La produzione di proteine ricombinanti mediante processi fermentativi

Dimensione: px

Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "La produzione di proteine ricombinanti mediante processi fermentativi"

Lelia Palmisano
7 anni fa
Visualizzazioni

1 La produzione di proteine ricombinanti mediante processi fermentativi

2 Il mercato mondiale degli enzimi industriali nel 2006 ha superato i 2 MILIARDI DI DOLLARI Negli ultimi 10 anni: +12% produzione/anno!! Molto superiore è il mercato delle proteine ricombinanti a scopo terapeutico (anticorpi fattori di crescita ) in questo caso si raggiungono i 32 MILIARDI DI DOLLARI

3 La produzione ricombinante di proteine

4 Criteri per la scelta del sistema genetico per la produzione ricombinante di una proteina Ospite cellulare della produzione ricombinante Sistema genetico (vettore di espressione) Modalità di crescita dell ospite cellulare per produzione formulazione del terreno di coltura parametri del bioprocesso modalità di fermentazione geometria del fermentatore

5 Criteri per la scelta del sistema genetico per la produzione ricombinante di una proteina

6 La scelta dell ospite... Batteri Gram positivi - Bacillus subtilis Gram negativi - Escherichia coli Archaeabatteri Lieviti S. cerevisiae Muffe Aspergillus niger LA PROTEINA Quali informazioni sono disponibili? Struttura del gene # Proprietà strutturali, cinetiche e biologiche # Possiede modifiche post-traduzionali? ponti disolfurici tagli proteolitici cofattori fosforilazioni glicosilazioni # Le modifiche post-traduzionali sono fondamentali per la sua attività biologica? Cellule eucariotiche immortalizzate Mammiferi / insetti Animali transgenici

7 La scelta dell ospite Batteri Gram positivi Esempio: Bacillus subtilis Cresce bene in terreni poco costosi Ottimo secretore di proteine Strumenti genetici ben sviluppati Però... Secerne proteasi extra-cellulari Batteri Gram negativi Esempio: Escherichia coli Cresce bene in terreni poco costosi Strumenti genetici ben sviluppati Possiede un periplasma a composizione meno complessa del citoplasma Nel periplasma si formano i ponti disulfurici Però... E un pessimo secretore

8 I lieviti (alcune specie sono riconosciute GRAS) Eucarioti unicellulari crescita tipo batterica strumenti genetici ottimi capacità secretorie buone (dip. dalla specie ) modifiche post-traduzionali eucariotiche tuttavia glicosilazione non controllabile non coincide con quella degli eucarioti superiori Le muffe Eucarioti pluricellulari capacità secretorie ottime (20g/L glucoamilasi) (100g/L cellulasi) modifiche post-traduzionali eucariotiche tuttavia strumenti genetici glicosilazione scarsi non controllabile non coincide con quella degli eucarioti superiori La scelta dell ospite

9 Cellule eucariotiche immortalizzate da mammifero o insetto La scelta dell ospite strumenti genetici buoni capacità secretorie buone modifiche post-traduzionali spesso identiche a quelle della proteina nativa tuttavia elevati costi dei mezzi di coltura bassa produttività UTILIZZATE SPESSO NELLA PRODUZIONE DI BIOFARMACI (MOLECOLE AD ELEVATO VALORE AGGIUNTO )

10 Fattori che determinano il successo della produzione di una proteina ricombinante Il prodotto ricombinante si accumula solo se velocità SINTESI velocità DEGRADAZIONE > 0 la VELOCITÀ DI SINTESI dipende n. di copie del vettore efficienza trascrizionale del promotore stabilità genetica del costrutto di espressione durante la fermentazione la VELOCITÀ DI DEGRADAZIONE dipende stabilità del prodotto nel comparto cellulare in cui è stato indirizzato abbondanza e presenza di proteasi dell ospite (es. in E. coli 11 nel citoplasma, 7 nel periplasma, 0 secrete) La localizzazione cellulare del prodotto ricombinante può determinare il successo del processo fermentativo La disponibilità di folding factors può incrementare i livelli di produzione ricombinante!!

11 Vettori di clonaggio e di espressione Numero di copie Stabilità genetica Marcatori di selezione (recessivi o dominanti) Sequenze di regolazione dell espressione genica

12 Il vettore di espressione Le principali tipologie di promotori trascrizionali impiegati nei sistemi di espressione microbici Promotori costitutivi: I livelli di espressione si mantengono COSTANTI durante TUTTO IL PROCESSO FERMENTATIVO es. prom geni della glicolisi tpi Sono indicati nella produzione di proteine indirizzate verso la secrezione od il cui accumulo intracellulare non risulta tossico Promotori regolati: i livelli di espressione VARIANO (in POSITIVO o NEGATIVO) in risposta alla PRESENZA o ASSENZA di un determinato COMPONENTE nel MEZZO di COLTURA es. prom lac o T7 phage promoter Sono quelli maggiormente utilizzati e particolarmente indicati nella produzione di proteine TOSSICHE per l ospite Definizione empirica del migliore connubio promotore/prodotto!

