallo stomaco (corpo-coda), è in grado di produrre immagini ad alta risoluzione del parenchima e del sistema duttale pancreatico e si possono evidenziare strutture e lesioni anche di 2-3 mm di diametro. La sensibilità è tra l 80% ed il 90% per i tumori a localizzazione pancreatica. Rappresenta una fondamentale modalità di localizzazione e di stadiazione pre-operatoria più sensibile in questo ambito clinico ed andrebbe usata in uno stadio precoce del percorso diagnostico, in quanto ha dimostrato di essere vantaggiosa anche in termini di costo-efficacia (riduzione costi, risparmio di tempo, riduzione morbilità legata a test più invasivi). L EUS presenta alcune

40 limitazioni che potrebbero essere in parte superate dalla contrastografia. Tra le limitazioni annoveriamo che l EUS è altamente operatoredipendente, che la conferma citopatologica con agoaspirazione (FNA) è solitamente richiesta per la diagnosi differenziale dei tumori e che alcune condizioni pre-esistenti (come la presenza di protesi biliari e la pancreatite cronica) possono ostacolare l individuazione di piccole lesioni tumorali. L uso di agenti di contrasto endovenosi per gli ultrasuoni (UCAs) è diventato ormai una procedura comune nell ecografia addominale per la diagnosi e il follow up delle malattie epatiche e pancreatiche. L uso degli UCAs in EUS è invece ancora limitato a piccole casistiche. Tuttavia i potenziali vantaggi dell EUS con mezzo di contrasto sono molteplici e includono: -la caratterizzazione della vascolarizzazione dei tumori pancreatici; - la diagnosi differenziale dei linfonodi; - la stadiazione dei tumori gastro-intestinali; - lo studio dell ipertensione portale. La maggior parte delle pubblicazioni disponibili in letteratura tratta dell uso degli UCAs con segnale color Doppler e power Doppler (CE EUS) e non con un armonica di contrasto dedicata (CHE EUS). In uno studio pubblicato recentemente è stato descritto che CHE EUS aumenta l accuratezza nella diagnosi dei tumori solidi del pancreas In tutti i casi è stato utilizzato il SonoVue come mezzo di contrasto (esafluoruro di zolfo). Interessante il fatto che CHE EUS ha permesso di individuare piccole lesioni tumorali in 7 pazienti che avevano un reperto dubbio con l EUS standard, a causa della presenza di protesi biliari e/o di pancreatite cronica. In questi casi è stato possibile eseguire una EUS-FNA mirata con ottima accuratezza per la

41 diagnosi di adenocarcinoma. La CHE-EUS è una tecnica di semplice esecuzione e sostanzialmente scevra da rischi per il paziente. Un altro aspetto da sottolineare nell'applicazione della tecnologia endoscopica riguarda la possibilità di combinare l EUS con l'esame citologico dell'agoaspirato. Importante è sottolineare la necessità di un integrazione costante fra diagnosi e quadro clinico, di laboratorio e di imaging. 3.4 EUS-FNA L ecografia endoscopica negli ultimi 15 anni si è arricchita della possibilità di eseguire biopsie con ago sottile (FNA, Fine Needle Aspiration) mirate, sotto guida eco endoscopica (Figura 13), anche in lesioni di pochi millimetri, situate profondamente nella parete gastroenterica od in linfonodi al di fuori di essa oltreché, ovviamente, nel pancreas. La specificità per esiti positivi del FNAC è vicina al 100% mentre il valore predittivo di esiti negativi è molto basso. La sua introduzione ha migliorato la diagnostica delle lesioni solide pancreatico-biliari, infatti è la tecnica più comune per l acquisizione di tessuto da una massa pancreatica. La citopatologia diagnostica o citodiagnostica è quella branca dell anatomia patologica che valuta, con l ausilio di tecniche diverse, le alterazioni delle cellule dei vari organi e apparati al fine di identificare l entità morbosa da cui è affetto il paziente. I suoi obiettivi sono: diagnosi di malattia; diagnosi eziologica e diagnosi patogenetica. La citologia per agoaspirazione è spesso utilizzata come procedura elettiva per una diagnostica pre-operatoria delle patologie pancreatiche formanti massa. La disponibilità di metodiche di prelievo

42 con guida eco-radiologica ed eco-endoscopica ha reso il prelievo citologico agoaspirativo a rischio controllato e dotato di un accresciuta accuratezza. L'analisi citologica del materiale aspirato citologico può facilmente distinguere tra adenocarcinoma, tumori maligni delle cellule insulari, metastasi al pancreas, e le lesioni infiammatorie. Ad esempio la citologia su strato sottile (TLC), diventata ormai di largo utilizzo nella diagnostica agoaspirativa di numerosi organi, è stata solo di recente applicata anche alla EUS. La citologia in strato sottile rappresenta una valida ed innovativa metodica perfettamente applicabile alla EUS per la diagnostica delle lesioni pancreaticobiliari. Ulteriori studi di confronto con la citologia tradizionale sono tuttavia opportuni per stabilire definitivamente l efficacia di questa metodica. Anche se l EUS è considerato superiore alla RM e TC nel rilevare masse pancreatiche,è la possibilità di individuare e inserire un ago in lesioni sospette che ha reso indispensabile l EUS nella valutazione dei pazienti con tumori solidi del pancreas. L EUS-FNA è una tecnica precisa e sicura per confermare la diagnosi di cancro pancreatico. Con l'avvento di terapie neadiuvanti per il cancro del pancreas, la maggior parte dei pazienti affetti da questa patologia richiede una diagnosi prima di iniziare il trattamento. Un vantaggio principale di EUS rispetto alla TC è la capacità di eseguire FNA al momento della verifica della lesione piuttosto che dover programmare un secondo esame e può essere eseguita utilizzando aghi sottili di diverso calibro (25, 22 o 19 gauge). Quando si sceglie il calibro dell ago bisogna tener presente diverse considerazioni e quindi utilizzare aghi che forniscano la resa ottimale delle cellule, che minimizzano la contaminazione ematica, dotati di una certa flessibilità per accedere alla lesione e che riducano al minimo le complicanze. Storicamente,

43 l'ago da 22 è stato l'ago della scelta per FNA delle lesioni del pancreas. Avere una maggiore flessibilità d'ago è particolarmente importante quando si accede a una lesione del processo uncinato o altre posizioni del duodeno. Uno studio prospettico di Sakamoto e colleagues, ha concluso che l'ago calibro 25 è stata la "scelta migliore" per la diagnosi citologica di lesioni pancreatiche solide. Ad esempio la quantità di materiale cellulare ottenuto da un ago di calibro19 è superiore rispetto ad un ago di piccolo calibro. Il problema con l'utilizzo dell ago di calibro 19 nelle lesioni della testa del pancreas è che è spesso troppo rigido per consentire un completo accesso alla massa. Proprio per questo si stanno sviluppando aghi con materiali differenti come il nitinol per avere maggiore flessibilità. Dato il tradeoff tra i diversi calibri dell ago, la scelta del medico deve essere basata su (1) la localizzazione della lesione (testa vs corpo / coda), (2) la natura della lesione (massa pancreatica vs peripancreatici nodo linfatico), e (3) se la cellularità è sufficiente. L'ago calibro 25 è l'opzione preferita per le lesioni alla testa del pancreas, in particolare per il processo uncinato. L esame intraoperatorio con FNA di una massa pancreatica viene utilizzato per determinare se una lesione è maligna e per determinare il tipo di neoplasia. Lo svantaggio di questa strategia è il tempo necessario e il prolungamento dei tempi operatori. L'uso di FNA preoperatorio evita questi problemi. E 'stato raccomandato che per ottenere risultati ottimali, una massa pancreatica dovrebbe essere campionato con 7 aspirazioni. Quasi il 25% degli obiettivi di EUS FNA nel pancreas non può essere visto con la TC e l EUS può anche identificare neoplasie a basso grado, umori neuroendocrini e lesioni metastatiche al pancreas. Questi tipi di obiettivi non erano in precedenza accessibili in caso di guida con TC

44 Fondamentale è confrontare i costi: Il punto finale è stato il costo di gestione per paziente. L EUS FNA è stata la strategia meno costosa rispetto al TC FNA. Il tasso di complicanze EUS-FNA è considerato molto basso, tra il 1-2%. Tra le complicanze di questa tecnica ricordiamo: -la coagulazione, che può portare ad artefatti come raggruppamenti di cellule. L ideale campione per Eus FNA deve produrre solo poche gocce di liquido sanguinolento, nel caso in cui sia fortemente ematico è meno probabile avere materiale diagnostico al suo interno. La Coagulazione del sangue all'interno dell'ago può essere un problema particolare con gli aghi di diametro inferiore. Ci sono 2 modi per superare questo problema. Uno è quello di microdissezzionare il coagulo e frammento di tessuto con una lama chirurgica e procedere ad un allestimento del citoincluso. Un'altra opzione è quella di utilizzare eparina nell ago e lubrificare il lume dell'ago così che il materiale non si attacchi e per impedire la coagulazione del sangue; -la pancreatite è rara e di solito mite. La Pancreatite può verificarsi più comunemente dopo FNA di una lesione cistica rispetto a FNA di una lesione solida; -Nel corso della FNA, l endoscopio può causare perforazione duodenale in pazienti con stenosi duodenale, ma anche questa è una complicazione rara; - Un'altra complicanza, seppur rara è la batteriemia. L interpretazione del FNA può essere "non diagnostico" fino al 32 % a causa di molteplici fattori, tra cui annoveriamo una cellularità scarsa e / o artefatto del vetrino. La presenza di un citopatologo durante EUS-FNA è conveniente e utile. Questo ci permette di ottenere un feed back immediato sull adeguatezza del campione, determinando la diminuzione del numero dei passaggi dell FNA, diminuzione dei tempi della procedura

45 con un corretto allestimento in loco del materiale raccolto da inviare al laboratorio di anatomia patologica raggiungendo una diminuzione dei falsi negativi, inadeguati e di conseguenza un miglioramento nella performance diagnostica. Se il citopatologo non può essere fornito, un tecnico qualificato in citopatologia dovrebbe essere presente per fornire una valutazione di "adeguatezza del campione". Per i campioni indeterminati si possono aggiungere studi di biologia molecolare per identificare ad esempio mutazioni su K-ras /P53 e quindi analisi volte a migliorare la precisione. È spesso difficile da diagnosticare il cancro del pancreas in background di pancreatite cronica e questo può essere il motivo più comune nel determinare falsi negativi in Eus- FNA. Nei pazienti che si presentano con una storia clinica e / o immagini suggestive di malignità del pancreas, ma hanno citologia negativa per EUS-FNA si può procedere con (1) l'osservazione clinica utilizzando tecniche di imaging e ripetizione dell FNA dopo un periodo di tempo tra 2 e 4 mesi (sempre stressante per il paziente e la famiglia), (2) esplorazione chirurgica, o (3) TC con biopsia guidata. Questa è meno favorevole a causa del rischio di disseminazione durante il tragitto dell ago. Ripetere l'imaging e il campionamento dei tessuti è probabilmente il miglior modo di agire. Uno dei principali vantaggi di EUS-FNA nelle lesioni pancreatiche è che può essere ridotto il rischio di contaminazione peritoneale in caso di malignità. La formazione di specialisti in EUS-FNA è una delle questioni più importanti per accrescere la disponibilità di questa tecnica presso i centri principali. Il tasso di falsi positivi dell FNA è estremamente basso, si avvicina a zero. Tuttavia, ci sono segnalazioni di interpretazioni falsamente positivi della citologia del pancreas. La superiorità della EUS per il rilevamento di patologia pancreatica viene continuamente sfidato dai progressi tecnologici in TC e RMN, come

46 per la pet (tomografia ad emissione di positroni). EUS ha inoltre il vantaggio su tutte le altre tecniche di imaging di essere in grado di campionare immediatamente eventuali lesioni sospette viste nel pancreas. Il campione viene poi depositato su un vetrino citologia per il fissaggio immediato, subendo poi colorazione ed esami citologici

47 CAPITOLO 4 LA TECNICA DEL CELL BLOCKS Quando le alterazioni a livello cellulare da soli sono sufficienti per una diagnosi, una dimensione minima del campione è accettabile. Per molte diagnosi, tuttavia, può essere necessario riconoscere le alterazioni nella struttura dei tessuti e questo è necessario anche per studiare le caratteristiche biochimiche e molecolari delle cellule. I cell blocks soddisfano questa esigenza (Figura 14). I cell blocks sono micro biopsie incorporate in paraffina. Una sezione standard istologica, presenta quattro o cinque micron di spessore, mostra l'organizzazione e la composizione cellulare di un frammento micro bioptico. Generalmente, la diagnosi può essere fatta con una maggiore fiducia quando sono presenti sia la morfologia a livello cellulare che tissutale. Una combinazione tra citologia classica e cell blocks stabilisce una sinergia che è in grado di fornire questa fiducia. La capacità di individuare le cellule tumorali nei fluidi corporei è stata realizzata nel 1882, quando la prima diagnosi di cancro è stata realizzata da un campione citologico. Il CB ha guadagnato l accettazione su larga scala come strumento diagnostico nel 1947, quando è stato utilizzato per aumentare la cellularità dei versamenti sierosi, tutta via l idea del CB è stata descritta per la prima volta nel 1896 utilizzando un inclusione del materiale in celloidina. Oggi l applicazione di questa tecnica nella diagnosi del carcinoma del pancreas ci ha permesso di eliminare quasi tutti i limiti collegati agli strisci citologici convenzionali. Nel corso degli anni una miriade di tecniche sono state messe appunto e anche se ci possono essere sottili differenze nelle fasi procedurali esiste un protocollo generale

