CHIMICA BIOLOGICA. Seconda Università degli Studi di Napoli. DiSTABiF. Corso di Laurea in Scienze Biologiche. Insegnamento di. Anno Accademico

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1 Seconda Università degli Studi di Napoli DiSTABiF Prof. Antimo Di Maro Corso di Laurea in Scienze Biologiche Insegnamento di CHIMICA BIOLOGICA Anno Accademico Lezione 15

2 Catena di trasporto degli elettroni Fosforilazione ossidativa Sintesi di ATP

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4 Se consideriamo che un uomo consuma circa 2000 kcalorie al giorno.. e che ogni molecola di ATP da 7,3 kcal/mole 2000 kcal: 7,3kcal/moli = 273,97 moli pm del ATP = 507,18 g/moli 507,18 g/mol x 273,97 moli -> ,10 g!!!!! ,10 g -> 138,952 Kg!!!!! nel corpo umano 250 g

5 Fino ad adesso fosforilazione a livello del substrato; cioè molecole ad alta energia che trasferiscono il gruppo P al ADP occorre qualcos altro (qualsiasi sia la velocita delle reazioni alla base della fosforilazione al livello del substrato) Catena di trasporto degli elettroni Fosforilazione ossidativa

6 Nelle reazioni di ossido-riduzione vi è trasferimento di elettroni. Il potenziale redox è una misura del potenziale di trasferimento degli elettroni Richiamo di chimica-fisica: le celle elettrochimiche

7 Come si misura il potenziale di ossido-riduzione E? Cella con elemento da misurare Cella di riferimento con H + / H 2 Elemento cede elettroni al idrogeno, si forma H 2 se accetta si forma H +

8 DONATORE RIDOTTO - Più ricco di e - - mezzo riducente - più ricco di energia ACCETTORE OSSIDATO - meno ricco di e - - mezzo ossidante - meno ricco di energia DONATORE OSSIDATO - meno ricco di e - - mezzo ossidante - meno ricco di energia ACCETTORE RIDOTTO - più ricco di e - - mezzo riducente - più ricco di energia Succinato Fumarato + 2H e - FAD + 2H + + 2e - FADH 2 Ogni semi-reazione è caratterizzata da un potenziale di RIDUZIONE STANDARD E che si esprime in volt ed è calcolato a ph 7,0 e 25 C dei sistemi cellulari.

9 Gli elettroni fluiscono da potenziali di ossidoriduzione più negativi a quelli più positivi O 2 NADH + H + E Volt Gli elettroni fluiscono dalla semicella di riferimento a quella del campione Affinità per e - maggiore (>) di H 2 e quindi si ha un agente ossidante Gli elettroni fluiscono dalla semicella campione a quella di riferimento. Affinità per e - minore (<) di H 2 e quindi si ha un agente riducente.

10 Da negativo a positivo

11 Relazione importante Il potenziale standard di un elettrodo e l energia libera di Gibbs Sono legati dall equazione (equazione di Nerst) G= - nf E Dove G è l energia libera di Gibbs (in J/mol o kcal/mol) n è il numero di elettroni per mole di prodotto F è la costante di Faraday, pari a circa 23, 06 kcal /V -1 /ml -1

12 Si considerino le due semireazioni: E (V) a) NAD + + 2H + + 2e - NADH + H + - 0,32 (donatore) b) ½ O 2 + 2H + + 2e - H 2 O 0,82 (accettore) Reazione completa NADH + H + + ½ O 2 NAD + + H 2 O E = 1,14 [0,82- (-0,32)] G= - nf E G= -2 x 23,062 x 1,14 = -52,6 kcal/mol E = E accettore - E donatore

13 Fosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri Mitocondrio nei batteri

14 Le molecole coinvolte nel processo

15 I citocromi Proteine molto conservate (struttura/funzione) con gruppi eme con Fe +2/+3

16 I gruppi eme

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18 Citocromo c Proteina molto solubile presente nello spazio intermembrana dei mitocondri, a differenza degli altri citocromi presenti nella catena di trasporto. Il numero di residui è generalmente

19 Proteina solubile nello spazio inter-membrana

20 grano.. uomo.. intescambiabili Citocromo c

21 Coenzima Q (Ubichinone) ossidato ridotto Molecola liposolubile che si muove liberamente nella membrana mitocondriale

22 Centri Fe-S in proteine

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24 Struttura della FMN (Flavinmononucleotide) Manca del ribonucleotide rispetto al FAD

25 Visione d insieme Stroma

26 La catena di trasporto degli elettroni inizia da NADH e complesso I ed ha come accettore finale degli elettroni l O 2. In alternativa con il complesso II e FAD.