13 Il vettore di espressione Le principali tipologie di vettori di espressione microbici Vettori episomali: sono dotati di una sequenza ARS (autonomous replication sequence) per cui la loro replicazione è indipendente da quella del cromosoma Medio/alto numero di copie (da 50 a 500) La stabilità genetica dipende dalla presenza e concentrazione dell agente di selezione e/o dalla quantità di proteina ricombinante prodotta Vettori integrativi: si integrano nel cromosoma batterico in seguito ad eventi di ricombinazione, per cui la loro replicazione è accoppiata a quella del cromosoma Basso numero di copie (da 1 a 5) Elevata stabilità genetica (misura della frequenza di escissione, cioè dell evento opposto all integrazione) Definizione empirica del migliore connubio vettore/prodotto!

14 Vettori di integrazione

15 Sequenze di indirizzamento cellulare e affinity tag

16 Sequenze di indirizzamento cellulare e affinity tag

17 Problemi che possono insorgere durante la produzione ricombinante di proteine in E. coli DEGRADAZIONE PROTEOLITICA DEL PRODOTTO in tutti i compartimenti cellulari Aggregazione del prodotto ricombinante non correttamente strutturato a formare precipitati insolubili detti CORPI INCLUSI e possibili strategie applicabili per la loro risoluzione! INATTIVAZIONE GENETICA, mediante la costruzione di mutanti, dei geni che codificano per le PRINCIPALI ATTIVITA PROTEOLITICHE (in E. coli i mutanti ad attività proteasica nulla sono non vitali) VARIAZIONE delle CONDIZIONI DI CRESCITA dell ospite Costruzione di VARIANTI del PRODOTTO AD INCREMENTATA SOLUBILITÀ (es. proteine di fusione con carrier di solubilità all N-term come Trx) CO-ESPRESSIONE DI FOLDING FACTORS (sistema GroEL/S, Trx, sistema Dsb nel periplasma)

18 La modalità di produzione Quale processo fermentativo per il sistema di espressione allestito?? Il sistema di espressione allestito avrà successo industriale se potrà essere dimensionato dalla scala di laboratorio a quella industriale COLTURA in BATCH Ideale nei processi in cui la PRODUZIONE della proteina e INDOTTA (prom. regolato) in TARDA FASE ESPONENZIALE per evitare eventuali problemi di TOSSICITA COLTURA in FED-BATCH Ideale nei processi in cui la MASSIMA PRODUZIONE della proteina si ottiene se essa e INDOTTA in FASE ESPONENZIALE COLTURA in CONTINUO Metodo preferito quando l ESPRESSIONE del prodotto è COSTITUTIVA ed è indirizzata verso la SECREZIONE extracellulare. Può però dare PROBLEMI DI STABILITÀ GENETICA (cellule non producenti sono selezionate perché più vitali)

19 Facciamo un esempio: la produzione dell enzima di restrizione TaqI in E. coli ER isolato dal eubatterio termofilo Gram- Thermus aquaticus che riconosce la palindrome ds 5 -TCGA-3 applicazioni in tecniche di DNA ricombinante ed in Biotecnologie (diagnosi genetiche, mappaggio genico) La sua purificazione dal batterio termofilo presenta diversi problemi tecnici (scarsa resa del downstream, elevati costi operativi) Produzione ricombinante in cellule di E. coli Aspetti del processo oggetto di studio: indirizzamento verso diversi compartimenti cellulari costruzione del vettore di espressione ottimale applicazione di metodi avanzati per l ottimizzazione della composizione del terreno di coltura da utilizzare nella produzione ottimizzazione del processo!!!

20 Indirizzamento della produzione di TaqI in E. coli verso diversi compartimenti cellulari e costruzione del vettore ottimale TaqI come molti altri ER è tossico per l ospite in quanto riconosce ed idrolizza le sue sequenze target nel genoma! Produzione e secrezione periplasmatica Produzione citoplasmatica in presenza della TaqI metilasi MBP TaqI Chimera secreta ed attiva Bassa produttività Sistema di espressione più promettente!!

21 Modalità di produzione industriale dell enzima TaqI Crescita in fed-batch! T7 phage promoter in E. coli BL21 Induzione da IPTG 1 mm Induzione in media fase esponenziale per 15-17h tetr promoter costitutivo

22 Produzione dell antigene di superficie del virus dell epatite B Ospite: Pichia pastoris (lievito non convenzionale) Vettore: integrativo Promotore: inducibile (molto forte) Processo: batch/fed-batch I vettori di lievito sono dei vettori navetta, in grado cioè di essere stabilmente mantenuti sia in E. coli che in lievito

23 Produzione dell antigene di superficie del virus dell epatite B Il connubio vettore/promotore consente di ottenere produzioni elevate anche se integrato a singola copia!!!!

24 Produzione dell enzima rame/zinco SOD umana (superossido dismutasi) Ospite: Saccharomyces cerevisiae (lievito convenzionale) Vettore: replicativo (episomale) multicopia Promotore: costitutivo (molto forte) Processo: fed-batch o continuo Enzima impiegato nella terapia post infarto recupero dallo stress ossidativo Il prodotto si accumula nel citosol delle cellule ricombinanti (non tossico) ad elevate concentrazioni

Documenti analoghi

Inclusion bodies: : se li conosci li eviti

Alto livello di espressione + errata conformazione Inclusion bodies Inclusion bodies: : se li conosci li eviti La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura