STUDI PRELIMINARI COMPARATIVI SULLA BIODISPONIBILITA E CAPACITA DI PERMEARE LA PELLE DI:

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1 STUDI PRELIMINARI COMPARATIVI SULLA BIODISPONIBILITA E CAPACITA DI PERMEARE LA PELLE DI: - RETINOLO PURO - RETINOLO IN LIPOSOMI - RETINOLO IN LIPOSYSTEM COMPLEX - RETINOLO IN CYCLOSYSTEM COMPLEX - VITAMINA C PURA - VITAMINA C IN LIPOSOMI - VITAMINA C IN LIPOSYSTEM COMPLEX - VITAMINA C IN CYCLOSYSTEM COMPLEX - VITAMINA E PURA - VITAMINA E IN LIPOSOMI - VITAMINA E IN LIPOSYSTEM COMPLEX - VITAMINA E IN CYCLOSYSTEM COMPLEX File: Biodisp2.Doc

2 INDICE INTRODUZIONE...3 Vitamine...3 Inclusione in complessi...3 Sistemi di veicolazione a rilascio controllato...3 Liposomi...4 Liposystem Complex...5 Ciclodestrine...6 Cyclosystem Complex...7 Scopo dello studio...9 Biodisponibilità...9 Razionale dello studio...9 Somministrazione di vitamine a volontari...9 Metodi di determinazione...10 Vitamina E...10 Vitamina C...11 Risultati vitamina E...13 Risultati vitamina C...16 Penetrazione nella pelle...20 Razionale dello studio...20 Preparazione della pelle...20 Celle di diffusione...20 Prodotti da testare...20 Metodo di determinazione...21 Vitamina E...21 Vitamina C...22 Retinolo...23 Procedura...24 Risultati...24 Conclusioni

3 INTRODUZIONE Le vitamine La correlazione tra vitamine e buona salute è nota da tempo. Tuttavia, fino a poco tempo fa le vitamine erano poco utilizzate in cosmetica perchè si pensava non fossero in grado di penetrare la pelle e perchè il metabolismo di quest ultima non era adeguatamente conosciuto. Attualmente, con l approfondimento della conoscenza della fisiologia della pelle e con le nuove tecnologie nel campo dei veicoli biologici, l interesse per l applicazione topica delle vitamine è cresciuto. In termini di bellezza e funzionalità, studi recenti hanno dimostrato che alcune vitamine ed i loro derivati sono in grado di migliorare l efficacia dei prodotti cosmetici. Inoltre, studi clinici e di laboratorio hanno fornito evidenze che queste vitamine, a livelli appropriati, giocano un ruolo importante nella protezione e nei processi di rinnovamento di capelli, pelle e unghie. Alcuni studi hanno dimostrato per le vitamine applicate topicamente un ruolo utile nel combattere diverse disfunzioni della pelle, soprattutto nell aiutare la prevenzione, il rallentamento o l arresto di alcuni processi degenerativi associati all invecchiamento, quali la pelle secca o squamosa e la formazione di rughe. Infine, uno stimolo all utilizzo delle vitamine in creme e lozioni per mantenere la pelle morbida e liscia è stato dato dal fatto che le vitamine sono sostanze naturali. Inclusione in complessi Sistemi di veicolazione a rilascio controllato Negli ultimi anni sono stati fatti numerosi sforzi per ricercare e sviluppare sistemi che ottimizzassero l applicazione e la biodisponibilità dei prodotti cosmetici. Incrementare la biodisponibilità di un principio attivo significa sfruttare al massimo le sue potenzialità e i benefici che si possono trarre dal suo utilizzo. In questo modo è possibile usare concentrazioni inferiori dei principi attivi con ovvi vantaggi economici e una riduzione degli effetti collaterali. 3

4 I sistemi di veicolazione a rilascio controllato usati in cosmetica sono in continua evoluzione, ed è stato dimostrato che è molto vantaggioso scegliere il sistema più adeguato. Nel formulare un prodotto cosmetico bisogna considerare non solo l aspetto sensoriale legato al suo utilizzo, ma anche una serie di fattori tecnici ed economici. Da un punto di vista tecnico è fondamentale avere: a) Compatibilità tra il sistema di veicolazione a rilascio controllato scelto e il principio attivo selezionato. b) Il meccanismo di rilascio più adeguato per l utilizzo in prodotti cosmetici c) Un calcolo della quantità di principio attivo rilasciata dal sistema di veicolazione d) Una costante sicurezza del consumatore Economicamente è molto importante considerare: a) Il costo del sistema di veicolazione a rilascio controllato scelto b) La percentuale di principio attivo contenuta nel sistema c) La facilità di complessazione del principio attivo nel sistema scelto Dopo aver controllato attentamente questi aspetti, è possibile scegliere il sistema di veicolazione a rilascio controllato più efficiente, in modo da ottimizzare l effetto e l efficacia del prodotto cosmetico. Liposomi Il sistema di veicolazione a rilascio controllato più recente è rapresentato dai LIPOSOMI. Il termine liposoma viene dal Greco "lipos" (grasso) e "soma" (corpo). Quindi letteralmente significa "corpo grasso". La scoperta dei liposomi risale al 1961 e fu fatta dallo scienziato inglese Alec D. Bangham, il quale stava studiando la funzione dei fosfolipidi nella coagulazione del sangue. I fosfolipidi sono tra i principali costituenti delle membrane biologiche. Consistono in una coda idrofobica, costituita da una coppia di acidi grassi, e una testa polare idrofilica, che corrisponde al gruppo fosfato. Quando vengono dispersi in un mezzo acquoso, i fosfolipidi si dispongono in micelle sferiche o in strutture a foglietti bimolecolari, i liposomi. Da un punto di vista strutturale i liposomi possono essere classificati in unilamellari e multilamellari. 4

5 Possono inoltre essere suddivisi in liposomi semplici e complessi. Nei liposomi semplici i compartimenti intralamellari ed il compartimento centrale contengono solo acqua o acqua con sostanze idrosulubili in essa disciolte. Nei liposomi complessi si instaurano specifiche interazioni chimico/fisiche reversibili tra le molecole fosfolipidiche dello strato lipidico e gli ingredienti attivi. L interazione tra un liposoma e una membrana cellulare può avvenire in diversi modi: il liposoma può essere assorbito sulla superficie della cellula oppure può essere incorporato per endocitosi. I liposomi inoltre possono scambiare lipidi con la membrana cellulare o fondere la propria membrana con quella cellulare. Qualunque sia il meccanismo, il risultato finale non cambia, perchè in generale i liposomi aumentano l assorbimento dei principi attivi incrementandone così la biodisponibilità. Ciò fondamentalmente deriva dalle loro propretà chimiche e dall alta affinità con le membrane biologiche. Un ulteriore progresso potrebbe essere rappresentato dalla produzione di liposomi con fosfolipidi modificati biotecnologicamente per migliorarne l affinità biologica e l efficienza. Inoltre, si ritiene che i fosfolipidi aiutino la naturale idratazione della pelle e dei capelli. I liposomi generalmente sono costituiti da fosfolipidi, ma possono contenere anche componenti di membrana differenti, come gli Ufasomi (costituiti da acidi grassi e acidi insaturi), i Niosomi (costituiti da poliossietilene alchil eteri e alcoli grassi o da poliossietilene alchil eteri e acidi grassi) e gli Sfingosomi (costituiti da sfingolipidi). Liposystem Complex I.R.A., Istituto Ricerche Applicate, ha sviluppato una forma modificata di liposoma chiamata LIPOSYSTEM COMPLEX. Il LIPOSYSTEM COMPLEX è un sistema brevettato che permette di ottenere rapidamente liposomi con una grande capacità di incapsulare diversi tipi di ingredienti attivi e titolati in fosfolipidi e ingredienti attivi. Il LIPOSYSTEM COMPLEX si basa sull idea di formare un complesso tra l ingrediente attivo e i fosfolipidi prima di assemblarli in un liposoma. A seconda della sua natura idrofilica o idrofobica, e nelle condizioni adeguate, l ingrediente attivo è attratto, tramite interazioni elettrostatiche, dalla corrispondente porzione dei fosfolipidi. Una volta che l ingrediente attivo è catturato e complessato dai fosfolipidi, viene 5

6 completamente integrato come parte del liposoma finale. Il complesso si comporta come un unità stabile, in cui il componente attivo è saldamente tenuto dai fosfolipidi nella membrana liposomiale. Il prodotto quindi è un liposoma attivo più stabile, con un rilascio spontaneo del componente attivo quasi nullo. Partendo dal gel del LIPOSYSTEM COMPLEX, è possibile ottenere la formazione spontanea di liposomi aggiungendo un eccesso di acqua. Le quantità relative dei diversi componenti del gel sono accuratamente controllate cosicchè tramite una semplice diluizione si può ottenere una riorganizzazione dei fosfolipidi così come la formazione spontanea dei liposomi. Il prodotto è estremamente semplice da preparare, essenzialmente puro, senza bisogno di aggiungere conservanti, e con la possibilità di titolare il componente attivo secondo le esigenze. Ciclodestrine Il primo riferimento alle ciclodestrine in letteratura risale al L interesse per le ciclodestrine e le loro applicazioni è cresciuto rapidamente negli ultimi 10 anni, soprattutto nell industria farmaceutica ed alimentare. Il settore cosmetico invece ha iniziato ad interessarsi alle ciclodestrine soltanto pochi anni fa. Le ciclodestrine costituiscono una famiglia di oligosaccaridi ciclici ottenuti tramite degradazione dell amido da parte di un enzima specifico, la glucosiltransferasi (GCT). Il prodotto di reazione primario, in assenza di acqua, va incontro ad una reazione intermolecolare per produrre composti 1-4 ciclici, le ciclodestrine. All interno di questa famiglia si possono distinguere diversi gruppi, tre di questi sono conosciuti particolarmente bene e vengono prodotti industrialmente. Sono chiamati -, -, -ciclodestrine e sono formati rispettivamente da 6, 7, 8 subunità di glucopiranosio. La molecola della ciclodestrina ha forma toroidale, è un piccolo cilindro con una superficie esterna idrofilica ed una cavità centrale idrofobica di dimensioni ben definite. La stabilità di questa struttura è dovuta alla presenza di numerosi legami idrogeno intramolecolari tra le molecole di glucopiranosio. Le ciclodestrine sono in grado di formare complessi di inclusione con una varietà di specie ioniche e molecolari. Quando sono coinvolte nella formazione di un complesso di inclusione le molecole di ciclodestrina assumono una forma a tronco di cono piuttosto che cilindrica. Le dimensioni approssimative delle ciclodestrine sono direttamente proporzionali al numero di unità di glucosio, e la loro 6

7 conformazione in soluzione è praticamente identica a quella nello stato cristallizzato. L arrangiamento delle molecole di ciclodestrina all interno della struttura cristallina può essere di due tipi differenti: le molecole possono disporsi a formare una struttura a "gabbia" o una struttura a "canale". Nelle strutture a canale, le molecole sono allineate una sopra l altra, così come monete in un rotolo. Le molecole incluse, quindi, sono contenute in canali "infiniti", formati dall allineamento lineare di cavità. Tale allineamento può essere sia "testa-coda" sia "testa-testa". Nelle strutture a gabbia, la cavità di ciascuna molecola di ciclodestrina è bloccata su entrambi i lati dalle molecole di ciclodestrina adiacenti, cosicchè le singole cavità sono isolate. In questo tipo di struttura cristallina, le ciclodestrine possono essere disposte a croce, a spina di pesce o a mattonelle. Le cavità delle ciclodestrine cristallizzate da acqua non sono vuote, ma contengono delle molecole d'acqua. I complessi di inclusione in ciclodestrine sono ottenuti sostituendo le molecole d acqua con le molecole opportune. Dopo il processo di inclusione, le dimensioni e la forma della cavità delle ciclodestrine rimangono praticamente inalterate. Tra le ciclodestrine e le molecole incluse ci sono interazioni stabili, principalmente legami di tipo elettrostatico. L incapsulamento molecolare in ciclodestrine presenta diversi vantaggi considerando che : - la sostanza inserita è totalmente o parzialmente inclusa nella cavità e quindi isolata dall ambiente esterno e protetta contro quei processi ossidativi e degradativi che potrebbero danneggiarla - dal momento che la reazione di inclusione è reversibile e i complessi risultanti possono avere una struttura cristallina, non sono esposti a stress di pressione - l inclusione inibisce la decomposizione naturale delle sostanze attive incluse - incapsulando provvisoriamente certi principi attivi, questi mostrano proprietà di "rilascio controllato" che ne migliorano la biodisponibilità - le molecole incluse presentano una tossicità ridotta. Cyclosystem Complex Il CYCLOSYSTEM COMPLEX è un sistema studiato per la preparazione di complessi di inclusione di diversi componenti attivi con le ciclodestrine. Anche in 7

