Tecnologia che permette in tempi brevi di rilevare in un campione biologico:

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3 Tecnologia che permette in tempi brevi di rilevare in un campione biologico: Organismi in bassissima carica Organismi a crescita lenta Organismi non coltivabili Organismi non vitali esame microscopico: ~ BAAR/mL esame colturale su terreno liquido: UFC/mL esame colturale su terreno solido: UFC/mL test Amplificazione Acidi Nucleici (NAA) : BAAR/mL

4 1995: approvazione Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test (MTD) - Gen-Probe - su campioni respiratori risultati positivi all esame microscopico 1996: approvazione Amplicor Mycobacterium Tuberculosis Test Roche - su campioni respiratori risultati positivi all esame microscopico 1999: approvazione Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test (MTD) - Gen-Probe anche su campioni respiratori risultati negativi all esame microscopico sistema MTD (Gen-Probe) Amplicor (Roche) Metodo TMA PCR bersaglio rrna rdna lettura chemiluminescenza colorimetria automazione assente lettura Licenza FDA si si

5 Si evidenzia che i test NAA: sono in grado di confermare la presenza di Myc. tuberculosis nel 50-80% di campioni risultati inizialmente negativi all esame microscopico ma positivi alla coltura sono in grado di determinare la presenza di Myc. tuberculosis settimane prima della positività della coltura valore predittivo positivo > 95% in campioni con esame microscopico positivo Raccomandazione di eseguire almeno un test NAA su un campione respiratorio in ogni paziente che presenti segni o sintomi di TB e la diagnosi di TB sia stata presa in considerazione ma non confermata. MMWR 2009; 58 (1): 7-10

6 MMWR 2009; 58 (1): 7-10

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8 La preparazione del campione richiede circa 15 minuti, il campione preparato è posto nella cartuccia MTB/RIF, e la cartuccia è inserita nel sistema GeneXpert Dx System. Il sistema sposta il campione e i reagenti in camere diverse della cartuccia, idrata i reagenti, sposta la miscela e avvia i cicli di PCR e la loro rilevazione in tempo reale.

9 Sono presenti 5 sonde specifiche per il gene rpob e una sonda come controllo interno. La fluorescenza che si sviluppa nella reazione di PCR è registrata in un grafico. Grafico 1: campione positivo per M. tuberculosis I ceppi di M. tuberculosis con resistenza alla Rifampicina hanno una sequenza del gene rpob mutata. La sonda corrispondente non si può legare: si avrà l assenza di una curva di fluorescenza. Grafico 2 : campione positivo per M. tuberculosis resistente a Rifampicina

10 GeneXpert MTB/RIF Metodo Bersaglio Controllo interno Rifampicina resistenza Validazione campione non respiratorio Campione originale Campione concentrato Automazione Tempo esecuzione Competenza biologia molecolare Addestramento personale Locali separati Flusso unidirezionale Contaminazione crociata Contaminazione ambiente PCR Real Time rpob si si no si si si < 2 ore no breve no no no no

11 identificazione più rapida rispetto a test biochimici si utilizzano microrganismi cresciuti sia su terreno solido che liquido prima fase: amplificazione del gene bersaglio seconda fase: ibridazione con sonde (PROBE) immobilizzate su membrana terza fase: rivelazione In commercio 4 sistemi di identificazione: AccuProbe ( Gen-Probe) GenoType Mycobacterium (Hain) INNOLiPA Mycobacteria (Innogenetics) GenoType Mycobacterium MTBC Hain)

12 AccuProbe BioMerieux GenoType Mycobacterium CM e AS(Hain) INNOLiPA (Innogenetics) GenoType MTBC (Hain) bersaglio rrna 16S rrna 23S Gene codificante per la regione spaziatrice tra rrna 16S e rrna 23S rrna 23S SNP del gene gir Regione RD1 reazione ibridazione in fase liquida ibridazione inversa ibridazione inversa ibridazione inversa rivelazione chemiluminescenza colorimetrica colorimetrica colorimetrica

13 AccuProbe Genotype Mycobacterium INNOLiPA Genotype MTBC M. avium M. chelonae M. immunogenicum M. tuberculosis M. abscessus M. africanum tipo I M. fortuitum M. bovis M. gordonae M. bovis BCG M. intracellulare M. microti M. scrofulaceum M. caprae M. interjectum M. kansasii M. malmoense M. marinum M. ulcerans M. tuberculosis complex M. peregrinum M. fortuitum M. xenopi M. simiae M. godii M. smegmatis M. genavense M. lentiflavum M. szulgai M. phlei M. asiaticum M. shimoidei M. haemophilum