48 4.1 Allestimento del Cell Block L allestimento del citoincluso (cell block) è una procedura che può essere eseguita contemporaneamente o in alternativa ad altre preparazioni citologiche, con l obiettivo di unire i vantaggi dei prelievi effettuati con tecnica citologica con quelli propri dell istopatologia. In altri termini, un indagine citologica viene trasformata in un esame istologico, ampliando il valore diagnostico dei campioni citologici. La tecnica prevede un primo momento di concentrazione delle cellule mediante centrifugazione cui segue l allontanamento del supernatante e la raccolta del sedimento cellulare. Questo è poi risospeso in liquido fissativo, solitamente formalina neutra tamponata al 4-5%, lasciato fissare, preferibilmente a 4-6 C per un paio d ore (si esegue questa fissazione per i campioni che arrivano freschi non fissati). Il fissativo viene aggiunto in proporzioni idonee al materiale e per un tempo sufficiente a garantire fissazione. Dopo ulteriore centrifugazione il sedimento cellulare viene disidratato con la serie degli alcoli, chiarificato con soluzioni diafanizzanti, incluso in paraffina e tagliato al microtomo, a somiglianza di quanto avviene per i campioni istologici. L allestimento in cell block del campione citologico incrementa le possibilità della diagnostica morfologica, poiché consente una migliore valutazione dei caratteri costituitivi degli aggregati, limitando la sovrapposizione cellulare e riducendo l interferenza apportata dalla presenza di emazie e dai detriti cellulari. Inoltre l inclusione in paraffina permette, da un lato la conservazione del campione e la possibilità di effettuare successive indagini immunoistochimiche con un ampio panel anticorpale. Uno svantaggio è rappresentato dai lunghi tempi di allestimento

49 Spesso è segnalata la difficoltà tecnica nella raccolta del sedimento per l esecuzione dell inclusione in occasione di campioni con scarsa cellularità. Si può ovviare a questo inconveniente colorando il sedimento con una goccia di eosina o eseguendo una pre-inclusione in agar, in celloidina o in coagulo di fibrina, formando il cosiddetto cell bag. I sistemi di pre inclusione agevolano la raccolta dell intero sedimento, impedendo la perdita delle cellule durante i passaggi successivi. La metodica che impiega l agar neutro prevede il rivestimento con questa sostanza del sedimento cellulare immediatamente dopo la fissazione, prima dei passaggi disidratanti. Il metodo con l utilizzo della celloidina prevede la preparazione di una soluzione di celloidina, che si ottiene sciogliendo 10 gr. di questa sostanza in 100 ml di una miscela composta anaparti di alcool ed etere etilico. Successivamente, si riempie la provetta con questa soluzione e quindi con cloroformio per indurire la pellicola di celloidina e prevenirne l eccessiva asciugatura. Infine, nella provetta così preparata, si versa il campione citologico sospeso nel fissativo (di solito formalina al 10%) e si centrifuga per 10 minuti a un elevato numero di giri. In seguito, si scarta il supernatante, si elimina la parte superiore della pellicola di celloidina, si recupera la porzione inferiore (sedimento), che si tratta secondo la tecnica di routine istologica. La procedura che implica la formazione del coagulo di fibrina si esegue centrifugando il campione citologico e, dopo aver eliminato il supernatante, si aggiungono alcune gocce di plasma seguite da una piccola quantità di trombina, affinché si formi un coagulo. Questo è poi fissato e processato al pari di un campione istologico. Le sezioni ottenute con la tecnica del CB offrono quindi una serie di vantaggi rispetto ai strisci citologici tradizionali:

50 - riduzione della sovrapposizione cellulare e interferenza legata alla presenza di sangue e di detriti cellulari; - conservazione dell architettura cellulare; - colorazione con ematossilina eosina comparabile con quella eseguita sui pezzi chirurgici; - conservazione nel tempo del materiale per poterne disporre anche in tempi successivi; - possibilità di eseguire ulteriori studi come IHC e biologia molecolare; - la letteratura suggerisce che le sezioni ottenute dal CB migliorano la rilevazione di cellule maligne, infatti molti studi dimostrano che il tasso di positività di un campione citologico maligno è aumentato utilizzando il CB, ottenendo così un miglioramento in termini diagnostici. 4.2 Scraping Cell Blocks Una possibile e innovativa applicazione del CB è rappresentata dalla SCRAPING CELL BLOCK (SCB). Una diagnosi inconcludente con la citologia di aspirazione con ago sottile (FNA) può essere dovuta ad una scarsa diffusione o alla presenza di frammenti di tessuto nonostante l'aspirazione di materiale adeguato. Tuttavia, a volte gli FNA non forniscono informazioni sufficienti per una diagnosi precisa con un rischio di falsi negativi dovuti materiale inadeguato, non rappresentativo, il che può essere attribuito alla variazione nella competenza del campionamento, alla natura delle lesioni, alla presenza di sangue coagulato o ad aggregati cellulari sovrapposti che possono interferire con i dati citologici e rendere difficile l'interpretazione o la classificazione impossibile. La ripetizione dell aspirazione può non essere possibile soprattutto quando si tratta

51 di organi profondi il cui raggiungimento necessita di tecniche d imaging guidate. In uno studio sono stati presi in considerazione 27 casi in cui la citologia di routine non è stata in grado di eseguire una diagnosi definitiva a causa di sovrapposizione cellulare e su questi è stata applicata la tecnica SCB. In 12 casi la diagnosi dopo SCB ha fornito maggiori informazioni, in 4 casi non ha fornito maggiori informazioni. È stata inconcludente in un caso. La diagnosi è stata confermata da SCB in 6 casi mentre in 2 casi non è riuscita ad identificare la presenza di cellule neoplastiche. Per superare questi problemi legati al materiale ottenuto con FNA, si è fatto ricorso alla tecnica SCB per fare un miglior uso del materiale disponibile. Il metodo consiste nel decolorare, raschiare ed elaborare i frammenti di tessuto presenti sul vetrino. I vetrini vengono accuratamente raschiati con l'aiuto di una lama da bisturi. Il materiale raschiato viene poi meticolosamente messo con una pinza nell agar fuso al 3% per formare un piccolo pulsante. Quando l'agar solidifica, il materiale ottenuto viene avvolto in una carta da filtro Whatman n. 1 e messo in una bio cassetta e sottoposto nuovamente a fissazione e poi processato come un istologico per allestire un blocco di paraffina. SCB è una tecnica utile per massimizzare la resa diagnostica dal materiale disponibile in tali situazioni. Un punto critico durante il protocollo è rappresentato dalla raccolta del sedimento senza perdita del materiale e proprio per sovvenire a questo si usa agar fuso che lega le cellule raschiate evitando così il rischio di perdere materiale. I due vantaggi principali sono la capacità di ottenere inclusioni in paraffina e quindi sezioni da poter utilizzare per metodiche accessorie come IHC e la concentrazione delle cellule in una zona limitata permettendo una facile osservazione microscopica. Un grave inconveniente di questo metodo è il tempo relativamente lungo (24 h) dell intero processo. Con la tecnica SCB sono state prodotte sezioni

52 istologiche di alta qualità e quindi risulta un utile complemento soprattutto quando si ha a che fare con materiale poco diffuso ma adeguato e nei casi in cui la ripetizione dell'aspirazione non è possibile. 4.3 Scraping Cell Blocks vs Conventional Cell Blocks È stato eseguito uno studio per confrontare i risultati e la conservazione della citomorfologia immunoistochimica tra Cell Blocks convenzionali (CCB) e Cytoscrape Cell Blocks (SCB). Le sezioni allestite con il CCB e quelle allestite con SCB hanno mostrato una cellularità adeguata in tutti i casi. La conservazione morfologica così come la conservazione architettonica e nucleare era adeguata nelle sezioni SCB. I dettagli citomorfologici sono altrettanto buoni in SCB e CCB. Pannelli aggiuntivi di colorazione possono essere eseguiti su SCB per una migliore diagnosi e classificazione, in particolare nei casi in cui la ripetizione con FNA non è possibile. 4.4 La tecnica del Cell Block verso i sistemi automatizzati: Cellient Automated System Cell Blocks La definizione di terapie bersaglio specifiche e personalizzate sta diventando un dovere essenziale per i patologi, con l'avvento di nuovi trattamenti di tipo molecolare. Il tessuto incluso in paraffina è emerso come la piattaforma standard per raggiungere questo obiettivo di "medicina personalizzata". I patologi per eseguire una diagnosi necessitano di poche centinaia di micron di tessuto. La ragione principale per cui le biopsie oggi giorno hanno dimensioni maggiori è perché con gli attuali metodi di lavorazione dei tessuti si perdono

53 frammenti di questo durante la lavorazione e / o i frammenti che si posizionano in piani diversi. Fisicamente trattenendo i frammenti di tessuto durante l inclusione si introduce anche il potenziale rischio di contaminazione crociata. Per frammenti di tessuto che sono troppo piccoli per essere prelevati con le pinze, è stato necessario sviluppare una tecnica che ci permettesse di concentrarli in una zona limitata e includerli in paraffina ed il Cell Block appunto è la tecnica utilizzata. Tra i metodi di raccolta dei frammenti per il CB possiamo ricordare l utilizzo di fibrina o agar. Il limite di questa tecnica è che i frammenti di tessuto sono dispersi in uno spazio dimensionale che è più ampio dei frammenti reali. Inoltre il plasma è comunemente combinato con la trombina per formare un coagulo di fibrina che funge da sostanza veicolo. Oltre alla contaminazione crociata cellulare e molecolare che potrebbe derivare dalla introduzione di materiale biologico di un paziente diverso in un campione di diagnostica, un altro problema che si presenta utilizzando il sistema plasma-trombina è il frequente verificarsi di contaminazione batterica o fungina del plasma. Il secondo metodo di raggruppamento di micro particelle è l utilizzo di un adesivo per trattenere le particelle. Il limite di questa tecnica è che le cellule sono concentrate in un pulsante tridimensionale. Il Cellient Automated System Cell Block è stato sviluppato per rispondere alle limitazioni dell allestimento tradizionale del CB. Questo sistema automatizzato offre notevoli vantaggi rispetto agli attuali metodi manuali per la preparazione di CB

54 4.5 Principi di funzionamento di Cellient Automated System Cell Blocks Il campione, tre puntali per pipette e la biocassetta monouso vengono caricati nello strumento (Figura 15,16 e 17). Una bio cassetta e un filtro sono stati progettati per catturare cellule o frammenti di tessuto da residui di campioni, o sospensioni cellulari. Le cassette e il filtro monouso permettono alle cellule catturate o frammenti di tessuto di essere correttamente posizionati in piano per il successivo taglio con un microtomo. Cellule e frammenti micro bioptici sono depositati in uno strato uniforme finché il filtro è saturo. A questo punto può essere aggiunta eosina per migliorare la visualizzazione delle cellule per il successivo taglio e per una migliore diagnosi (l aggiunta di eosina è opzionale). Nelle fasi successive, piccole quantità di alcol, xilene e paraffina vengono rapidamente addizionati al campione (si esegue la classica processazione). La regione filtro viene poi raffreddata. Tutti questi passi sono completamente automatizzati, eliminando la variabilità dell operatore. Una volta che la paraffina indurisce, il filtro aspira lasciando le cellule incorporate in un piano nella pararffina. La cassetta viene rimossa manualmente e posta in una base di rimodellamento monouso nella stazione automatizzata di inclusione dove viene aggiunto un ulteriore strato di paraffina attorno al disco di tessuto incluso (Figura 15 e 18). Una volta completato questo passaggio, il blocco è pronto per il sezionamento istologico (Figura 19). Lo strato di paraffina intorno al blocco rende possibile identificare con precisione il piano in cui si trovano le cellule, riducendo al minimo la perdita di materiale durante il sezionamento

