Università degli Studi di Pisa. Facoltà di Farmacia

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1 Università degli Studi di Pisa Facoltà di Farmacia Determinazione quantitativa di fenilbutazone e flunixin meglumina in plasma equino tramite un sensore elettrochimico accoppiato a estrazione in fase solida con polimeri a stampo molecolare di Francesca Gavarini Relatore Valentina Meucci A.A

2 INTRDUZINE FANS I farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) sono largamente utilizzati in medicina umana e veterinaria per la loro riconosciuta efficacia nel produrre effetti antinfiammatori, analgesici ed antipiretici. Per la maggior parte sono acidi deboli organici con una pka compresa tra 3 e 5 e, a ph fisiologico sono ionizzati e legati alle proteine (>98%). Le molecole appartenenti a questa classe di farmaci sono spesso classificate come di seguito riportato: Acidi carbossilici Derivati dell acido salicilico (salicilati): acido acetilsalicilico Derivati dell acido propionico: naprossene, carprofen, ketoprofene Acidi atranilici: acido tolfenamico Derivati dell acido acetico: eltenac, etodolac Acidi amino nicotinici: flunixin meglumina Acidi chinolinici Acidi enolici Pirazolonici: fenilbutazone, dipirone xicami: piroxicam, meloxicam Altri Derivati del paraminofenolo Sulfonanilidi: nimesulide Alcanoni 1

3 I FANS hanno un basso volume di distribuzione ma un alto grado di penetrazione nei tessuti infiammati e risultano biologicamente attivi solo quando non sono legati alle proteine plasmatiche. Questi farmaci sono lipofili e poco solubili in acqua per questo spesso sono formulati come sali sodici per uso parenterale. Possono essere somministrati per via orale, intramuscolare, endovenosa e rettale. Sono metabolizzati principalmente dal fegato dove subiscono ossidazioni, riduzioni, idrolisi e coniugazioni; che per la maggior parte di essi portano a metaboliti inattivi ad eccezione del fenilbutazone. L escrezione avviene principalmente per via renale e si ha una limitata filtrazione glomerulare a causa dell elevato legame con le proteine plasmatiche. Differenze come farmacocinetica, emivita, concentrazione di proteine plasmatiche, ritmo circadiano, funzionalità epatica e renale, interazione con altri farmaci influenzano l efficacia e la risposta individuale di tali farmaci (Moses e Bertone, 2002). I FANS sono molto diversi dal punto di vista chimico, ma risultano raggruppati nella stessa classe farmacologica perché presentano un medesimo meccanismo d azione (Zizzadoro e Belloli, 2009). I farmaci antinfiammatori non steroidei, diversamente dagli steroidei, sono sostanze che agiscono inibendo un componente della cascata dell acido arachidonico (Moses e Bertone, 2002), in particolare inibiscono la sintesi di prostaglandine e di trombossano attraverso il blocco delle ciclo-ossigenasi (CX) (Boothe, 1999). 2

4 1 Cascata dell' acido arachidonico. Attualmente è noto che esistono due forme di ciclo-ossigenasi: CX 1 e CX 2. La CX 1 rappresenta l isoforma costitutiva che si trova nella maggior parte delle cellule e dei tessuti. Essa è responsabile della sintesi di prostaglandine fondamentali per mantenere una corretta fisiologia ed è implicata in importanti ruoli fisiologici, quali ad esempio la citoprotezione gastrica, la funzione renale, la funzione piastrinica, la funzione riproduttiva, ecc. Il secondo enzima, la CX 2, rappresenta la forma inducibile, cioè è prodotto occasionalmente nelle cellule coinvolte nella risposta infiammatoria o immunitaria. Per tutti questi motivi un farmaco che inibisce solo le CX2, come i FANS di seconda generazione, dà minori effetti collaterali rispetto ad uno che esercita il proprio potere inibitorio su entrambe le isoforme. La maggior parte dei FANS alle dosi terapeutiche determina l inibizione di entrambe le ciclo-ossigenasi ed è quindi responsabile dell insorgenza di importanti effetti collaterali che si manifestano principalmente a carico del tratto gastrointestinale, del rene e delle piastrine (Zizzadoro e Belloli, 2009). Quindi i principali effetti terapeutici e tossici dei FANS sono attribuibili alla capacità di inibire la sintesi dei prostanoidi (Boothe, 1999). Esiste 3