8 questo caso, come per il LIPOSYSTEM COMPLEX, si instaurano interazioni stabili di tipo elettrostatico tra la molecola ospite e le molecole ospitanti. Il CYCLOSYSTEM COMPLEX è utilizzato per aumentare la solubilità di un componente attivo, per proteggerlo dalla degradazione, dalla luce, dal calore, dall ossidazione e per prolungarne la shelf life. Rappresenta un sistema versatile adatto a veicolare svariati tipi di molecole. Risultati eccellenti sono già stati ottenuti con vitamine, acidi grassi insaturi, enzimi, derivati vegetali e derivati naturali in generale. 8

9 Scopo dello studio I dati riportati in questo studio descrivono la differenza nella biodisponibilità di alcune vitamine quando sono nella forma libera o incluse in LIPOSYSTEM COMPLEX, in CYCLOSYSTEM COMPLEX, o in LIPOSOMI e la loro capacità di penetrare nella pelle. E stato condotto un esperimento in vivo su volontari umani sani dando loro, per somministrazione orale, vitamine complessate in liposomi, liposystem complex e cyclosystem complex, per verificare la differenza in termini di biodisponibilità. La capacità delle vitamine, incluse in differenti complessi, di penetrare nella pelle è stata testata mediante un sistema in vitro costituito da celle di diffusione e dischi di pelle. BIODISPONIBILITA Razionale dello studio La disponibilità nel sangue di tutti i componenti somministrati per via orale dipende sia dal grado di estrazione epatica sia dalla quantità che raggiunge il fegato attraverso il sangue portale. Ciò significa che l idofilicità o l idrofobicità di un componente influenza la sua estrazione dal fegato e la sua disponibilità nel sangue. Per questa ragione la valutazione della biodisponibilità è stata fatta comparando le quantità di vitamina nella forma libera e nella forma complessata rilevate nel sangue. Inoltre, per alcune molecole, come ad esempio la vitamina E, la distinzione tra componente endogena ed esogena risulta difficile. Pertanto, per evitare di sovrastimare le vitamine nel sangue, sono stati utilizzati dei volontari non trattati come controllo. La quantità di vitamine trovata nel loro sangue ai tempi di controllo è stata considerata come vitamina prodotta endogenamente. Somministrazione delle vitamine ai volontari Lo studio è stato effettuato su un campione di sei volontari in buona salute (quattro maschi e due femmine) di età compresa tra i 22 e i 55 anni e del peso di

10 kg. Pastiglie di complessi di vitamine e di vitamine libere sono state somministrate per via orale a ciascun soggetto a intervalli di 3 giorni e in ordine casuale. Le pastiglie venivano assunte dai volontari la mattina a digiuno con liquidi (150 ml di acqua e una tazza di caffè). Contenuto delle pastiglie somministrate ai volontari: a) complessi di inclusione senza vitamine (primo controllo) b) 1 g di vitamina pura (secondo controllo) c) 0,5 g di vitamina complessata in LIPOSYSTEM COMPLEX d) 0,5 g di vitamina complessata in CYCLOSYSTEM COMPLEX e) 0,5 g di vitamina complessata in LIPOSOMI Data l elevata tossicità del retinolo, non è stato possibile studiare la sua biodisponibilità seguendo questo protocollo. Campioni di sangue sono stati prelevati a diversi tempi: dopo 20, 40, 60, 80, 100, 120, 180, 210 e 240 minuti. Il contenuto di vitamine è stato determinato tramite HPLC. Metodo di determinazione La quantità totale di vitamina C ed E nel sangue è stata determinata mediante HPLC. Ad ogni tempo di analisi, campioni di sangue sono stati prelevati da ogni soggetto. I campioni sono stati tenuti a 37 C per 30 minuti. Dopo coagulazione del sangue, i campioni sono stati centrifugati ed è stato raccolto il plasma. Per ottenere il siero, ai campioni di plasma è stato aggiunto EDTA a una concentrazione finale dello 0,1% e sono stati centrifugati. I campioni di siero sono stati concentrati 10 volte sotto vuoto per aumentare la concentrazione delle vitamine in modo da avere una maggior sensibilità nell analisi HPLC. I campioni sono stati conservati a -20 C. Vitamina E Materiali: - Hypersil ODS, 3, Shandon, Southern Products, Cadwick Road Astmoore. - Etanolo assoluto - Metanolo 10