55 4.6 Cellient Automated System Cell Blocks: Vantaggi e limiti Ci sono una serie di vantaggi del processo Cellient rispetto ad altre tecniche di allestimento del CB: - migliora la raccolta con una perdita di materiale durante la centrifugazione e decantazione ridotta al minimo, grazie anche alla filtrazione sottovuoto. Non vi è alcuna ulteriore perdita di materiale per trasferimento incompleto dalla cassetta al modello in cera; - Grazie all'efficienza del flusso continuo, l estrazione e l'eliminazione delle sostanze di trasporto, per la trasformazione completa si utilizza un minor volume di reagenti rispetto ai processatori utilizzati di routine; -il tempo di elaborazione è considerevolmente inferiore rispetto ad un processatore standard con un tempo di elaborazione costantemente rapido (45 minuti o meno); -massimizza la cellularità da campioni in cui questa è esigua; -maggiore ripetibilità, chiarezza e cellularità da ogni blocco con una rappresentazione migliore, poiché aiuta a mantenere nitide e chiare le cellule, crea una concentrazione di cellule nel blocco, permette di eseguire valutazioni contemporanee sia sulla citologia classica che su CB e rappresenta un sostegno con una maggiore produttività anche per le valutazioni da parte dei patologi, una maggiore ripetibilità data da un alta qualità dei blocchi; -è un procedimento standardizzato, infatti per raggiungere l'obiettivo della medicina personalizzata, l inclusione in paraffina e le condizioni di trasformazione del tessuto devono essere standardizzate. Uno degli attributi chiave del processo Cellient è la possibilità per l'utente di standardizzare le condizioni di lavorazione, utilizzando identici reagenti freschi per ogni blocco. Anche la fissazione in formalina può essere standardizzata, se desiderato. Standardizzando le condizioni

56 lavorative, si riduce al minimo l errore da parte del personale tecnico, grazie all aumento dell automazione; -Riduce al minimo il rischio di contaminazione crociata, infatti diversamente dagli altri processatori non vi è alcuna possibilità per le micro particelle sospese di contaminare un campione. Inoltre non vi è alcuna necessità di maneggiare il campione da tecnici eliminando la possibilità di corpi mobili da introdurre con una pinza; -assistenza del personale tecnico è minima. Tra i limiti annoveriamo ad esempio il tempo di elaborazione rapido del sistema Cellient, che risulta ancora essere correlato al personale tecnico, che procede una volta allestito il blocchetto, al taglio e alla creazione del prodotto finito. Un altro limite importante è rappresentato dal costo necessario per l allestimento di ogni citoincluso con il sistema Cellient, stimato all incirca intorno ai 20 euro per citoincluso. Il rapporto del costo con la procedura manuale è intorno all 1:10. In relazione a questo lato critico, questo strumento nei laboratori Italiani non è stato introdotto nella routine laboratoristica, proprio a causa del costo eccessivo non sostenibile dal mercato Italiano. Negli Stati Uniti invece, è ampliamente utilizzato nella routine laboratoristica. La speranza è che a lungo termine attraverso la standardizzazione delle condizioni di trasformazione e la riduzione al minimo delle dimensioni delle biopsie rendendole comunque diagnostiche, Cellient contribuirà allo sviluppo di nuovi test di screening per la diagnosi del cancro, consentendo terapie personalizzate ottimali per le malattie fornendo una piattaforma attraverso la quale i ricercatori e citologi possono condividere un terreno comune per combattere e aiutare a trovare una cura per il cancro

57 4.7 Blocchi tradizionali vs blocchi Cellient Qualità Sub-ottimale /Il sistema Cellient migliora l architettura cellulare; Risultati contraddittori/ Il sistema Cellient minimizza gli errori dell'operatore correlati a incoerenze; Cellularità insufficiente/il sistema Cellient cattura le cellule; disponibili, massimizzando la cellularità anche da campioni piccoli/scarsi; Tempi di lavorazione lunghi/il sistema Cellient è standardizzato, con un tempo di elaborazione rapido, all incirca un ora; Rischio di contaminazione crociata/il sistema Cellient riduce il rischio di contaminazione crociata. (Figura 20) 4.8 Indagini immunoistochimiche applicate alla tecnica del Cell Blocks Negli ultimi due decenni, le tecniche accessorie sono state sviluppate per fornire informazioni diagnostiche ottenute esclusivamente dalla morfologia di cellule e tessuti. L immunoistochimica (IHC) consente l identificazione di antigeni malattia-specifici, o combinazioni di antigeni. L IHC applicata alla citologia tradizionale è correlata a problematiche come la cattura di anticorpi o reagenti nei frammenti di tessuto di grandi dimensioni, dando l'impressione di una reazione positiva. Le sezioni in paraffina ottenute con il CB consentono all intera microbiopsia di avere parità di accesso ai reagenti IHC. Un altro vantaggio dell'utilizzo di CB per IHC è la relativa facilità di fornire un risultato o quantificare la positività sulla base di una cellula

58 I CB sono la piattaforma ideale per studi diagnostici ausiliari come IHC e per la biologia molecolare. Inoltre l IHC su CB consente una correlazione in larga scala tra reazione di colorazione e architettura tissutale. I CB sono anche un mezzo comodo e stabile per l'archiviazione di biopsie a temperatura ambiente, con molti vantaggi rispetto congelamento o conservazione in liquidi fissativi. La maggiore disponibilità di indagini immunoistochimiche negli ultimi anni ha aumentato l esigenza di procedere ad allestimenti di CB nei laboratori perché molte diagnosi di oggi sono valutate utilizzando tecniche l aspirazione con ago sottile (FNA) mentre nel passato erano a disposizione per la diagnosi solo biopsie o resezioni. Nei cell-blocks la concentrazione delle cellule sul vetrino, l architettura degli aggregati cellulari, così come i dettagli nucleari e citoplasmatici sono risultati maggiormente evidenziabili rispetto ai preparati citologici normali, perciò tale tecnica è di rilevante ausilio diagnostico, poichè risulta utile per l applicazione dell immunoistochimica alla diagnostica citologica dei tumori. L applicazione di tale metodica è, tuttavia, molto limitata nella diagnostica citologica. Questa limitata utilizzazione è dovuta principalmente al fatto che : Il materiale citologico utilizzabile per le indagini immunocitochimiche è il più delle volte scarso e notevolmente disperso sul vetrino; Nonostante gli sforzi effettuati, non si è riusciti a standardizzare tale metodica per la citologia, cosi come è stato fatto per l istologia. Oggi, la tecnica del cell-block, associata ad indagini immunoistochimiche, può essere considerata un valido strumento diagnostico nella citologica oncologica di routine

59 4.9 Cellient Tm Cell Blocks Automatizzato vs Cell Blocks Tradizionale: un confronto delle caratteristiche morfologiche nelle colorazioni IHC Il Cell Block Tradizionale (TCB) (Figura 21) fornisce sezioni che sono un importante elemento diagnostico aggiuntivo per gli strisci citologici, ma oggi sono utilizzati anche come preparazione affidabile per effettuare studi di immunoistochimica (IHC). In uno studio, sono state valutate le prestazioni del TCB confrontandole con quelle CellientTM Cell Block automatizzato. In questo studio, 35 CB sono stati ottenuti da 16 campioni citologici benigni e da 19 campioni citologici maligni (campioni non ginecologici) in un grande ospedale ad insegnamento universitario e allestiti secondo i protocolli del CB tradizionale e con il sistema Cellient. Una volta inclusi in paraffina sono stati tagliati a 5 µm e colorati con ematossilina/eosina. Le sezioni ottenute da ciascun metodo sono state confrontate secondo diversi criteri: - cellularità (classificati da zero a tre sulla base del numero di cellule per campo a bassa potenza); -Architettura; -Distribuzione della cromatina nucleare; - irregolarità della membrana nucleare; - presenza di nucleoli. Ulteriori indagini IHC sono state condotte in 17 casi maligni per un ulteriore identificazione della neoplasia. Sono stati introdotti controlli di Adeguato, positivo e negativo per garantire la corretta interpretazione dei risultati. L intensità della colorazione è stata classificata da zero (nessuna colorazione) a tre (colorazione diffusa) per entrambi i CB. Non sono state riscontrate differenze morfologiche significative tra TBC e Cellient CB nei 16 casi benigni. Le sezioni

60 ottenute da Cellient CB presentavano una cellularità leggermente inferiore rispetto al TCB ma la differenza non ha raggiunto la significatività statistica. C'erano anche alcune differenze notevoli nella cromatina nucleare, infatti le sezioni di TCB tendevano a mostrare nuclei ipercromici (n = 7 pazienti), mentre quelle ottenute da Cellient CB mostravano maggiormente un nucleo vescicolare (n = 5 pazienti), tuttavia, la significatività statistica anche qui non è stato raggiunta. Una cellularità insufficiente ha pregiudicato una valutazione completa nel 23% (4/17 pazienti) dei preparati Cellient Cell Block nell IHC mentre la cellularità non rappresenta un problema con il TCB. Di conseguenza in questo studio non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra TCB e il sistema automatizzato Cellient CB in qualsiasi dei parametri morfologici valutati, anche se è stata notata una cellularità leggermente inferiore nelle sezioni ottenute da Cellient CB. Il dato significativo è stato la cellularità insufficiente del sistema automatizzato Cellient CB quando si cerca di eseguire studi di immunoistochimica. Inoltre, in questo studio, non è stato riscontrato un aumento significativo della cellularità del sistema Cellient rispetto al TCB. L'unica differenza significativa tra i due metodi in questione riguarda appunto la cellularità dei CB evidenziata durante colorazione IHC del sistema Cellient. Questa situazione può determinare una non adeguata valutazione delle colorazioni IHC soprattutto in campioni con scarsa cellularità

61 CAPITOLO 5 METODICHE ACCESSORIE: ISTOCHIMICA Scopo dell istochimica è stabilire la costituzione chimica di strutture istologiche o mettere in evidenza, con coloranti specifici, determinate sostanze normali o patologiche presenti nelle cellule e nei tessuti, individuandone eventualmente le zone. L applicazione dei metodi istochimici in campo istopatologico è di fondamentale importanza per la diagnosi di numerose condizioni patologiche. Le reazioni istochimiche devono essere specifiche, sensibili, sicure, effettuabili e non dannose per i tessuti. Va premesso che le metodiche istochimiche non sono in grado di evidenziare piccole molecole facilmente mobilizzabili bensì sostanze ad alto peso molecolare proprie dei componenti strutturali del tessuto (proteine, acidi nucleici, lipidi ecc..) Tuttavia oggi questa metodica è poco utilizzata nella diagnostica del pancreas, con applicazione soprattutto nelle patologie metaboliche come pancreatiti che determinano alterazioni a carico di proteine, lipidi ecc.. e superata da metodiche accessorie come l IHC e gli studi di biologia molecolare soprattutto per la diagnosi del carcinoma pancreatico

62 CAPITOLO 6 METODICHE ACCESSORIE: IMMUNOISTOCHIMICA L immunoistochimica è una tecnica ampiamente utilizzata per l identificazione e la localizzazione istologica di antigeni e di costituenti cellulari e tissutali in situ. Essa ha rappresentato, negli ultimi anni, uno strumento fondamentale per la diagnosi di molte malattie ed ha avuto, con l'abbinamento alle tecniche di biologia molecolare, un grande impulso ed un notevole sviluppo metodologico. Inoltre, questa tecnica ha permesso l'individuazione di nuovi antigeni tumorali, proteine oncofetali, di proteine codificate da oncogeni, la tipizzazione di neoplasie, la loro valutazione prognostica ecc.. E' chiaro quindi il ruolo fondamentale che questa tecnica ricopre oggi nella diagnostica. Le procedure di immunoistochimica permettono la visualizzazione di componenti cellulari in una varietà di campioni biologici comprendenti sezioni di tessuto, strisci e citocentrifugati. I risultati della colorazione dipendono in gran parte dalla qualità del preparato. 6.1 Preparazione dei campioni Lo scopo principale della fissazione è quello di preservare la morfologia delle cellule e dei tessuti evitando la distruzione dei determinanti antigenici, mantenere le molecole antigeniche che devono essere individuate nella loro posizione originale e renderle disponibili, ovvero accessibili, all anticorpo primario. Dunque un appropriata fissazione dell antigene è uno degli aspetti più critici delle tecniche di immunoistochimica, le quali possono localizzare soltanto quegli antigeni che restano riconoscibili per l anticorpo. L ipofissazione può conservare l antigene ma può danneggiare la

63 morfologia tissutale con conseguente difficoltà di interpretazione. Al contrario, con tempi di fissazione più lunghi la qualità della morfologia potrà migliorare ma una maggiore quantità di determinanti antigenici potrà risultare mascherata, denaturata o distrutta. Una fissazione ottimale sarà quella che produce la migliore morfologia con il tempo minimo richiesto per conservare l antigene. Tra i fissativi più adatti per l IHC ricordiamo: formalina, il liquido di Zenker, l acido picrico, il liquido di Bouin, l etanolo ecc.. Dopo la fissazione si procede con il tipico iter continuando quindi con disidratazione, chiarificazione, infiltrazione, inclusione (Per consentire una conservazione ottimale del tessuto e dell Ag, i bagni di paraffina dovrebbero essere mantenuti a temperature non superiori ai 57 C e l inclusione in resina consente il taglio di sezioni più sottili di quanto non sia possibile con l inclusione in paraffina, (fino a 0,2-2 m), le quali hanno il vantaggio di presentare migliori dettagli morfologici e consentire la localizzazione degli antigeni sia a livello di microscopia ottica che elettronica. ), taglio al microtomo, raccolta delle sezioni e reidratazione dei preparati prima della colorazione. L allestimento dei vetrini per l esame di campioni citologici provenienti da diversi organi può essere effettuato secondo varie modalità: -da preparati ottenuti per striscio, in cui il materiale viene deposto su un vetrino e strisciato con cura per non danneggiare le cellule. Per ottenere preparati citologici qualitativamente e quantitativamente soddisfacenti, gli strisci dovrebbero essere costituiti da un solo strato cellulare; in preparazioni più spesse, infatti, i reagenti possono venire intrappolati tra gli strati e conferire al preparato una colorazione di fondo che può rendere difficile l'interpretazione dei risultati. Per assicurare la conservazione dell'antigene gli strisci dovrebbero essere fissati il più rapidamente possibile, o comunque entro le 24 ore dal