5 infine un altra isoforma delle ciclo-ossigenasi di recente scoperta, chiamata CX 3. Questa è presente prevalentemente a livello del sistema nervoso centrale ed i farmaci che la inibiscono selettivamente non mostrano attività antinfiammatoria, ma soltanto analgesica ed antipiretica. FANS utilizzati nel cavallo I FANS impiegati comunemente nella pratica equina sono numerosi in particolare, fenilbutazone (PBZ), flunixin meglumina (FXN), aspirina, suxibuzone, acido meclofenamico, naprossene, carprofen, ketoprofene, vedaprofene, acido salicilico, eltenac. Di questi i maggiormente usati sono PBZ e FXN (Roberts, 2010), nonostante Beretta e collaboratori (2005) hanno trovato che nel cavallo, meloxicam e carprofen sono gli inibitori delle CX 2 più selettivi. steoartriti, coliche, lesioni dei tessuti molli, stati febbrili, trombi, endotossemie e infiammazioni di varia natura, sono le classiche situazioni in cui vengono somministrati FANS al cavallo, in particolare il PBZ ricorre più frequentemente per tali propositi. FXN è invece il più usato in caso di dolori gastrointestinali acuti o coliche, febbre e infiammazione dei tessuti molli. Inoltre FXN è il FANS più comunemente usato per il trattamento clinico dei sintomi di endotoxemia, sebbene vi siano diversi esperimenti che mostrano che anche altri FANS (per esempio PBZ) hanno proprietà antiendotossiche (Jackman et al, 1994; King e Gerring, 1989; Sigurdsson e Youssef, 1994). 4

6 Fenilbutazone (PBZ) PBZ è un derivato degli acidi enolici appartenente alla classe dei pirazoloni. Dopo metabolismo epatico, PBZ porta alla formazione dei suoi metaboliti di cui i principali sono ossifenbutazone, γ-idrossifenilbutazone e γ-chetofenilbutazone. H N N N N N N H 2 Struttura di ossifenbutazone, γ-idrossifenilbutazone e γ-chetofenilbutazone. Quest ultimo risulta essere il più abbondante metabolita ed anche l unico che mantiene attività, per tale motivo PBZ presenta una lunga durata d azione. Infatti l'emivita stimata nei fluidi infiammatori è circa 24 ore, mentre a livello plasmatico ha emivita variabile da 3 a 8 ore, in aumento con l'aumentare della dose (Kollias-Baker e Cox 2004). È più lunga in pony e cavalli anziani (Goodrich e Nixon 2006). Benché il PBZ abbia un margine di sicurezza relativamente ristretto, è ampiamente utilizzato in medicina veterinaria. È stato suggerito che la somministrazione del farmaco in continuo a 2.2 mg/kg due volte al giorno è sicuro ed efficace nella maggior parte dei cavalli normali 5

7 (Kollias-Baker e Cox 2004; Goodrich e Nixon 2006) e che il margine di sicurezza è drasticamente ridotto se questa dose viene superata. Goodrich e Nixon (2006) hanno suggerito una dose di attacco di PBZ 4,4 mg/kg due volte al giorno per due giorni, seguita da 2.2 mg/kg per due volte al giorno. Dosi più elevate possono aumentare la durata d'azione del farmaco, ma non la sua potenza. PBZ, tuttavia, è spesso utilizzato a dosi più elevati nel breve termine ad un tasso di dose orale di 4.4 mg/kg due volte al giorno per cinque giorni è stato scoperto avere un tempo di rilevamento di 168 ore (FEI, 2010c). Hu e collaboratori (2005) hanno dimostrato che il PBZ ha un effetto analgesico per almeno 24 ore se somministrato per via endovenosa a dosi di 4.4 o 8.8 mg/kg al giorno, ma senza alcun vantaggio in termini di effetto analgesico utilizzando la dose maggiore. N N 3 Struttura del fenilbutazone. 6

