Le proteine. Sintetizzate nei ribosomi come una sequenza lineare di amminoacidi assumono in seguito una struttura tridimensionale

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1 Le proteine Elementi funzionali e strutturali di fondamentale importanza per lo svolgimento di funzioni metaboliche, di trasporto, di trasmissione nervosa o contrattile, ormonale o immunitaria Sintetizzate nei ribosomi come una sequenza lineare di amminoacidi assumono in seguito una struttura tridimensionale Tutte sono costituite dallo stesso gruppo di 20 amminoacidi uniti in sequenze lineari diverse

2 AMMINOACIDI Gli amminoacidi sono composti polifunzionali, infatti essi presentano sia un gruppo carbossilico, che conferisce loro caratteristiche acide, sia un gruppo amminico, che conferisce loro caratteristiche basiche; quindi gli amminoacidi sono in definitiva degli anfoliti. In natura, tutti gli amminoacidi sono a-amminoacidi, cioè il gruppo amminico è sempre legato al carbonio a (il carbonio a è il carbonio che viene dopo il gruppo carbossilico). R Struttura generale di un a-amminoacido : NH 2 C a COOH H Gli amminoacidi si distinguono in base alla diversità della catena laterale R in ciascuno di essi. Gli aminoacidi (AA) presenti nella cellula possono essere il prodotto di idrolisi delle proteine (aaa proteici o standard e aaa rari o non standard) o di peptidi o metaboliti liberi (AA non proteici). Gli a-amminoacidi hanno proprietà strutturali comuni

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4 A ph neutro gli amminoacidi sono prevalentemente in forma dipolare (anfoioni) : gruppo amminico protonato (-NH 3+ ) e gruppo carbossilico deprotonato (-COO - ).

5 Amminoacidi proteici

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8 Catene laterali non polari Formano interazioni idrofobiche Alanina Valina Leucina Isoleicina Glicina Metionina Prolina

9 Catene laterali aromatiche Sono relativamente non polari. Interazioni idrofobiche; Fenilalanina Tirosina Triptofano

10 Catene laterali polari non cariche I gruppi R sono molto più solubili in acqua rispetto a quelli degli aa non polari. I gruppi funzionali formano legami idrogeno con l acqua. Serina Treonina Cisteina Asparagina Glutamina

11 Catene laterali cariche positivamente (basiche) La catena laterale ha carica netta positiva a ph=7 Lisina Arginina Istidina

12 Catene laterali cariche negativamente La catena laterale ha carica netta negativa a ph=7 Si ottengono per idrolisi acida o basica dalle ammidi asparagina e glutammina Aspartato Glutammato

13 I gruppi SH idrofilici della cisteina formano un ponte disolfuro (non idrofilico), per formare la cistina (non polare). La cistina si forma secondariamente per ossidazione di due residui di cisteina (cistina=aa postsintetico).

14 La prolina è in realtà un imminoacido, contiene il gruppo imminico: -NH- (che è parte della struttura dell anello eterociclico pirrolidinico). Fase postsintetica delle proteine: i residui di alcuni aa possono essere modificati generando nuovi aa detti postsintetici o derivati (es.: cistina, idrossiprolina, idrossilisina, ac. Carbossiglutammico, fosfoserina, fosfotreonina, trimetillisina).

15 Amminoacidi non proteici Esistono aa che non si riscontrano nelle proteine: aa non proteici. Ornitina Citrullina

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17 Gli amminoacidi possono agire da acidi o basi deboli. Gli amminoacidi che non possiedono un gruppo R ionizzabile, in soluzione a ph neutro esistono sotto forma di ioni dipolari detti zwitterioni (elettricamente neutro). I composti che hanno questa natura sono detti anfoterici

18 L amminoacido zwitterione può comportarsi come acido (cedere protoni) o come base (accettare protoni)

19 Punto isoelettrico (pi): valore di ph in corrispondenza del quale l aa si trova in forma dipolare (anfoione) Quando cioè la carica negativa del gruppo carbossilico e la carica positiva del gruppo amminico si equivalgono e la carica netta è pari a zero

20 Altre classificazioni di amminoacidi AA acidi: glutammato e aspartato: AA monoamminodicarbossilici AA basici: arginina e lisina: AA diamminomonocarbossilici istidina (anello imidazolico) AA solforati: AA aromatici: cisteina e metionina fenilalanina, triptofano e tirosina

21 GLUTAMMATO MONOSODICO *(MSG) casa * aumenta il sapore dei cibi dadi ristorante GLUTAMMATO Amminoacido proteine Neurotrasmettitore (versatilità delle biomolecole, principio d i economia) Idrolizzati proteici vegetali (dadi) > 40% di MSG Sindrome da ristorante cinese (eccessivo uso di MGS) dai capogiri al mal di testa all affaticamento 2% popolazione umana Esempio di amminoacido estremamente sensibile evitare : questo condimento funghi piselli altri vegetali ricchi in MSG utile all organismo dannoso in quantità eccessiva