27 Potenziale di ossido-riduzione negativo Potenziale di ossido-riduzione positivo

28 Visione d insieme -2H +

29 Componenti proteici che fanno parte della catena di trasporto degli elettroni Complesso Subunità Massa (kda) Gruppo(i) prostetico(i) I II III IV NADH - ubichinone deidrogenasi Succinicoubichinone riduttasi Ubichinolocitocromo c riduttasi Citocromo c 43 (14)* Citocromo ossidasi 13 (3-4)* 160 FMN, Fe-S (22-24 in 5-8 centri) FAD, Fe-S (8 in 3 centri) Eme, Cit c 1, b H e b L Fe-S (2), Eme 2 eme (Cit a e a 3 ), Cu A, Cu B V Fo-F1 ATP sintasi (ATPasi) 9 > 500 (α, β,) 3, γ, δ, ε (F1) A, B e C (F0) *Fra parentesi i numeri di subunità dei complessi batterici

30 Provenienza dei coenzimi ridotti - Dalla glicolisi aerobica: spole malato-aspartato e diidrossiacetonefosfato (NADH/FADH 2 ) - Dalla piruvato deidrogenasi (NADH) - Dal ciclo di Krebs (NADH e FADH 2 ) - Dalla -ossidazione degli acidi grassi (NADH e FADH 2 )

31 Proteina Fe-S Lato negativo, N Complesso I NADH ubichinone deidrogenasi

32 Complesso II Succinicoubichinone riduttasi L eme b non partecipa al trasporto di elettroni. Esso è un fattore di protezione contro la formazione di specie reattive dell ossigeno (ROS, H 2 O 2,. O 2- ), da parte di e - che possono rendersi liberi.

33 Lato positivo, P Lato negativo, N

34 La via degli elettroni che arrivano dal NADH + H+ è differente, non implica la presenza del complesso 2! Ciclo del coenzima-q (da due e - a uno alla volta)

35 Complesso III: Ubichinolo-citocromo c riduttasi Complesso dei citocromi b e c 1

36 Il ciclo Q: regola il trasferimento degli elettroni da un trasportatore a due elettroni a trasportatori ad un elettrone (i citocromi). Fase 1 Fase 2

37 Il coenzima Q Ubichinone Ubichinolo

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39 Complesso IV della citocromo ossidasi: 13 subunità; 240 kda Cu A

40 Percorso degli elettroni Attraverso il complesso IV

41 Struttura tridimensionali note

42 Il cit c è Cit c solubile, fa da spola Visione d insieme guardando al movimento degli elettroni trasportati tramite FMN, ferro-zolfo proteine, ubiquinone e citocromi

43 I complessi per il trasporto di elettroni e per la formazione del gradiente elettrosmotico +4H + +4H + +4H + Stroma -2H +

44 Le specie reattive dell ossigeno Reazione di Fenton

45 Per avere un controllo dei ROS SOD, superossidodismutasi 2 O H+ O 2 + H 2 O 2 Catalasi 2 H 2 O 2 O H 2 O

46 Respirosoma Complessi I, III e IV È possibile purificare i complessi legati tra di loro

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48 La forza motrice protonica G

49 Modello chemiosmotico per la sintesi di ATP

50 Subunità 3 3 Subunità abc per F 0 c

51 Prima si pensava che bastasse il passaggio di H+ a far funzionare l ATPsintasi successivamente si è visto che c è un accoppiamento tra passaggio di protoni e variazioni conformazionali tra subunità ab.

52 Il complesso dell ATP sintasi mitocondriale. Struttura del complesso F1 F1 3 3

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54 La macchina rotante La forza motrice protonica provoca la rotazione di che viene in successione in contatto con ciascuna subunità ATP -vuoto con dissociazione di ATP ADP -ATP che promuove la condensazione di ADP e Pi Il sito vuoto assume la conformazione ADP e lega ADP e Pi provenienti dal solvente.

55 muovendosi favorisce i cambi conformazionali T= stato ad alta affinita L= stato a affinità debole O= stato aperto a bassa affinità In bianco la subunità alfa!

56 Altro schema della macchina rotante, con le sue tre differenti conformazioni: a bassa affinità, media e alta. T= stato ad alta affinita L= stato a affinità debole O= stato aperto a bassa affinità

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58 Meccanismo catalitico di F1

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61 Senza ossigeno si blocca

62 Figura al microscopio elettronico di F 0 / F 1

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64 Disaccoppianti chimici della fosforilazione ossidativa per lo studio del sistema

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66 Antimicia A Inibitori della respirazione mitocondriale Amytal (barbiturici) Cianuro, Azide e monossido di carbonio

67 Disaccoppianti: la valinomicina e la gramicidina A

68 Disaccoppianti chimici della fosforilazione ossidativa Dinitrofenolo

69 Disaccoppianti proteici, Per produrre calore, tessuto grasso bruno Termogenina o UCP

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71 Il mini lab costruito per produrre un gradiente elettronico e ATP

72 Come produrre sistemi in vitro