11 - Vitamina E standard di riferimento Procedura: Soluzione standard Pesare accuratamente 0,01 g (Wst) di Vitamina E in una fiasca volumetrica da 200 ml. Sciogliere in etanolo e portare al volume di 100 ml. La concentrazione di questa soluzione standard (c) dovrebbe essere di circa 5 ì/ml e viene calcolata come segue: c= p x Wst / 0,2 p= Potenza della vitamina E in % Wst= Peso standard (ca. 0,01 g) Soluzione campione Trasferire 0,5 ml di siero concentrato in una fiasca volumetrica da 100 ml. Diluire con 50 ml di etanolo e sonicare per 10 minuti. La soluzione campione per l iniezione è rappresentata dal surnatante ottenuto dopo centrifugazione. Condizioni cromatografia: - Fase mobile: 98% metanolo + 2% acqua - Fase stazionaria: Hypersil ODS 3 - Velocità di flusso: ca. 1,2 ml/min - Pressione: ca bar - Volume di iniezione: 20 l - Determinazione: determinazione UV, a 285 nm - Valutazione: tramite area dei picchi Calcolo: Vitamina E g/kg = Fs x c x 2 / Fst x Ws Fs = Area del picco della soluzione campione Fst = Area del picco della soluzione standard c = Concentrazione della soluzione standard in ìg/ml Ws = Peso del campione 11

12 Vitamina C Materiali: - Adsorbosil C18, 10 m, 300 x 4,6 mm - Metanolo - Vitamina C standard di riferimento Procedura: Soluzione standard Pesare accuratamente 0,01 g (Wst) di Vitamina C in una fiasca volumetrica da 200 ml. Sciogliere in metanolo e portare al volume di 100 ml. La concentrazione di questa soluzione standard (c) dovrebbe essere di circa 5 ì/ml e viene calcolata come segue: c= p x Wst / 0,2 p= Potenza della vitamina C in % Wst= Peso standard (ca. 0,01 g) Soluzione campione Trasferire 0,5 ml di siero concentrato in una fiasca volumetrica da 100 ml. Diluire con 50 ml di metanolo e sonicare per 10 minuti. La soluzione campione per l iniezione è rappresentata dal surnatante ottenuto dopo centrifugazione. Condizioni cromatografia: - Fase mobile: 100% methanol - Fase stazionaria: Adsorbosil C18 10 m - Velocità di flusso: ca. 1 ml/min - Pressione: ca bar - Volume di iniezione: 20 l - Determinazione: determinazione UV, a 254 nm - Valutazione: tramite area dei picchi 12

13 Calcolo: Vitamina C g/kg = Fs x c x 2 / Fst x Ws Fs = Area del picco della soluzione campione Fst = Area del picco della soluzione standard c = Concentrazione della soluzione standard in ìg/ml Ws = Peso del campione Risultati con la vitamina E Le concentrazioni di vitamina nel siero di ciascun volontario dopo la somministrazione orale delle pastiglie contenenti il complesso di inclusione (con o senza vitamina) o la vitamina in forma libera, sono riportate nella Tabella I. Ciascun punto è stato calcolato come media dei campioni prelevati da sei volontari. 13

14 TABELLA I. CONCENTRAZIONE VITAMINA E ( g/ml) NEL SANGUE TEMPO (min) VITAMINA E LIBERA VITAMINA E IN CYCLO SYSTEM COMPLEX VITAMINA E IN LIPOSYSTEM COMPLEX VITAMINA E IN LIPOSOMI 0 1,0 0,18 0,9 0,20 1,0 0,11 1,1 0, ,0 0,13 2,5 0,12 2,7 0,10 3,0 0, ,5 0,14 3,1 0,10 4,8 0,11 3,7 0, ,3 0,11 3,5 0,10 3,8 0,12 4,1 0, ,8 0,12 3,9 0,12 3,6 0,10 3,2 0, ,5 0,13 3,6 0,11 2,9 0,13 2,7 0, ,1 0,15 3,4 0,10 2,8 0,11 2,5 0, ,8 0,10 3,0 0,11 2,5 0,10 2,0 0, ,5 0,12 2,1 0,13 2,1 0,11 1,5 0, ,3 0,12 1,8 0,11 1,3 0,12 1,1 0,12 Come riportato in Tabella I, la concentrazione di vitamina E nel siero al tempo zero (primo controllo) è circa 1,1 g/ml e rappresenta la componente endogena di vitamina E. I dati riportati in Tabella I sono illustrati nel grafico I. 14