64 prelievo. La conservazione dello striscio dipende dalla stabilità dell'antigene che deve essere localizzato; -da preparati ottenuti per citocentrifugazione; -da cell blocks; -su preparati colorati, Questo tipo di indagine permette di utilizzare lo stesso materiale già colorato con il metodo di Papanicolaou o di May Grunwald Giemsa e sul quale pertanto è stata già formulata una diagnosi sulla base dell'esame morfologico. Tuttavia spesso richiede l'uso di concentrazioni più alte di anticorpo primario; inoltre, trattandosi di materiale già ampiamente processato, è possibile riscontrare una parziale perdita o denaturazione degli antigeni con conseguente riduzione dell'intensità di colorazione; -ecc.. Il principio su cui si basano le tecniche di IHC è la reazione antigene anticorpo; tale reazione si basa sul riconoscimento da parte dell anticorpo del determinante antigenico contro il quale è stato prodotto. Il legame tra antigene e anticorpo si instaura tra i frammenti Fab dell anticorpo e i determinanti antigenici. Gi anticorpi impiegati nelle indagini IHC devono avere caratteristiche di elevata specificità nei confronti dell antigene. Innanzi tutto bisogna disporre di un antigene il più possibile puro; questo viene iniettato in dosi adeguate nell animale da esperimento che, così sensibilizzato produce, notevoli quantità di anticorpi circolanti diretti selettivamente contro l antigene impiegato. Questi anticorpi, appartenenti alla classe delle IgG sono detti policlonali in quanto sintetizzati da cloni diversi di B linfociti dell animale; le loro catene leggere infatti dimostrano differenti gradi di specificità ed eterogeneità. Questi anticorpi, così prodotti, vengono purificati ed infine utilizzati nelle indagini IHC. La tecnica della fusione invece si basa sul fatto che le cellule mieloma tose di pazienti con mieloma multiplo, derivano tutte da uno stesso

65 clone cellulare e per questo motivo sintetizzano Ig provviste di un solo tipo di catena leggera della stessa regione variabile (anticorpi monoclonali). Utilizzando tecniche di coltura in vitro, questi elementi mieloma tosi vengono ibridizzati con plasmacellule di animali sensibilizzati contro un particolare antigene altamente purificato. È così possibile creare un nuovo clone cellulare che si automantiene e sintetizza anticorpi estremamente specifici. La concentrazione dell'ab primario dipende dalla quantità dell'antigene presente nel campione da testare (dopo una possibile perdita dovuta a lavaggi, diffusione o denaturazione) e dalla sensibilità del sistema di rivelazione. Il legame dell'anticorpo primario con l'antigene può essere rivelato da fluorocromi o da enzimi coniugati. Se l'anticorpo diretto contro l'antigene da cercare è marcato con un fluorocromo, il sito di reazione si rende evidente per la fluorescenza legata all'anticorpo che ha reagito con l'antigene. Se il marcatore è costituito da un enzima, esso, in presenza di un opportuno substrato, produrrà un precipitato colorato nel sito di reazione. Lo svantaggio della immunofluorescenza è rappresentato dalla ridotta sensibilità e dalla facile estinzione della fluorescenza. I fluorocromi più usati sono la fluoresceina, la rodamina, la resorufina e la ficoeritrina. Inoltre il risultato non è stabile nel tempo e tende a decadere per effetto della luce. Le reazioni enzimatiche possono essere analizzate con un microscopio convenzionale a luce diretta; possiedono una colorazione permanente che permette la documentazione fotografica anche a distanza di tempo e possono essere combinate con le contro colorazioni. Gli enzimi comunemente usati in immunoistochimica sono la fosfatasi alcalina da mucosa di vitello, la b galattosidasi e la perossidasi di rafano. I metodi di immunoistochimica utilizzati per localizzare l'antigene possono essere

66 diretti, fare uso di coniugati (indiretti), utilizzare immunocomplessi o sfruttare l'affinità tra avidina e biotina. Il modo più semplice per localizzare un antigene è quello di utilizzare un anticorpo diretto specificamente contro di esso. Nel metodo diretto l'anticorpo specifico è legato chimicamente al fluorocromo o all'enzima. Il reagente coniugato viene applicato al campione e raggiungerà l'antigene. Viene poi applicato un substrato che produrrà un prodotto terminale colorato che precipita nel sito e renderà visibile l'antigene localizzato. Nel metodo indiretto l'antigene da ricercare viene fatto reagire con un anticorpo non coniugato. Successivamente il complesso antigeneanticorpo che si è formato verrà fatto reagire con immunoglobuline di una specie animale diversa da quella da cui è stato prodotto l'anticorpo primario e coniugato con una molecola di marcatore. La reazione finale risulterà più intensa perché l'antigene tissutale si combina con le molecole di anticorpo, ognuna delle quali si legherà (fungendo a sua volta da antigene), con molecole di anticorpo coniugato. I tempi richiesti sono doppi rispetto al metodo diretto e i rischi che si verifichino reazioni non specifiche sono più elevati. Gli immunocomplessi sfruttano la naturale affinità tra antigene e anticorpo e sono costituiti da un complesso formato artificialmente dall'enzima che catalizza la reazione con il cromogeno e da un anticorpo specifico per questo enzima. L'uso di immunocomplessi anziché di coniugati rende questa procedura fino a 1000 volte più sensibile rispetto alla immunofluorescenza. Questo metodo utilizza tre reagenti: l'anticorpo primario, che è specifico per l'antigene; l'anticorpo secondario o "ponte" e il complesso costituito da un enzima legato per via immune ad un anticorpo diretto contro l'enzima stesso. L'anticorpo ponte è capace di legarsi sia all'anticorpo primario che al complesso coniugato, perché entrambi sono prodotti nella stessa

67 specie animale, e viene aggiunto in eccesso in modo che soltanto uno dei suoi siti Fab si leghi all'anticorpo primario, lasciando l'altro sito Fab libero di legarsi all'anticorpo nell'immunocomplesso. L'enzima viene visualizzato attraverso una reazione substrato-cromogeno. L'assenza di anticorpi coniugati conferisce a questo metodo una sensibilità superiore a quella attribuita alle tecniche dirette e indirette. Il vantaggio risulta evidente specialmente nei tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. La tecnica avidina biotina rappresenta uno dei più recenti sviluppi nella colorazione in immunoistochimica. Questo metodo è basato sulla capacità dell'avidina, di legare in maniera non immunologica quattro molecole della vitamina biotina. Vengono utilizzati tre reagenti: Il primo è l'anticorpo primario specifico per l'antigene che deve essere localizzato. L'anticorpo secondario, capace di legarsi al primario è coniugato con biotina. Il terzo elemento è un complesso di biotina coniugata con perossidasi o fosfatasi alcalina e avidina. I siti liberi della molecola di avidina consentono il legame alla biotina sull'anticorpo secondario. L'enzima, e quindi l'antigene originale, vengono visualizzati con il cromogeno appropriato. La forte affinità dell'avidina per la biotina conferisce a questo metodo una sensibilità maggiore rispetto a quella di altre tecniche con anticorpi coniugati. Una molecola di enzima può dunque trasformare più molecole di substrato in prodotto. L'aumentata sensibilità delle tecniche immunoenzimatiche rispetto alla immunofluorescenza è dovuta proprio a questa possibilità di amplificazione progressiva. Una molecola fluorescente può cedere soltanto una piccola quantità di luce visibile, mentre un enzima può produrre molte molecole colorate. Un'ampia varietà di cromogeni può essere utilizzata come substrato della perossidasi (POD). Essa catalizza la reazione:

68 POD+H2O2+cromogeno > reazione enzimatica > molecola colorata +POD+H2O. Tra i piu importanti ricordiamo: -Il DAB (3,3-diaminobenzidina) è il substrato di scelta per la immunoperossidasi. Produce una intensa colorazione marrone resistente all'alcol. I vetrini colorati con DAB possono essere conservati a lungo. Il principale svantaggio della DAB (un derivato della benzidina) è che essa è irritante ed è considerata un sospetto carcinogeno; -l AEC (3-amino-9-etilcarbazolo) produce un prodotto terminale marrone-rosso che è insolubile in acqua e solubile in alcol. Quindi i campioni non devono essere disidratati, ma montati con un medium a base acquosa; -4-cloro-1-naftolo; -ecc.. Tra i cromogeni per la fosfatasi alcalina annoveriamo: -BCIP/NBt, fast red, fast blu, new fucsin. Tra i cromogeni per la β galattosidasi: -Xgal, Il 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactopiranoside. L'aderenza delle sezioni sul vetrino risulta essere molto importante soprattutto se la rivelazione prevede numerose incubazioni e relativi lavaggi. Sono presenti numerose soluzioni di adesivi per vetrini in commercio. Uno dei metodi migliori e più semplici per far aderire le sezioni al vetrino è una accurata essiccazione. Ponendo i vetrini in una stufa a 60 C per 30 minuti la paraffina si scioglierà e permetterà uno stretto contatto tra il tessuto e il vetrino. Per rimuovere l anticorpo che non ha reagito, i vetrini dovrebbero essere sciacquati accuratamente dopo incubazione

69 Numerosi tamponi possono essere usati come diluenti, tamponi di lavaggio e di risciacquo. I più comuni sono il Tris, il PBS e la soluzione fisiologica. Per quanto riguarda il blocco delle reazioni aspecifiche una colorazione positiva del campione che non deriva dal legame antigene- anticorpo è denominata colorazione di fondo non specifica. Il metodo più efficace risulta quello di esporre il campione ad una soluzione proteica inerte prima di applicare l anticorpo primario. Gli enzimi endogeni presenti nel tessuto danno luogo ad una colorazione non specifica. Per quanto riguarda il blocco della perossidasi endogena nelle sezioni di tessuto l'inibizione è possibile mediante la pre-incubazione delle sezioni prima della aggiunta dell'ab primario con perossido di idrogeno (H2O2) 0,03-0,3% in PBS o in acqua o ancora in metanolo. Per quanto riguarda il blocco della fosfatasi alcalina endogena il blocco è possibile mediante l'aggiunta di levamisole 1 mm al substrato. Per quanto riguarda la riesposizione degli antigeni celati, un mezzo per superare queste limitazioni e smascherare i siti antigenici celati è stato l'impiego di enzimi proteolitici volti a digerire i legami aldeidici istituiti nel corso dei processi di fissazione. L'enzima più comunemente usato è la tripsina. Una digestione eccessiva può danneggiare il tessuto, perciò i tempi di incubazione dovrebbero essere più brevi possibile. A partire dall'inizio degli anni 90 sono stati descritti numerosi approcci, tutti estremamente efficaci, per la riesposizione di antigeni mascherati dalla fissazione e basati sulla esposizione delle sezioni ad alte temperature per tempi limitati. Le fonti di calore proposte sono state: il becco bunsen, il forno a microonde, la pentola a pressione e l'autoclave. I mezzi nei quali effettuare in trattamento sono soluzioni di vario tipo come il tampone citrato, il tris Hcl e l EDTA. A tutt'oggi non è del tutto

70 chiarito come la combinazione calore-soluzione tampone renda accessibili quei siti antigenici un tempo identificabili soltanto su materiale criopreservato. Per quanto concerne la valutazione dei risultati numerosi sono i quadri di positività specifica che si possono osservare in un campione processato per l'immunoistochimica. Il cromogeno precipitato indica la presenza dell'antigene, e l'intensità della reazione è proporzionale alla quantità di antigene presente. Numerose metodiche enzimatiche sono state messe a punto per poter localizzare due antigeni nella stessa sezione di tessuto. Alcuni metodi utilizzano lo stesso enzima con differenti substrati, per la rivelazione di diversi antigeni, mentre altri metodi usano differenti enzimi per marcare ciascun antigene. Fondamentali sono anche i metodi di studio della proliferazione cellulare, infatti le cellule in divisione possono essere identificate da anticorpi diretti contro proteine che si esprimono durante il ciclo cellulare e che in alcuni casi possono distinguere anche le fasi specifiche del ciclo cellulare. Oltre alla possibilità di testare l'espressione di proteine specifiche del ciclo cellulare in campioni di tessuto, esiste quella di utilizzare alcune tecniche immunoistochimiche basate sulla stretta associazione tra sintesi del DNA e duplicazione cellulare. 6.2 Indagini Immunoistochimiche nelle neoplasie del Pancreas La messa a punto di metodi che possano aumentare l accuratezza diagnostica e ridurre il numero delle diagnosi incerte è di grande utilità nella pratica clinica. A questo scopo sono solitamente utilizzate tecniche immunoistochimiche con pannelli anticorpali