14 test eseguibile su campione biologico diretto o su coltura sia solida che liquida prima fase: amplificazione del gene bersaglio seconda fase: ibridazione con sonde (PROBE) immobilizzate su membrana terza fase: rivelazione GenoType MTBDRplus (Hain) : riconoscimento ceppi MDR GenoType MTBDRsl (Hain) : riconoscimento ceppi XDR

15 Resistenza rifampicina Resistenza Isoniazide ad alto livello Resistenza Isoniazide a basso livello bersaglio reazione Gene rpob Gene KatG Gene inha ibridazione inversa ibridazione inversa ibridazione inversa rivelazione colorimetrica colorimetrica colorimetrica

16 Resistenza aminoglicosidi Resistenza etambutolo Resistenza chinolonici bersaglio reazione Gene rrs Gene embb Gene gyra ibridazione inversa ibridazione inversa ibridazione inversa rivelazione colorimetrica colorimetrica colorimetrica

17 si ottiene la sequenza corretta dei nucleotidi di una regione del DNA, cioè la struttura primaria i geni più utilizzati sono rrna 16S, hsp65, ITS,rpoB riduzione dei tempi richiesti per l identificazione miglioramento dell accuratezza di identificazione riconoscimento di numerose specie ( ~ 150) automazione mediante sequenziatori con elettroforesi capillare

18 estrazione del DNA da colonia o da coltura liquida amplificazione del gene di interesse mediante PCR purificazione del prodotto di PCR seconda amplificazione con utilizzo di una miscela che contiene oltre ai normali nucleotidi anche una quota di nucleotidi terminator ( didesossinucleotidi) che bloccano l allungamento della catena perché hanno un solo atomo di H al posto del gruppo OH 4 fluorocromi diversi, uno per ogni base azotata, marcano i nucleotidi terminator ddatp ddctp ddgtp ddttp il blocco dell allungamento avviene random, di conseguenza si formano frammenti di DNA di diversa lunghezza

19 I frammenti fluorescenti sono separati elettroforicamente in base alla lunghezza in un capillare di diametro di 50µm I frammenti marcati di DNA vengono rilevati man mano che correndo lungo il capillare raggiungono il laser si ottiene l elettroferogramma: un grafico dato dalla sequenza di picchi di 4 colori diversi che corrispondono alle emissioni fluorescenti dei diversi fluorocromi l elettroferogramma viene confrontato con le sequenze presenti in un data base on line

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21 PREMESSA il genoma di Myc. tuberculosis ha 41 loci con sequenze ripetitive (tandem repeat) ogni locus contiene un numero variabile di tandem repeat alcuni dei 41 loci sono ad alta variabilità CONSEGUENZA Ogni ceppo di Myc. tuberculosis ha un caratteristico polimorfismo determinato dal diverso numero di sequenze ripetitive in ogni locus

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23 estrazione del DNA da colonia o coltura liquida amplificazione dei geni di interesse con PCR (12 loci o 24 loci) Separazione elettroforetica su capillare elettroferogramma: il peso molecolare del singolo picco indica il numero di ripetizioni del gene esaminato Es. Spettro MIRU dopo corsa elettroforetica (nei quadratini sotto i picchi la S: indica il peso molecolare)

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26 eseguire test MIRU 12 loci su ogni ceppo di Myc. tuberculosis inviato al Centro Riferimento Regionale di Niguarda in caso di concordanza dei 12 loci verificare identicità genotipica con MIRU 24 loci creazione di un database con registrazione di tutte le identificazioni eseguite

27 monitoraggio continuo dei ceppi di M. tuberculosis presenti sul territorio identificazione in tempi brevi di eventuali ceppi con particolari pattern di resistenza o diffusibilità riconoscimento rapido di eventuali cluster epidemici

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29 Ringraziamenti Dr.ssa Fanti Diana responsabile Settore Biologia Molecolare Dr.ssa Drago Monica Dr.ssa Sironi Chiara Maria TSLB Barzaghi Antonella

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31 * Arthrob_sulfureus_B571\0_F8\1\1SLin * DSM 20167T\0_G4\1\1SLin, Smoothed, "Baseline subt." 0 Intens. [a.u.] Identificazione di micobatteri in spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) m/z Intens. [a.u.]

32 Simultaneous Identification of Mycobacterial Isolates and Determination of Tuberculosis Drug Resistance by PCR Followed by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

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