15 Grafico I: BIODISPONIBILITA' DI VITAMINA E 5,50 CONCENTRAZIONE DI VITAMINA E (ìg/ml) 4,50 3,50 2,50 1,50 vit. libera c.c. vit. l.c. vit. lip. vit. controllo 0,50-0, TEMPO (min) 15

16 Dati di cinetica: C0 = concentrazione di vitamina E nel siero al tempo zero = 1,1 g/ml T/2 = emivita (min): Vitamina E libera c.a. 190 min Vitamina E in Cyclosystem Complex c.a. 240 min Vitamina E in Liposystem Complex c.a. 230 min Vitamina E in Liposomi c.a. 200 min C(max) = concentrazione massima (picco): Vitamina E libera Vitamina E in Cyclosystem Complex Vitamina E in Liposystem Complex Vitamina E in Liposomi Tmax (min) = tempo per raggiungere la Cmax: Vitamina E libera Vitamina E in Cyclosystem Complex Vitamina E in Liposystem Complex Vitamina E in Liposomi 4,3 g/ml 3,9 g/ml 4,8 g/ml 4,1 g/ml 60 min 80 min 40 min 60 min I risultati dimostrano che, sebbene si sia ottenuto un modello simile per i 4 gruppi, si è potuto osservare un comportamento migliore per la VITAMINA E in CYCLOSYSTEM COMPLEX e la VITAMINA E in LIPOSYSTEM COMPLEX. Per stabilire la biodisponibilità relativa dei diversi gruppi, i parametri farmacocinetici sono stati valutati basandosi sulle concentrazioni di vitamina nel plasma. La concentrazione al tempo zero (C0), la concentrazione massima (Cmax) e il loro rapporto sono simili per i 4 gruppi testati. Tuttavia, sia il tempo necessario a raggiungere la concentrazione massima (Tmax) sia l emivita della vitamina E (T1/2) sono diverse. Infatti, c è un ritardo nel picco della concentrazione nel sangue della 16

17 Vitamina E in CYCLOSYSTEM COMPLEX rispetto a quella in LIPOSYSTEM COMPLEX e alla vitamina libera. Tuttavia, sia la VITAMINA E in CYCLOSYSTEM COMPLEX che la VITAMINA E in LIPOSYSTEM COMPLEX mostrano un emivita della vitamina maggiore rispetto alla VITAMINA E in LIPOSOMI e ancora più elevata rispetto alla vitamina E libera. Questo risultato potrebbe riflettere un più rapido assorbimento della vitamina E libera ma anche un metabolismo più veloce. Al contrario, a dispetto dell iniziale ritardo nell assorbimento della Vitamina E in CYCLOSYSTEM COMPLEX, la sua concentrazione nel plasma rimane più elevata per un tempo maggiore. Un comportamento differente può essere osservato per la Vitamina E veicolata dal LIPOSYSTEM COMPLEX, dove non c è un ritardo e la concentrazione nel plasma rimane più elevata rispetto alla vitamina libera. Dai dati riportati si può supporre che la permanenza più prolungata nel flusso sanguigno della vitamina veicolata da complessi ne aumenti la biodisponibilità. Risultati con la Vitamina C Le concentrazioni di vitamina nel siero di ciascun volontario dopo la somministrazione orale delle pastiglie contenenti il complesso di inclusione (con o senza vitamina) o la vitamina in forma libera, sono riportate nella Tabella II. Ciascun punto è stato calcolato come media dei campioni prelevati da sei volontari. 17

18 TABELLA II. CONCENTRAZIONE VITAMINA C ( g/ml) NEL SANGUE TEMPO (min) VITAMINA C LIBERA VITAMINA C in CYCLO SYSTEM COMPLEX VITAMINA C in LIPOSYSTEM COMPLEX VITAMINA C in LIPOSOMI ,8 0,13 2,5 0,12 2,7 0,10 3,0 0, ,8 0,14 3,1 0,10 5,3 0,11 4,0 0, ,3 0,11 3,5 0,10 4,6 0,12 5,0 0, ,9 0,12 5,0 0,12 4,5 0,10 4,2 0, ,0 0,13 4,6 0,11 3,9 0,11 3,5 0, ,6 0,15 4,0 0,10 3,6 0,11 2,8 0, ,2 0,10 3,5 0,11 2,7 0,10 2,0 0, ,0 0,12 2,1 0,13 2,0 0,11 1,5 0, ,9 0,12 1,8 0,11 1,3 0,13 1,2 0,11 Come riportato in Tabella II, la concentrazione di vitamina C nel siero al tempo zero (primo controllo) è 0 g/ml. I dati riportati in Tabella II sono illustrati nel grafico II. 18