71 opportunamente stabiliti per tipizzare le cellule maligne, ma che non sono sempre dirimenti per la diagnosi. Nelle neoplasie pancreatiche intraepiteliali (PanIN) le indagini IHC rilevano un profilo immunofenotipico simile a quello del carcinoma duttale, con una crescente espressione di Ki67 direttamente correlata con l incremento del grado di displasia. Per quanto riguarda il carcinoma duttale la neoplasia esprime CK7, CK8, CK18, CK19, EMA, DUPAN-2, CEA, CEACAM-1, CD44v6, caderina E, claudin 18 e annexin A8. Focalmente si possono osservare anche immunocolorazioni per CK 17 e CK20. Nelle cellule neoplastiche è anche individuabile la sovra-espressione di EGFR, HER-2 e TGF-α. Le aree di possibile metaplasia squamosa si possono identificare con l uso di CK4, CK5, CK13 e p63. Variabili quantità di cellule neoplastiche hanno anche espressione di molecole di mucina (MUC1, MUC3, MUC4, MUC5AC e, talvolta, MUC6) e di antigeni carboidratici (CA19.9, CA 125 e TAG B72.3). Lo stroma, costituito principalmente da elementi fusati, mostra positività per vimentina, α- SMA, miosina del muscolo liscio, collagene IV, fibronectina e metallo proteinasi. Importante per la diagnostica di carcinoma è l immunocolorazione negatia per il prodotto di SMAD4 (o DPCA4), che riflette l inattivazione del gene corrispondente, che non si verifica praticamente mai nelle lesione benigne (Figura 22)

72 CAPITOLO 7 METODICHE ACCESSORIE: BIOLOGIA MOLECOLARE 7.1 La Medicina di Laboratorio partner indispensabile nella gestione del paziente Oncologico La Medicina di Laboratorio gioca un ruolo sempre maggiore e sempre più impegnativo nella gestione del paziente oncologico, ruolo che si estrinseca in modo paradigmatico negli ambiti della prevenzione, diagnosi precoce, monitoraggio della terapia ed infine nel follow-up a lungo termine. Tuttavia, gli enormi progressi nella conoscenza dei meccanismi molecolari e cellulari della malattia neoplastica e la volontà di dare attuazione ai principi della medicina personalizzata in ambito oncologico hanno creato le premesse e le aspettative per un salto di qualità nell informazione di laboratorio. La personalizzazione dell approccio alla malattia oncologica si basa sulla possibilità di intervenire sulla storia naturale della malattia identificando fattori di rischio, segnali precoci di trasformazione cellulare, fattori prognostici e meccanismi di alterata metabolizzazione dei farmaci. Negli ultimi anni, la personalizzazione della cura in ambito oncologico si è andata affermando attraverso lo sviluppo dei cosiddetti test diagnostici di accompagnamento (companion diagnostics), ossia di test di laboratorio capaci di indirizzare correttamente la terapia con farmaci molecolari. Il laboratorio diviene partner indispensabile per la personalizzazione della terapia del singolo paziente. Il compito del laboratorio è peraltro assicurare la corretta traduzione nella pratica clinica di queste innovazioni attraverso una attività che

73 spazia dalla appropriatezza nella richiesta, alla garanzia di qualità analitica fino alla corretta interpretazione dei risultati. 7.2 Alterazioni genetiche nelle Neoplasie del Pancreas Lo studio del genoma umano ha permesso di individuare molti dei meccanismi molecolari che portano allo sviluppo dei tumori, compreso quello pancreatico. E stata documentata un incidenza progressivamente crescente di mutazioni sia livello d oncogeni (geni che favoriscono la trasformazione neoplastica delle cellule) che di geni oncosoppressori (geni che controllano la crescita cellulare impedendo di moltiplicarsi alle cellule che abbiano subito alterazioni che favoriscono l insorgenza del cancro) nelle lesioni precancerose che possono formarsi e progredire all interno del pancreas. I principali geni nucleari mutati nelle cellule tumorali pancreatiche sono l oncogene k-ras, e gli oncosoppressori p53, p16 e DPC4. Una familiarità per carcinoma pancreatico è presente in circa il 10% dei pazienti con carcinoma pancreatico, mentre si stima che i fattori genetici contribuiscano al 10 15% dei casi. Per quanto riguarda il ciclo cellulare durante la fase G1 la cellula è a riposo. In fase S si verifica la sintesi delle proteine necessarie per la replicazione, durante la fase G2 la cellula si prepara a duplicare il suo contenuto di DNA che avviene durante la mitosi (M), che consente la generazione di due cellule figlie, esattamente uguali alla cellula di partenza. Gli oncogeni, come RAS, se alterati, stimolano una continua duplicazione cellulare; i geni oncosoppressori (p16, p53, DPC4), se alterati, non esercitano più il loro controllo inibitorio sulla proliferazione cellulare

74 Lo sviluppo, la crescita continua e le metastasi da carcinoma pancreatico sono da imputare a modificazioni genetiche ed epidgenetiche multiple, tra cui la disattivazione di geni oncosoppressori e l'attivazione di protoncogeni. Le alterazioni genetiche molecolari identificate negli adenocarcinomi duttali del pancreas comprendono l'intera gamma dei tipi base delle mutazioni tumorali: traslocazioni, amplificazioni, delezioni e mutazioni puntiformi. Le lesioni pancreatiche intraduttali PanIN rappresentano stadi progressivi della crescita neoplastica, che precedono l insorgenza dell adenocarcinoma pancreatico. La progressione da lesioni istologiche a basso grado, a lesioni ad alto grado, fino a carcinoma infiltrante è associata all accumularsi di specifiche alterazioni genetiche, che sembrano avere una precisa sequenza temporale. Tali alterazioni vengono classificate come precoci (mutazioni k-ras), intermedie ( perdita INK4A) o tardive (mutazioni di SMAD4/DPC4 ecc). Mutazioni puntiformi dell oncogene KRAS sono presenti nel 90% dei tumori umani e queste sono probabilmente necessarie per per lo sviluppo del carcinoma duttale del pancreas e per la progressione del tumore fino a carcinoma invasivo. Mutazioni puntiformi dei geni della famiglia ras sono l anomalia singola più comune di oncogeni trasmesse come caratteri autosomici dominanti nei tumori umani. Le mutazioni generalmente interessano i codoni o 61 di HRAS KRAS e NRAS. Le proteine ras sono legate al lato interno della membrana citoplasmatica e passano in continuazione da uno stato attivato a uno inattivo. Recentemente è stato scoperto che queste proteine sono presenti anche sulle membrane del reticolo endoplasmatico e del golgi dove possono essere attivati da fattori di crescita che si legano alla membrana plasmatica attraverso

75 un meccanismo ancora incerto. Nello stato inattivo le proteine ras legano la guanosina difosfato (GDP) quando le cellule sono stimolate da fattori di crescita o da altre interazioni recettori ligando ras si attiva promuovendo la fosforilazione di gdp a gtp. Ras attivato agisce sulla via delle MAP chinasi (proteina attivata da mitogeni) reclutando la proteina citosolica raf1. Le mapchinasi attivate hanno come bersaglio fattori trascrizionali nucleari e promuovono la mitosi. Nelle cellule normali l attivazione del ras è transitorio perché il GTP viene idrolizzato in GDP facendo tornare il ras in uno stato qiescente. L attivazione e l inattivazione di ras dipende da due reazioni: scambio di nucleotidi (GDP per GTP che attiva la proteina ras) e l idrolisi del GTP che è legato al ras attivo nella forma inattiva legata al GDP. Entrambi i processi sono regolati enzimaticamente. L attività GTPasica intrinseca delle proteine ras è notevolmente accelerata dalle proteine attivanti la GTPasi, le GAP. Queste, ampiamente distribuite in varie cellule si legano al ras attivo aumentando la sua attività GTPasica di più di mille volte portando a una rapida idrolisi del GTP in GDP e quindi al termine della trasduzione del segnale. Quindi le GAP funzionano come freni di un attività incontrollata di Ras. La risposta a questa azione di freno viene compromessa dalle mutazioni che colpiscono i geni ras. Le proteine ras mutate si legano a GAP ma la loro attività GTPasica non viene aumentata. Quindi queste proteine mutate si trovano in uno stato eccitato legato al GTP causando un attivazione patologica delle vie che dispensano segnali mitogeni. L importanza dell attivazione della GTPasi nel controllo della crescita è messo in evidenza dal fatto che una mutazione inattivante la neurofìbromina (che attiva la GTPasi) è associata allo sviluppo di neoplasie. Studi recenti hanno dimostrato che RAS è importante anche nella regolazione del ciclo cellulare. Il passaggio dalla fase G1 alla fase S è modulato dalle cicline e dalle CDK (chinasi ciclina

76 dipendente). Le proteine ras possono regolare indirettamente i livelli di cicline attraverso la via della mapchinasi e il fattore di trascrizione AP1. Anche le proteine Notch sono una componente fondamentale per lo sviluppo del carcinoma del pancreas. Da recenti studi si è ipotizzato che alterazioni del gene K RAS e del recettore Notch1 si intersechino specificamente nella patogenesi del carcinoma pancreatico duttale. In conclusione, è stato dimostrato che la perdita di Notch1, nel contesto di K-ras attivato, porta ad un'accelerazione della progressione tumorale e un aumento nel numero delle lesioni PanIN. Ciò implica che Notch1 può funzionare come un soppressore tumorale in presenza di KRAS attivo nell induzione del carcinoma pancreatico. Risultano comunque necessari ulteriori studi. L oncosoppressore che più frequentemente risulta inattivato nel cancro del pancreas è il gene P16/CDKN2A, conosciuto anche come INK4A. La proteina codificata dal gene INK4A appartiene alla famiglia degli inibitori delle chinasi dipendenti da ciclina ed in quanto tale inibisce la progressione lungo il ciclo cellulare a livello della transizione G1-S. L inattivazione di questo gene si osserva in circa l 80% dei casi di cancro del pancreas e si verifica come conseguenza di differenti meccanismi che comprendono la delezione omozigote, la mutazione genica con perdita contemporanea del secondo allele oppure per silenziamento genico dovuto alla metilazione del promotore. L inattivazione del gene P53 si verifica in circa il 60% dei casi e generalmente come conseguenza di mutazione intragenica combinata con la perdita del secondo allele. La proteina p53 svolge una serie di importanti funzioni all interno della cellula, tra cui la regolazione della transizione G1-S del ciclo cellulare, il mantenimento del punto di arresto G2-M e l induzione dell apoptosi

77 Meno frequente (50% dei casi) è invece l inattivazione di DPC4/SMAD4 (deleted in pancreatic carcinoma 4). In questo caso, l inattivazione si osserva in conseguenza di delezione omozigote oppure per mutazione intragenica combinata con la perdita del secondo allele. L inattivazione di questo gene è inoltre poco frequente in neoplasie non duttali e rarissima in malattie extrapancreatiche. Questo fa sì che l analisi dell espressione immunoistochimica della proteina sia una tecnica diagnostica molto efficace in clinica, soprattutto nel caso di metastasi sospette da un tumore pancreatico primario occulto. L'identificazione di alterazioni genetiche somatiche che sono associati con l'esito del paziente può portare ad utili strumenti clinici ed a instaurare linee guida per il trattamento di pazienti con cancro del pancreas. Poiché il gene SMAD4 codifica per una proteina che è un membro importante della via TGFβ, sono stati esaminati tutti i membri di questa via (SMAD3, SMAD4, TGFβR1 e TGFβR2) individualmente e insieme per alterazioni supplementari in questi tumori. Queste osservazioni hanno portato alla conclusione che non tutte le mutazioni inattivanti i membri di un percorso hanno lo stesso effetto sulla sopravvivenza. Tutti i pazienti i cui tumori presentano l inattivazione del gene SMAD4 sono correlati con una sopravvivenza significativamente peggiore rispetto ai pazienti che non presentano inattivazione di questo gene, mentre l'inattivazione del gene TGFβR2, un altro membro della via di segnalazione TGFβ, non ha mostrato associazione con la sopravvivenza. Questi risultati, combinati con quelli precedentemente riportati in letteratura, suggeriscono che i pazienti con tumori del pancreas resecabile/borderline e inattivazione del gene SMAD4 potrebbero