8 Flunixin Meglumina(FXN) FXN appartiene alla classe degli acidi carbossilici, in particolare è un acido amino nicotinico spesso utilizzato per il controllo del dolore nei cavalli con coliche, ma può anche essere utilizzato per il trattamento di patologie muscolo-scheletriche. FXN ha emivita più lunga nei liquidi infiammatori rispetto al plasma. Questo farmaco è relativamente sicuro, la tossicità nei cavalli sani è evidenziata solo a dosi significativamente superiori a quella raccomandata di 1.1 mg/kg una volta al giorno (Goodrich e Nixon 2006). Analogamente al PBZ, l'aumento della dose di FXN non provoca un aumento di efficacia, ma un aumento della sua durata d'azione. Quando somministrato alla dose di 1.0 mg/kg per via endovenosa, è risultato avere un tempo di rilevamento di 144 ore (FEI, 2010c). Alcuni medici hanno prescritto più FANS contemporaneamente nel cavallo e, ovviamente, la terapia combinata con PBZ e FXN insieme ha dimostrato di avere maggiore efficacia analgesica e antinfiammatoria che utilizzando PBZ da solo (Keegan et al, 2008). 7

9 NH H H N H H H H H CF 3 4 Struttura del flunixin meglumina. Nei casi di terapia combinata però non deve essere sottovalutato il possibile aumento di effetti avversi associati a tale trattamento. DPING IN CAVALLI DA CMPETIZINE Negli animali coinvolti in attività sportive sono richieste eccellenti capacità fisiche ed un istinto competitivo, caratteristiche normalmente acquisite grazie a programmi di allenamento ed alla riproduzione selettiva. Negli sport, gli atleti possono incrementare le loro performance fisiche e psichiche attraverso l uso di farmaci, allo stesso modo queste pratiche possono essere usate nel cavallo, alterando così l integrità delle competizioni. Le performance atletiche dei cavalli possono essere manipolate sia in senso positivo che in senso negativo, ad esempio attraverso la somministrazione di sedativi che decrementano le prestazioni dell animale; questo tipo di pratica può essere di interesse nelle gare in cui vengono fatte scommesse. Questa forma di doping può essere compiuta da individui che non sono collegati al cavallo ma che ne vogliono compromettere l andamento in gara. La somministrazione di farmaci a scopo terapeutico, invece non mira volontariamente ad incrementare le prestazioni del cavallo, bensì è utilizzata ai fini del benessere dell animale; ciò nonostante spesso è punita come doping. I FANS sono tra i farmaci più utilizzati nella clinica del cavallo sportivo il cui 8

10 uso può però configurare la pratica del doping quando la loro attività farmacologica viene dolosamente sfruttata per mascherare stati patologici del cavallo e portare alle competizioni animali che invece ne dovrebbero essere esclusi. A tal proposito esistono delle controversie per la compilazione dei regolamenti anti-doping. Il benessere dei cavalli da competizione, infatti, è regolamentato in molti paesi che hanno sottoscritto l Accordo Internazionale su Allevamento e Corse dei Cavalli, pubblicato dall IFHA (International Federation of Horserasing Autorities), il quale sostiene che i cavalli devono competere con le loro abilità naturali senza influenza alcuna di farmaci, tenendo conto anche di medicamenti che consentono di competere nel giorno della gara, come ad esempio l utilizzo di antidolorifici per mascherare il dolore. La gamma di sostanze proibite nelle corse è quindi ampia e coincide con quella delle sostanze proibite per l uomo pubblicata dall agenzia mondiale anti-doping (WADA, World Anti- Doping Agency). I cavalli competono in eventi sportivi dove l uso di farmaci e medicamenti sono regolati, questo viene fatto per garantire la parità tra i partecipanti, proteggere il bene degli animali e degli uomini che vi partecipano e salvaguardare il pubblico interesse dove sono implicate scommesse sportive. I regolamenti attuati possono variare in base all organo regolatore e al tipo di competizione. Molti regolamenti impongono la raccolta di campioni di urina o di sangue dei cavalli partecipanti alle competizioni per le analisi antidoping. Una violazione delle regole sul controllo antidoping può comportare multe, sospensioni e in alcuni casi l espulsione (Cole e Zientek, 2009). Federazione Equestre Internazionale (FEI) La FEI è l organismo di controllo riconosciuto dal comitato olimpico internazionale (CI). Essa stabilisce norme e regolamenti includendo quelli riguardanti l uso di 9