19 Grafico II: BIODISPONIBILITA' DI VITAMINA C 6,50 5,50 CONCENTRAZIONE DI VITAMINA C (ìg/ml) 4,50 3,50 2,50 1,50 vit. libera c.c. vit. l.c. vit. lip. vit. 0,50-0, TEMPO (min) 19

20 Dati di cinetica: T/2 = emivita (min): Vitamina C libera c.a. 95 min Vitamina C in Cyclosystem Complex c.a. 200 min Vitamina C in Liposystem Complex c.a. 160 min Vitamina C in Liposomi c.a. 140 min C(max) = concentrazione massima (picco): Vitamina C libera Vitamina C in Cyclosystem Complex Vitamina C in Liposystem Complex Vitamina C in Liposomi Tmax (min) = tempo per raggiungere la Cmax: Vitamina C libera Vitamina C in Cyclosystem Complex Vitamina C in Liposystem Complex Vitamina C in Liposomi 5,3 g/ml 5,0 g/ml 5,8 g/ml 5,0 g/ml 60 min 80 min 40 min 60 min I risultati mostrano un comportamento molto simile per la Vitamina E e la Vitamina C quando sono complessate in CYCLOSYSTEM COMPLEX e in LIPOSYSTEM COMPLEX. Infatti, anche nel caso della Vitamina C, sebbene per i 4 gruppi sia stato ottenuto un modello simile, si è potuto osservare un comportamento migliore per la VITAMINA C in CYCLOSYSTEM COMPLEX e la VITAMINA C in LIPOSYSTEM COMPLEX. Per stabilire la biodisponibilità relativa dei diversi gruppi sono stati valutati i parametri farmacocinetici basandosi sulle concentrazioni di vitamina nel siero. La concentrazione al tempo zero (C0), la concentrazione massima (Cmax) e il loro rapporto sono simili per i 4 gruppi testati. Tuttavia, sia il tempo necessario a raggiungere la concentrazione massima (Tmax) sia l emivita della vitamina C (T1/2) sono diverse. Infatti, c è un ritardo nel picco della 20

21 concentrazione nel sangue della Vitamina C in CYCLOSYSTEM COMPLEX rispetto a quella in LIPOSYSTEM COMPLEX e alla vitamina libera. Tuttavia, sia la VITAMINA C in CYCLOSYSTEM COMPLEX che la VITAMINA C in LIPOSYSTEM COMPLEX mostrano un emivita della vitamina maggiore rispetto alla VITAMINA C in LIPOSOMI ed ancora più elevata rispetto alla vitamina C libera. Questo risultato potrebbe riflettere un più rapido assorbimento della vitamina C libera ma anche un metabolismo più veloce. Al contrario, a dispetto dell iniziale ritardo nell assorbimento della Vitamina C in CYCLOSYSTEM COMPLEX, la sua concentrazione nel plasma rimane più elevata per un tempo maggiore. Un comportamento differente può essere osservato per la Vitamina C veicolata dal LIPOSYSTEM COMPLEX, dove non c è un ritardo e la concentrazione nel plasma rimane più elevata rispetto alla vitamina libera. Dai dati riportati si può supporre che la permanenza più prolungata nel flusso sanguigno della vitamina veicolata da complessi ne aumenti la biodisponibilità. 21

22 PERMEAZIONE DELLA PELLE Razionale dello studio Con questo protocollo, è possibile testare in vitro la capacità di ingredienti cosmetici di permeare la pelle umana. L assorbimento/penetrazione nella pelle dei prodotti viene valutata utilizzando campioni di pelle umana isolati da donatori tramite operazione chirurgica e posti in celle di diffusione. Preparazione della pelle Partendo dalla pelle è possibile preparare un campione di membrana epiteliale. La pelle viene lasciata in un bagno di acqua calda (58-60 C) per 60 secondi, quindi lo strato epidermico è accuratamente prelevato utilizzando bisturi e pinze. La membrana epiteliale così ottenuta viene poi tagliata adattandola all area della cella di diffusione e viene posta tra la camera superiore e quella inferiore della cella. Celle di diffusione Ad ogni tempo di misurazione sono state utilizzate due celle di diffusione per testare ciascun prodotto. In ogni cella è stato posto un campione di pelle tra le due camere di diffusione. La pelle è stata mantenuta ad una temperatura di 32 1 C in un bagno termico. Un ora prima di iniziare l esperimento il comparto superiore della cella è stato riempito con un tampone fosfato e la pelle è stata controllata al microscopio. Prodotti da testare I prodotti testati sono i seguenti: a) 1% vitamina libera c) 1% vitamina in LIPOSYSTEM COMPLEX d) 1% vitamina in CYCLOSYSTEM COMPLEX e) 1% vitamina in LIPOSOMI Le vitamine usate sono: Retinolo, Vitamina C e Vitamina E. 22