78 evitare l intervento chirurgico perché il loro tumore probabilmente tenderà a metastatizzare, mentre i pazienti con tumori pancreatici resecabili/borderline e il gene Smad4 intatto possono beneficiare del controllo locale fornito da terapia neoadiuvante e la resezione chirurgica. Uno degli eventi chiave a livello molecolare è la sovraespressione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e l'attivazione delle relative molecole a valle. Lo studio più recente ha dimostrato che l'egfr si riscontra in più del 95% dei pazienti con carcinoma pancreatico. Nella maggior parte dei casi, l'egfr è espresso in concomitanza con i suoi ligandi, EGF o TGF-alpha e l'iperespressione di ligando e recettore forma un loop endocrino che stimola costantemente la proliferazione cellulare. L'espressione dell'egfr e dei suoi ligandi è associata ad una prognosi infausta. Tale alterazione molecolare è importante poiché negli ultimi anni sono stati sviluppati nuovi farmaci in grado di bloccare l'egfr. L'espressione di COX-2 può essere riscontrata nel 75% degli adenocarcinomi pancreatici. Diversi dati preclinici sembrano suggerire che la COX-2 possa avere un ruolo importante nella carcinogenesi pancreatica e, pertanto, essa potrebbe costituire un promettente target chemioterapico nel il trattamento del carcinoma pancreatico. 7.3 Marcatori tumorali e Medicina Personalizzata nelle Neoplasie del Pancreas Il carcinoma duttale del pancreas è una delle forme più letali di cancro

79 Chiaramente, vi è la necessità di migliori biomarcatori di malattia e l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici, in particolare per la malattia metastatica. La conoscenza di mutazioni specifiche potrebbe essere importante anche in relazione alle scelte terapeutiche. Per quanto detto fin ora, l esistenza di pazienti ad alto rischio suggerirebbe l attuazione di test di screening genetico, ma, ad oggi, programmi di questo tipo non sono stati ancora definiti in maniera adeguata e quelli che vengono comunemente denominati "screening secondari" che dovrebbero essere solo parte dei programmi di ricerca. Un lavoro recente che ha sfruttato tecnologie di sequenziamento di nuova generazione ha messo in evidenza la complessità genetica che sottende il cancro del pancreas e l eventuale risposta ad una terapia mirata deve necessariamente tener conto di questa complessità ed un analisi genetica delle pathway molecolari identificate nei singoli pazienti potrà aiutare a definire il miglior regime terapeutico. Studi di espressione genica (gene expression profiling che non è nient altro che la misura dell'espressione di migliaia di geni alla volta, per creare una immagine globale della funzione cellulare. Questi profili possono, per esempio, distinguere tra cellule che sono in proliferazione, o mostrare come le cellule reagiscono ad un particolare trattamento) hanno generato lunghe liste di geni codificanti per proteine e microrna che mostrano un espressione differenziale nel carcinoma duttale pancreatico rispetto al tessuto normale e alle pancreatiti Queste molecole differenzialmente espresse sono ora pezzi di un affascinante puzzle della patogenesi del carcinoma duttale pancreatico, che aspetta la scoperta di chiavi di volta per essere costruito. In particolare, l analisi globale dei profili di espressione genica ha consentito l identificazione di molecole potenzialmente rilevanti da un

80 punto di vista diagnostico e terapeutico. Un esempio importante è rappresentato dalla mesotelina, una proteina di membrana sovraespressa negli adenocarcinomi pancreatici, che viene utilizzata come marcatore diagnostico e che mostra una certa potenzialità anche dal punto di vista terapeutico. Le nuove tecniche di proteomica rappresentano una possibile rivoluzione in quest ambito poiché sono in grado di identificare dei pannelli di proteine unici associati al carcinoma duttale pancreatico, oltre a profili proteici che forniscono una firma molecolare distintiva per questo tipo di tumore. Una cosa importante che emerge da questi studi è la considerazione dell improbabilità di trovare un unico marcatore (ad esempio nel siero) che possa avere sensibilità e specificità tali da poter essere utilizzato per effettuare lo screening di pazienti asintomatici. E per questo motivo che è sempre più preponderante l idea di uno screening per carcinoma duttale pancreatico, che incorpori due o più marcatori. Un aiuto significativo ad indirizzare i risultati di questi studi di proteomica viene dai profili di espressione genica, che potranno essere utili ad esempio alla categorizzazione dei gruppi prognostici così come è accaduto nel caso del cancro della mammella

81 CAPITOLO 8 PROSPETTIVE FUTURE PER LE NEOPLASIE PANCREATICHE Per quanto concerne la prevenzione, anche se non vi è alcuna definitiva evidenza scientifica per una prevenzione del tumore del pancreas, l estensione dal fumo di tabacco o la cessazione, il moderato consumo di alcool ed il mantenimento del giusto peso corporeo sono misure elementari, che possono ridurre il rischio del cancro del pancreas. Attualmente, non vi sono test di screening per la diagnosi precoce del tumore del pancreas in soggetti asintomatici, tutta via alcuni centri hanno sviluppato dei protocolli di ricerca per individuare neoplasie pancreatiche in stadio precoce in individui ad alto rischio per motivi genetici. Per quanto riguarda i farmaci bersaglio, le proteine prodotte dai geni alterati hanno un ruolo chiave da una parte nella regolazione della proliferazione e differenziazione cellulare, dall altra nella fase di meta statizzazione. Tra i farmaci bersaglio presi in considerazione possiamo ricordare gli inibitori delle metallo proteinasi, della farnesil transferasi, dell EGFR, ecc.. Sebbene siano stati compiuti numerosi passi avanti nello studio della carcinogenesi dell adenocarcinoma duttale pancreatico, i meccanismi molecolari risultano complessi, spesso convergenti e non ancora del tutto conosciuti. Numerose proteine nucleari e citoplasmatiche sembrano essere validi marcatori prognostici e promettenti target terapeutici, anche se il blocco selettivo di una sola proteina non sembra essere sufficiente per la cura di tale patologia. La terapia genica rappresenta un campo emergente nella cura delle malattie neoplastiche. Attraverso l espressione, il ripristino o l inibizione di un

82 particolare gene d interesse si cerca di prevenire o contrastare la crescita delle cellule neoplastiche. Applicazioni in corso di studio per il trattamento sono rappresentate invece da tecniche come l ablazione con radiofrequenze e la fototerapia

83 CAPITOLO 9 APPLICAZIONE DELLA TECNICA DEL CELL BLOCK NELLA ROUTINE LABORATORISTICA PER LA DIAGNOSI PRECOCE DELLE NEOPLASIE DEL PANCREAS Affrontare un tema come Diagnosi e linee guida oggi giorno apparentemente scontato è sempre più necessario nel momento in cui nuove tecnologie sono entrate nei nostri laboratori e nella nostra professionalità, fornendoci conoscenze che vanno gestite ed utilizzate al meglio nella formulazione finale della diagnosi; in particolar modo quando queste nuove informazioni rivestono significato prognostico o sono predittive di risposta terapeutica. La migliore gestione può avvenire soltanto attraverso l adozione di linee guida e norme di comportamento quanto più possibile codificate e validate. L importante non è fornire una diagnosi tipologica o generica, ma una diagnosi singolare nel senso che è propria di quella malattia, di quel malato. 9.1 L Impatto della Citologia Agoaspirativa con ago sottile nella diagnosi e nel trattamento delle lesioni solide Pancreatiche nella corrente pratica clinica Generalmente, nella diagnosi dei tumori, si utilizza una classificazione diagnostica articolata il più delle volte in cinque categorie. Per il carcinoma del pancreas si è in presenza di una circostanza differente ed proprio partendo da questa, che si è cercato di coniare, sfruttando casistiche esistenti, una classificazione specifica per la diagnostica del carcinoma del pancreas, e quindi, una classificazione de novo, composta anch essa da cinque classi:

84 1) INADEGUATO/NON DIAGNOSTICO, per un campione caratterizzato da assenza o esiguità di elementi epiteliali (se le atipie sono assenti o di entità lieve o moderata), correlato ad una formulazione di diagnosi espressa come campione insufficiente per una valutazione diagnostica e ad un percorso che preveda la ripetizione dell esame; 2) NEGATIVO PER NEOPLASIA, per un campione caratterizzato dalla presenza di elementi epiteliali privi di atipie, correlato ad una formulazione di diagnosi espressa come negativa la ricerca di cellule neoplastiche e ad un percorso che preveda la ripetizione dell esame o diagnosi di pancreatite cronica; 3) ATIPICO/NON-CONCLUSIVO, per un campione che riflette la presenza di atipie di grado lieve/moderato, il più delle volte associata ad un background infiammatorio, che non consentono una diagnosi differenziale tra carcinomi ben differenziati e noduli di pancreatite cronica, correlato ad una formulazione di diagnosi espressa come elementi epiteliali con atipie citologiche di grado lieve-moderato, tali reperti non consentono una definizione diagnostica circostanziata e ad un percorso ancora da definire; 4) SOSPETTO PER NEOPLASIA, per un campione che indica un alto sospetto di malignità ma con aspetti citologici che non sono sufficienti in termini di quantità o qualità per una diagnosi definita, correlato ad una formulazione di diagnosi espressa come sospetto per carcinoma o sospetto per neoplasia a differenziazione neuroendocrina e ad un percorso che preveda il trattamento (chirurgia/chemio), se in accordo con i dati clinici, di laboratorio e di imaging;

85 5) POSITIVO PER NEOPLASIA, per un campione caratterizzato da una chiara evidenza di patologia neoplastica, correlato ad una formulazione di diagnosi espressa come quadro citologico da carcinoma (inclusi carcinoma pancreatico o malattia metastatica), quadro citologico da neoplasia a differenziazione neuroendocrina e quadro citologico compatibile con neoplasia pseudo papillare di tipo solido e ad un percorso che preveda il trattamento (chirurgia/chemio). (Figura 23) 9.2 Obbiettivi dello studio Dimostrare che con l utilizzo della tecnica del CELL BLOCK, si consegue l obbiettivo di un miglioramento nella performance diagnostica, eliminando quasi del tutto i limiti collegati invece agli strisci convenzionali (eliminazione o riduzione dei campioni inadeguati, non diagnostici, dei falsi negativi e quindi soggetti malati che invece risultano negativi ai test diagnostici, degli artefatti ecc), ma anche che si tratta di una tecnica dotata di maggiore sensibilità rispetto alla precedente. La sensibilità e specificità sono valori molto importanti nella valutazione dei test diagnostici. La sensibilità di un test è la capacità di identificare correttamente pazienti malati (ad esempio il paziente effettivamente ha il cancro e il patologo lo riesce ad identificare). È necessario anche il requisito di specificità. La specificità di un test è la sua capacità di identificare correttamente i pazienti sani (ad esempio il patologo diagnostica il cancro su un paziente la cui diagnosi era differente). L obbiettivo di ogni test diagnostico è essere allo stesso tempo molto sensibile e molto specifico

86 Un test sensibile e specifico al 100% non lascerebbe dubbi, tuttavia, molti test presentano falsi positivi (pazienti sani che risultano positivi) e falsi negativi (pazienti malati che risultano negativi). Ad esempio se il fine è quello di individuare il maggior numero dei malati, il test migliore sarà quello con una sensibilità maggiore mentre se si vogliono individuare i soggetti sicuramente malati, il test migliore è quello con una specificità maggiore. Un test molto sensibile raramente misclassifica i pazienti malati mentre un test molto specifico raramente misclassifica i pazienti sani. 9.3 Materiali e Metodi In questo studio abbiamo valutato due casistiche ben determinate: 1) Citologia agoaspirativa del pancreas allestita come strisci citologi classici; 2) Citologia agoaspirativa del pancreas allestita con la tecnica del citoincluso. Tutti i casi vengono estrapolati dal sistema informativo del Laboratorio (Armonia), confrontando i casi di citologia agoaspirativa del pancreas pervenuti in laboratorio prendendo in considerazione l anno (in cui i campioni si allestivano come strisci citologici), e l anno 2012 (in cui il materiale pervenuto in laboratorio si allestisce con la tecnica del citoincluso). (Figura 24) 9.4 Allestimento manuale, processazione e taglio del Cell Block Una volta pervenuto in laboratorio il materiale ( ago aspirato del pancreas) controllare la sua conformità

87 1) Procedere direttamente all allestimento del Cell-block del sedimento dopo centrifugazione ( immettendo il liquido da sottoporre a centrifugazione in provette da centrifuga, identificate con il cognome del paziente e numero di accettazione, pescando dal fondo del contenitore; centrifugare a 1600 rpm per 10 minuti; al termine asportare le provette dalla centrifuga e posizionarle in un porta provette; capovolgere la provetta centrifugata con movimento omogeneo e deciso per eliminare tutto il liquido sopranatante); 2) Assicurarsi che il gel per il citoincluso (nello specifico nel laboratorio dove ho elaborato la mia tesi di laurea, il laboratorio di Anatomia Patologica del Policlinico Universitario Campus Biomedico di Roma, si utilizza un gel a base di agar) sia sciolto in una falcon nel bagnetto termostato a 60 C. Nel caso fosse solido portare il bagnetto a 90 C per 15 minuti e poi abbassare la temperatura a 60 C per mantenere il gel sciolto (importante è assicurarsi che la porzione di falcon contenete il gel sia immersa in acqua); 3) Allestire il sedimento in una provetta e risospendere con il fissativo; 4) Centrifugare a 1100 rpm per 5 minuti (ricordando sempre che è essenziale eseguire un corretto bilanciamento della centrifuga); 5) Eliminare il sovranatante; 6) Se la centrifugazione è avvenuta in falcon, trasferire il sedimento in una eppendorf, ed inserirle in micro centrifuga, centrifugando per altri 5 minuti; 7) Eliminare il sovranatante; 8) Immettere una goccia di eosina nel sedimento; 9) Immettere una o due gocce di gel (o più, a seconda della quantità del sedimento) e risospendere facendo attenzione a non

88 far trascorrere troppo tempo evitando così una solidificazione del gel che causi una disomogeneità; 10) Centrifugare in microcentrifuga per 10 minuti e mettere la provetta con il Sedimento incluso nel gel ( cell-block ) in frigorifero a +4 C per 30 minuti (nel Nostro caso si deposita in centrifuga refrigerata, se non utilizzata, a 4 C) e Verificare che sia solidificato; 11) Estrarre il cell block dalla provetta con una pinza, effettuare fette circolari o, come nel nostro caso trasversali a becco di clarino a seconda della sedimentazione, metterle in una biocassetta (numerata con il codice riportato sul campione) e inviarle alla processazione; 12) Processare il cell block con il programma delle piccole biopsie (Figura 25). Per quanto concerne la processazione, poiché la consistenza dei tessuti freschi impedisce di ottenere sezioni sottili, i protocolli comunemente utilizzati in citologia ed istologia prevedono l allestimento di preparati che risultino permanenti in modo da poterli studiare con l ausilio del microscopio ottico. Il preparato ideale per un analisi morfologica consiste in una sezione (spessore di 5-10 mm) che possiede la stessa struttura ed organizzazione che aveva nell organismo. L operazione di taglio perciò, non può essere attuata direttamente sul tessuto fissato, in quanto questo non ha una consistenza omogenea e non è facilmente manipolabile. Per ovviare a tali inconvenienti è necessario includere il materiale in un mezzo che lo consolidi e che ne

89 consenta una migliore maneggevolezza. I mezzi d inclusione maggiormente utilizzati sono mezzi anidri, e tra questi annoveriamo la paraffina, che è senza dubbio il mezzo d inclusione più usato. Questi mezzi necessitano, per infiltrare i tessuti, di una preventiva disidratazione del pezzo. La paraffina è una miscela di idrocarburi saturi estratti per raffreddamento dai residui della distillazione del petrolio, è quindi costituita da una miscela di paraffine caratterizzate da punti di fusione variabili, generalmente dai 35 C ai 65 C. La paraffina è insolubile nell acqua, pochissimo solubile nell alcool e abbastanza solubile nello xilolo. L inclusione in paraffina è un procedimento articolato in diversi step: 1) Disidratazione, in cui il tessuto fissato viene sottoposto a bagni successivi di alcool a gradazione crescente fino all alcool assoluto ( usando alcool etilico a 70, 80, 95 e assoluto). Si esegue una disidratazione graduale evitando così brusche coartazioni del pezzo; 2) Impregnazione con un solvente della paraffina, detta amche diafanizzazione, poiché conferisce al tessuto un aspetto diafano, il tessuto passa dall alcool assoluto in un solvente paraffinico, generalmente xilolo; 3) Impregnazione con la paraffina, questa fase deve essere attuata a caldo con paraffina allo stato di fusione. La processazione si può eseguire manualmente, utilizzando una serie di contenitori o taniche contenenti i reagenti utili alla processazione o con macchinari specifici, i processatori, che si distinguono in: 1) Processatori tradizionali (a carosello): sono macchine semplici, dotate di vasche, ciascuna contenente i liquidi necessari nell ordine previsto; mediante un

90 braccio meccanico collegato ad un orologio, un cestello metallico a pareti forate che contiene le biocassette viene calato in ciascuna vasca nell ordine e per il tempo prestabiliti; 2) Processatori automatici: sono versioni più recenti dotati di sistemi chiusi, con possibilità di programmare tramite sistemi computerizzati i tempi dei vari passaggi. In queste macchine sono i diversi reagenti liquidi che vengono introdotti ed espulsi dalla camera che contiene le biocassette da processare ( nel laboratorio dove ho elaborato la mia tesi di laurea, il laboratorio di Anatomia Patologica del Policlinico Universitario Campus Biomedico di Roma, il processatore automatico utilizzato è il L.ASP300S). Al termine della processazione, includere il campione (con un inclusione definitiva in blocchetti di paraffina, utilizzando formelle di metallo, riempiendole parzialmente con paraffina, posizionando il frammento e colmando lo scatolino con altra paraffina fusa, quindi lasciare raffreddare a temperatura ambiente o posizionandolo su una piastra raffreddante) come un normale campione istologico, procedere poi al taglio al microtomo, strumento essenziale per poter ottenere sezioni sottili di pochi micron, in questo caso impostare il microtomo a 3 µ e procedere alla produzione di sezioni. Un lato critico nel momento del taglio è rappresentato dal fatto che non si tratta di un frammento incluso chiaramente visibile come un campione istologico classico, con un maggiore rischio quindi di perdita del materiale (Figura 26). Una volta terminato il taglio, si ottengono sezioni sulle quali si esegue una colorazione di Ematossilina/Eosina di routine (tipica dei campioni istologici)e sulla quali è possibile applicare metodiche accessorie

91 come l IHC atta a ottenere ad esempio definizione di malignità, studiare neoplasie metastatiche e la biologia molecolare. 9.5 Protocollo manuale della tecnica immunoistochimica (IHC) 1) Dai preparati inclusi in paraffina si preparano sezioni di 5 µ, le quali vengono poi raccolte su appositi vetrini porta oggetto trattati con silano ( 3-aminopropil-trieossi-silano), onde evitare il distacco durante la procedura immunoistochimica. I preparati così ottenuti, vengono posti una notte in stufa a 37 C; 2) Si esegue poi la sparaffinatura. Le sezioni vengono deparaffinate immergendole per tre volte in xilolo, con passaggi da 10 minuti ciascuno. Le sezioni vengono poi passate in alcool etilico assoluto, eseguendo tre passaggi da 5 minuti ciascuno. A questo punto le sezioni subiscono bagni in alcool a concentrazione decrescente ( idratazione) fino ad arrivare all acqua distillata; 3) Accendere il bagnetto termostato, impostare la temperatura di 98 C e raggiunta la temperatura inserire la vaschetta con il tampone nel bagnetto; 4) Inserire i vetrini nel tampone, lasciar agire per 30 minuti; 5) Estrarre il contenitore con i vetrini e lasciare raffreddare a temperatura ambiente per circa 10 minuti, evitando così che la differenza di temperatura determini il distaccamento della sezione; 6) Eseguire tre lavaggi con il tampone di lavaggio, ognuno da un minuto. Il tampone di lavaggio TBS è stato preparato preventivamente (nel laboratorio dove ho elaborato la mia tesi di laurea, il laboratorio di Anatomia Patologica del Policlinico Universitario Campus Biomedico di Roma, il tampone in

92 dotazione è concentrato a 10X e quindi eseguire le diluizione necessarie volta per volta); 7) Eseguire il blocco delle perossidasi, aggiungendo il reagente contenente perossido di idrogeno e lasciandolo agire per 10 minuti; 8) Eseguire lavaggi con TBS; 9) Aggiungere il marker (l anticorpo primario), diluendolo con il diluente specifico in base alla quantità utilizzata, lasciarlo agire per 1 ora; 10) Lavaggi con TBS; 11) Aggiungere il post primary (l anticorpo secondario), lasciandolo agire per 15 Minuti; 12) Lavaggi con TBS; 13) Aggiungere il polimero, che funge da amplificatore del segnale, e lasciarlo Agire per 15 minuti; 14) Lavaggi con TBS; 15) Aggiungere la DAB (il substrato cromogeno della POD) opportunamente Diluita e lasciarla agire per 4 minuti; 16) Lavaggi con acqua distillata; 17) eseguire controcolorazione con ematossilina di Mayer lasciandola agire per 5 Minuti; 18) Lavaggio in acqua corrente per ottenere la differenziazione; 19) Eseguire disidratazione con serie ascendente di alcool fino ad arrivare All assoluto, in seguito eseguire tre passaggi della sezione in xilolo, ed infine

93 Procedere al montaggio del vetrino (Figura 27). Il vetrino così allestito viene letto al microscopio ottico per la valutazione dell immunocolorazione. La diagnosi differenziale delle neoplasie solide del pancreas nel laboratorio dove ho elaborato la mia tesi di laurea, il laboratorio di Anatomia Patologica del Policlinico Universitario Campus Biomedico di Roma, prevede: - Diagnosi morfologica per la differenziazione tra Carcinoma duttale del Pancreas vs noduli di pancreatite cronica; - Diagnosi morfologica e utilizzo di tecniche IHC per la differenziazione tra Carcinoma duttale del Pancreas vs tumori neuroendocrini. Il pannello anticorpale impiegato in questo caso prevede l utilizzo della CK7 (citocheratina 7), positiva nell adenocarcinoma e negativa nei tumori neuroendocrini, SYN (sinaptofisina) negativa nell adenocarcinoma e positiva nei tumori neuroendocrini e Cromogranina, negativa negli adenocarcinomi e positiva nei tumori neuroendocrini; - Diagnosi morfologica e utilizzo di tecniche IHC per la differenziazione tra Carcinoma duttale del Pancreas vs Carcinoma acinare. Nel caso in cui la diagnosi morfologica sia fortemente sospetta verso il carcinoma acinare si sfrutta il dosaggio immunoistochimico della tripsina, positiva nei tumori acinari; - In caso di diagnosi di noduli metastatici è l origine che indirizza il pannello da utilizzare, ad esempio in carso di carcinoma del carcinoma del colon si sfrutta la CK 20, in caso di carcinoma della mammella gli ER (recettori degli estrogeni o estradiolo), PgR (recettori del progesterone) e cosi via

94 Il kit utilizzato nel laboratorio dove ho elaborato la mia tesi di laurea per allestire l immunocolorazione è il LSAB ( kit che sfrutta il sistema avidina/biotina) e l immunocoloratore utilizzato è l Autostainer 480 L.V. 9.6 Tecniche di biologia molecolare: Pirosequenziamento EUS FNA è una tecnica sicura ed efficace nella diagnosi e stadiazione delle lesioni solide del Pancreas. La sola EUS è caratterizzata da alta sensibilità ma bassa specificità. Pertanto, l'introduzione di EUS FNA nello studio delle lesioni pancreatiche, ha migliorato la specificità della EUS nella diagnosi delle neoplasie Pancreatiche. Mutazioni del gene KRAS (mutazione puntiforme del codone 12) sono state trovate nel 75-90% degli adenocarcinomi duttali pancreatici con una frequenza sufficientemente alta da meritare applicazione diagnostica. Tuttavia, mutazioni puntiformi del gene k ras sono state riportate anche in malattie pancreatiche non neoplastiche come la pancreatite cronica. In uno studio è stato dimostrato che i dati preliminari, nonostante siano necessari ancora molti dati per rafforzare queste ipotesi, suggeriscono che in caso di lesione pancreatica solida esaminata con la tecnica dell EUS FNA con una diagnosi citopatologica di tipo atipico-inconcludente, l analisi per identificare le mutazioni del gene KRAS possono essere utili suggerendo fortemente una diagnosi di adenocarcinoma pancreatico duttale ( PADC). Tra le nuove tecnologie per valutare le mutazioni di KRAS ricordiamo ad esempio il pirosequenziamento, che è una solida tecnologia attualmente utilizzata nelle piattaforme con capacità di sequenziamento ad alto volume

95 Il pirosequenziamento è una procedura più sensibile (tra il 5 ed il 10%) rispetto al sequenziamento di Sanger. Per quanto concerne il pirosequenziamento, questo metodo si basa sul dosaggio del pirofosfato liberato in seguito all incorporazione di un dntp (deossi-nucleotide-trifosfato) durante la sintesi di dna. Il pirosequenziamento è una tecnica per il sequenziamento del DNA e consta di 5 passaggi principali: 1) La sequenza da analizzare, dopo essere stata amplificata con la PCR, viene incubata come singola elica insieme agli enzimi DNA polimerasi, ATP solforilasi, luciferasi e apirasi e ai substrati adenosinsolfofosfato (ASP) e luciferina; 2) il primo dei quattro dntp è aggiunto alla reazione. La DNA polimerasi catalizza l'aggiunta di tale base solo se è complementare alla base del filamento stampo. In tal caso si ha concomitante liberazione di pirofosfato inorganico (PPi) in quantità equimolare a quella del nucleotide incorporato; 3) In presenza di adenosina 5 fosfosolfato (APS), l ATP solforilasi converte quantitativamente il PPi ad ATP, che, a sua volta guida la conversione, catalizzata dalla luciferasi, di luciferina ad ossiluciferina con conseguente produzione di luce di intensità proporzionale alla quantità di ATP. La luce prodotta è rilevata da una CCD (camera fotosensibile) e visualizzato come picco in un programma; 4) L'enzima apirasi degrada il dntp che non è stato incorporato, e l'atp prodotto dalla solforilasi. Solo quando la degradazione è terminata si aggiunge un