23 2 mg di ciascun prodotto sono stati applicati sulla superficie della pelle. Metodo di determinazione Ad ogni tempo di determinazione, il materiale applicato è stato recuperato dalla superficie della pelle. La quantità totale di Vitamina E, Vitamina C e Retinolo è stata determinata tramite HPLC utilizzando il seguente metodo. Vitamina E Materiali: - Hypersil ODS, 3, Shandon, Southern Products, Cadwick Road Astmoore. - Etanolo assoluto - Metanolo - Vitamina E standard di riferimento Procedura: Soluzione standard Pesare accuratamente 0,01 g (Wst) di Vitamina E in una fiasca volumetrica da 200 ml. Sciogliere in etanolo e portare al volume di 100 ml. Diluire 10 volte con etanolo. La concentrazione di questa soluzione standard (c) dovrebbe essere di circa 0,5 ì/ml e viene calcolata come segue: c= p x Wst / 0,2 p= Potenza della vitamina E in % Wst= Peso standard (ca. 0,01 g) Soluzione campione Trasferire in una fiasca volumetrica da 50 ml il materiale recuperato. Diluire con 10 ml di etanolo e sonicare per 10 minuti. Il surnatante ottenuto dopo centrifugazione e filtrazione rappresenta il campione per l iniezione. 23

24 Condizioni cromatografia: - Fase mobile: 98% metanolo + 2% acqua - Fase stazionaria: Hypersil ODS 3 - Velocità di flusso: ca. 1,2 ml/min - Pressione: ca bar - Volume di iniezione.: 20 l - Determinazione: determinazione UV, a 285 nm - Valutazione : tramite area dei picchi Calcolo: Vitamina E g/kg = Fs x c x 2 / Fst x Ws Fs = Area del picco della soluzione campione Fst = Area del picco della soluzione standard c = Concentrazione della soluzione standard in ìg/ml Ws = Peso del campione Vitamina C Materiali: - Adsorbosil C18, 10 m, 300 x 4,6 mm - Metanolo - Vitamina C standard di riferimento Procedura: Soluzione standard Pesare accuratamente 0,01 g (Wst) di Vitamina C in una fiasca volumetrica da 200 ml. Sciogliere in metanolo e portare al volume di 100 ml. Diluire 10 volte con metanolo. La concentrazione di questa soluzione standard (c) dovrebbe essere di circa 0,5 ì/ml e viene calcolata come segue: c= p x Wst / 0,2 p= Potenza della vitamina C in % 24

25 Wst= Peso standard (ca. 0,01 g) Soluzione campione Trasferire in una fiasca volumetrica da 50 ml il materiale recuperato. Diluire con 10 ml di metanolo e sonicare per 10 minuti. Il surnatante ottenuto dopo centrifugazione e filtrazione rappresenta il campione per l iniezione. Condizioni cromatografia: - Fase mobile : 100% metanolo - Fase stazionaria: Adsorbosil C18 10 m - Velocità di flusso: ca. 1 ml/min - Pressione: ca bar - Volume di iniezione: 20 l - Determinazione: determinazione UV, a 254 nm - Valutazione : tramite area dei picchi Calcolo: Vitamina C g/kg = Fs x c x 2 / Fst x Ws Fs = Area del picco della soluzione campione Fst = Area del picco della soluzione standard c = Concentrazione della soluzione standard in ìg/ml Ws = Peso del campione Retinolo Materiali: - LiChrospher 60, RP-Select B, 5U, 250 x 3 mm. - Acetonitrile - Acqua deionizzata - 2,6-di-tert, butyl-p-cresol (BHT) - Retinolo standard di riferimento 25

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