96 secondo dntp per far progredire la reazione di polimerizzazione (ritornando allo step 1); 5) Si aggiungono ciclicamente tutti e 4 i d(ntp) fino alla deduzione completa della sequenza. Man mano che il processo continua, il filamento di DNA complementare è sintetizzato e la sequenza nucleotidica è determinata dai picchi del pirogramma, infatti Il segnale luminoso prodotto ogni volta dalla luciferina viene registrato in un apposito "pirogramma" (Figura 28). Il segnale sarà proporzionale all'atp prodotto e quindi al nucleotide inglobato; un picco di intensità doppia, ad esempio, rileva che nello stesso ciclo sono stati inglobati 2 dntp (ripetizione della stessa base sul templato). Viceversa un segnale nullo indica che il dntp aggiunto in quel ciclo non è complementare. Importante è ricordare che non si può utilizzare l'atp come dntp da introdurre per la polimerizzazione, altrimenti non si riuscirebbe a capire se il segnale rilevato proviene da una corretta incorporazione del nucleotide o dall'attività intrinseca dell'atp. Si utilizza in alternativa l'adenosina-tio-trifosfato, che è riconosciuta dalla DNA polimerasi come se fosse ATP, ma non dalla luciferasi

97 9.7 Risultati dello studio EUS-FNA WITH FOLLOW-UP PRE CITOICLUSO (2009/2010) TABELLA 1 EUS-FNA with follow up PRE-CITOINCLUSO NUMERO % NUMERO K % K EUS-FNA 102 CATEGORY Category ,8% 5 45,4% Category 2 7 K 9 8,8% 5 55,5% Category ,7% 9 69,2% Category ,7% % Category ,0% % Tabella 1 EUS-FNA WITH FOLLOW-UP POST CITOINCLUSO (2012) TABELLA 2 EUS-FNA with follow-up POST CITOINCLUSO NUMERO % NUMERO K % K EUS-FNA 65 CATEGORY Category 1 5 8% 3 60% Category 2 3 5% 0 0% Category 3 4 6% 2 50% Category % 9 100% Category % % Tabella 2 Fonte: SIAPEC-IAP ed elaborazione propria

98 9.8 Discussione In questo studio sono state valutate due casistiche ben determinate: 3) Citologia agoaspirativa del pancreas allestita come strisci citologi classici; 4) Citologia agoaspirativa del pancreas allestita con la tecnica del citoincluso. Tutti i casi vengono estrapolati dal sistema informativo del Laboratorio (Armonia), confrontando i casi di citologia agoaspirativa del pancreas pervenuti in laboratorio prendendo in considerazione l anno (in cui i campioni si allestivano come strisci citologici), e l anno 2012 (in cui il materiale pervenuto in laboratorio si allestisce con la tecnica del citoincluso). Nella tabella 1 vengono classificati un totale di 102 FNA del pancreas prelevati mediante EUS-FNA, allestiti come strisci citologici classici e inviati al Laboratorio di Anatomia Patologica( CASISTICA PRE CITOINCLUSO), sottoposti a follow- up, strumento attraverso il quale si monitorano i pazienti dopo la diagnosi e il trattamento per capire se effettivamente la diagnosi è stata eseguita correttamente. In seguito alla diagnosi si riscontrano 11 casi (in termini percentuali il 10,8%) appartenenti alla categoria 1; 9 casi (in termini percentuali l 8,8%) appartenenti alla categoria 2; 13 casi (in termini percentuali il 12,7%) appartenenti alla categoria 3; 20 casi (in termini percentuali il 19,7 %) appartenenti alla categoria 4 e 49 casi (in termini percentuali il 48%) appartenenti alla categoria 5. Si riscontra perciò che il 32,3% dei casi, di pazienti affetti da lesione pancreatica solida, campionata con EUS-FNA, sono stati classificati come INADEGUATO/NON DIAGNOSTICO, NEGATIVO PER

99 NEOPLASIA, ATIPICO/ NON CONCLUSIVO, mentre il 67,7 % dei casi, di pazienti affetti da lesione pancreatica solida, campionata con EUS-FNA, sono stati classificati come SOSPETTO PER NEOPLASIA E POSITIVO PER NEOPLASIA (quest ultimi trattati perciò con un percorso terapeutico gold standard rappresentato da chirurgia/chemio). In seguito al follow-up si evince che degli 11 casi riscontrati nella prima categoria 5 effettivamente erano colpiti da carcinoma del Pancreas (in termini percentuali il 45,4%); dei 9 casi riscontrati nella seconda categoria 5 effettivamente erano colpiti da carcinoma del Pancreas ( in termini percentuali il 55,5%); dei 13 casi riscontrati nella terza categoria 9 effettivamente erano colpiti da carcinoma del Pancreas (in termini percentuali il 69,2%); dei 20 casi riscontrati nella quarta categoria tutti e 20 i casi erano affetti da carcinoma del Pancreas (in termini percentuali il 100%) ed infine dei 49 casi riscontrati nella quinta categoria tutti e 49 i casi erano affetti da carcinoma del Pancreas (in termini percentuali il 100%). Si deduce così prima di tutto che il follow-up dei pazienti dopo la diagnosi e trattamento è uno strumento fondamentale per evincere una ripresa della malattia, una nuova patologia collegata alla prima o un effetto dannoso legato al trattamento, ma anche per capire se la diagnosi è stata effettuata correttamente o per eseguire misure correttive sui test diagnostici utilizzati e che fondamentale è il poter acquisire i dati dei pazienti per un corretto controllo di qualità nel laboratorio di anatomia Patologica. L altro punto ancor più importante che si deduce da questi dati è che il 45,4% dei pazienti diagnosticati in un primo momento come INADEGUATO/NON DIAGNOSTICO, il 55,5% dei pazienti diagnosticati in un primo momento come NEGATIVO PER NEOPLASIA e il 69,2% dei pazienti diagnosticati in un primo

100 momento come ATIPICO/NON CONCLUSIVO erano in realtà affetti da carcinoma del Pancreas. È necessario di conseguenza contrastare questa discordanza e analizzare la metodica utilizzata per rilevare se effettivamente si tratti di un avversità legata all utilizzo dello striscio citologico come metodica o all allestimento pratico dello striscio citologico ed applicare poi misure correttive. Nella tabella 2 vengono classificati un totale di 65 FNA del Pancreas prelevati mediante EUS-FNA e allestiti (nel laboratorio dove ho elaborato la mia Tesi di Laurea, il Laboratorio di Anatomia Patologica del Policlinico Universitario Campus Biomedico di Roma) con la tecnica del Cell Block ( CASISTICA POST CITOINCLUSO) e sottoposti a follow-up. In seguito alla diagnosi si riscontrano 5 casi (in termini percentuali l 8%) appartenenti alla categoria 1; 3 casi (in termini percentuali il 5%) appartenenti alla categoria 2; 4 casi (in termini percentuali il 6%) appartenenti alla categoria 3; 9 casi (in termini percentuali il 14%) appartenenti alla categoria 4 e 44 casi (in termini percentuali il 68%) appartenenti alla categoria 5. Si riscontra perciò che il 19% dei casi, di pazienti affetti da lesione pancreatica solida, campionata con EUS-FNA, sono stati classificati come INADEGUATO/NON DIAGNOSTICO, NEGATIVO PER NEOPLASIA, ATIPICO/ NON CONCLUSIVO, mentre l 82% dei casi, di pazienti affetti da lesione pancreatica solida, campionata con EUS-FNA, sono stati classificati come SOSPETTO PER NEOPLASIA E POSITIVO PER NEOPLASIA. In seguito al follow-up si evince che dei 5 casi riscontrati nella prima categoria 3 effettivamente erano affetti da carcinoma del Pancreas (in termini percentuali il 60%); dei 3 casi riscontrati nella seconda categoria nessuno è effettivamente colpito da carcinoma del Pancreas

101 (in termini percentuali lo 0%); dei 4 casi riscontrati nella terza categoria 2 effettivamente erano colpiti da carcinoma del Pancreas (in termini percentuali il 50%); dei 9 casi riscontrati nella quarta categoria tutti e 9 i casi erano affetti da carcinoma ( in termini percentuali il 100%) ed infine dei 44 casi riscontrati nella quinta categoria tutti e 44 i casi erano affetti da carcinoma del Pancreas (in termini percentuali il 100%). Da questi dati si deduce che il 60% dei casi diagnosticati in un primo momento come INADEGUATO/NON DIAGNOSTICO e il 60% dei casi diagnosticati in un primo momento come ATIPICO/NON CONCLUSIVO erano in realtà pazienti affetti da carcinoma del Pancreas. Ma punto ancor più importante è invece che nessuno dei tre casi diagnosticati come NEGATIVO PER NEOPLASIA con la metodica del Cell Block si è poi rivelato effettivamente come carcinoma del Pancreas, permettendo così di portare la percentuale di questi casi dopo il follow-up a zero. Questo ci permette di poter dimostrare che la totalità dei casi diagnosticati come negativi con la metodica del Cell Block dopo il follow up risultano realmente non affetti da carcinoma del Pancreas. Indispensabile è ricordare che la categoria 1 (INADEGUATI/NON DIAGNOSTICI) rappresenta un ostacolo poiché non è correlata alla metodica utilizzata ad un problema primario come il prelievo quindi, nonostante le azioni correttive, non potrà mai essere eliminata completamente. Un altro ostacolo è rappresentato dalla categoria 3 (ATIPICO/NON CONCLUSIVO), legato all eterogeneità dei tumori, infatti non tutti i carcinomi duttali del Pancreas sono ben differenziati come tale rendendo difficoltosa l interpretazione al momento della diagnosi

102 CONFRONTO IN % DEI CASI DIAGNOSTICATI NELLE VARIE CLASSI DIAGNOSTICHE 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% % DEL N DEI CASI DIAGNOSTICATI NELLE VARIE CLASSI PRE CB % DEL NUMERO DEI CASI DIAGNOSTICATI NELLE VARIE CLASSI POST CB 10,0% 0,0% Grafico1 Nel grafico 1 si confrontano le percentuali dei casi diagnosticati nelle varie classi sfruttando come criterio di confronto l utilizzo o meno della metodica del Cell Block. Da questo si evince che nella prima categoria la percentuale del numero dei casi diagnosticati è del 10,8% nella casistica PRE CITOINCLUSO contro l 8% della casistica POST CITOINCLUSO; nella seconda categoria la percentuale del numero dei casi diagnosticati è dell 8,8% nella casistica PRE CITOINCLUSO contro il 5% della casistica POST CITOINCLUSO; nella terza categoria la percentuale del numero dei casi diagnosticati è del 12,7% nella casistica PRE CITOINCLUSO contro il 6% della casistica POST CITOINCLUSO; nella quarta categoria la percentuale del numero dei casi diagnosticati è del 19,7% nella casistica PRE CITOINCLUSO contro il 14% della casistica POST CITOINCLUSO ed infine nella quinta categoria la percentuale del numero dei casi diagnosticati è del 48% nella casistica PRE CITOINCLUSO contro il 68% della casistica POST CITOINCLUSO

103 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% CONFRONTO IN % DEI RAGGRUPPAMENTI DIAGNOSTICI CATEGORY (NON DIAGNOSTICHE) CATEGORY 4-5 (DIAGNOSTICHE) % CLASSI DIAGNOSTICHE PRE CB % CLASSI DIAGNOSTICHE POST CB Grafico 2 Nel grafico 2 si confronta il valore assoluto della percentuale dei raggruppamenti delle classi diagnostiche contro quella delle classi diagnostiche 4-5 sfruttando sempre come criterio di confronto l utilizzo o meno della metodica del Cell Block. Si evince perciò che il valore assoluto per le classi diagnostiche è pari al 33% nella casistica PRE CITOINCLUSO contro il 18% nella casistica POST CITOINCLUSO mentre il valore assoluto per le classi diagnostiche 4-5 è pari al 67% nella casistica PRE CITOINCLUSO contro l 80% della casistica POST CITOINCLUSO. Si deduce che, nonostante la casistica POST CITOINCLUSO (riferita all anno 2012) non sia completa poiché l anno è ancora in corso, il trend dei falsi negativi è fortemente diminuito, grazie alla diminuzione evidente della percentuale dei casi classificati nel raggruppamento diagnostico delle prime tre categorie rispetto alla casistica precedente PRE CITOINCLUSO ( la percentuale è passata dal 33% al 18% con una diminuzione dei falsi negativi del 15%) il tutto abbinato ad un forte aumento nella performance diagnostica evidenziata da una maggiore percentuale dei casi classificati nel raggruppamento diagnostico delle categorie 4 e 5 rispetto alla precedente casistica ( la percentuale è passata dal 67% all 82%)