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23 STEREOISOMERIA NEGLI AMMINOACIDI Ad esclusione dell amminoacido GLICINA, che presenta come catena laterale R solo un atomo di idrogeno : H NH 2 C a COOH H tutti gli altri amminoacidi presentano, legati al carbonio in a, 4 sostituenti diversi e il carbonio in a è quindi un carbonio chirale (carbonio asimmetrico), Poichè la disposizione degli orbitali di legame intorno al Ca è tetraedrico i 4 gruppi sostituenti possono disporsi nello spazio in 2 modi diversi e quindi gli AA presentano 2 possibili stereoisomeri. Questi stereoisomeri sono immagini speculari non sovrapponibili = enantiomeri Secondo la proiezione di Fisher possiamo distinguere una serie sterica D e una serie sterica L. COOH COOH H C NH 2 NH 2 C H R R FORMA D FORMA L Tutti gli amminoacidi incorporati dagli organismi nelle proteine sono nella forma L.

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26 SPETTRI DI ASSORBIMENTO DEGLI AMMINOACIDI Gli amminoacidi non assorbono nel visibile Tutti gli amminoacidi assorbono nell estremo U.V. < 220 nm a causa del doppio legame del gruppo COOH Tre amminoacidi assorbono nell U.V. intorno a 280 nm; Trp BANDA DEL TRIPTOFANO Tyr Phe Queste caratteristiche si riflettono nelle proteine che possono essere dosate attraverso lettura spettrofotometrica a 280 nm.

27 (A) LEGGE DI LAMBERT BEER Legge valida solo ad A = A max A λ max = ε c l l = percorso ottico ε = coefficiente di estinzione molare c = concentrazione sostanza in esame A = log I 0 / I t I 0 = intensità luce incidente nell U.V. (A max ) I = intensità luce t trasmessa da: Nelson & Cox

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30 L unico Aminoacido che può funzionare da tampone è l istidina

31 Un semplice amminoacido mono amino-monocarbossilico, come la GLICINA, è di fatto un acido diprotico quando è completamente protonato, in questa forma ha, cioè, due gruppi che possono ionizzarsi per dare protoni. La CURVA DI TITOLAZIONE DELLA GLICINA presenta due distinti stadi, corrispondenti ciascuno alla rimozione di un protone. all inizio della titolazione la Glicina è nella forma completamente protonata al punto di flesso della I a sigmoide sono presenti quantità equimolecolari di COO - e COOH; questo ph è il pk del gruppo che viene titolato. (pk 1 = 2.34) a ph = 5.97 è completa la titolazione del primo gruppo e si inizia a rimuovere il secondo protone. La forma prevalente è NH 3 -CHR-COO - al punto di flesso della II a parte si avrà quantità equimolecolare di NH 3+ e NH 2. Questo ph è il pk del gruppo NH 3+ (pk 2 = 9.60) la titolazione è completa quando la forma predominante diventerà NH 2 -CHR-COO - (completamente deprotonata) da: Nelson & Cox

32 da: Nelson & Cox

33 da: Nelson & Cox

34 La curva di titolazione predice la carica elettrica degli AA A ph = 5.97 la forma prevalente è lo ZWITTERIONE (cioè senza carica netta). Questo ph è detto PUNTO ISOELETTRICO (pi) ed è dato dalla media aritmetica dei due valori di pk (nel caso di amminoacidi privi di gruppi R dissociabili). Es. Glicina pi = / 2 = 5.97 pi = pk 1 + pk 2 2 a ph = pi di un amminoacido 1. carica netta = 0 2. non si muove in un campo elettrico 3. presenta la minima solubilità a ph > pi la carica netta della Glicina sarà -, pertanto si muoverà verso il polo + a ph < pi la carica netta della Glicina sarà +, pertanto si muoverà verso il polo a ph = 1 la Glicina sarà completamente protonata con carica netta + = 1 a ph = 2.34 dove [NH 3 + -CHR-COOH] = [NH 3 + -CHR-COO - ], la Glicina avrà carica netta + = 0.5 così per tutti i valori di ph si può calcolare la frazione di carica netta posseduta dall amminoacido. Importante per la separazione elettroforetica.

35 VALORI DI pk A DI ALCUNI AMMINOACIDI E LORO pi AMMINOACIDI PK 1 -COOH PK 2 -NH 3 PK R PI Glicina Alanina Leucina Serina Treonina Glutamina a. aspartico a. glutammico Istidina Cisteina Tirosina Lisina Arginina nessun amminoacido mono amino mono carbossilico ha capacità tamponante nelle zone di ph fisiologico (7.4) da 6.0 a 8.0 tranne l ISTIDINA il cui pk R è = 6. E un amminoacido raro ma molto importante (per es. in Hb e nel sito attivo degli enzimi) il pi degli amminoacidi acidi è uguale a pk 1 + pk R 2 il pi degli amminoacidi basici è uguale a pk 2 + pk R 2

36 GENERALITA sulle proprietà acido-basiche degli AA il pi degli amminoacidi neutri non è esattamente 7 (come ci si aspetterebbe se COOH e NH 2 avessero la stessa forza), ma COOH come acido è un pò più forte di NH 2 come base il gruppo α COOH è un acido più forte di altri gruppi carbossilici (es. acido acetico ha il pk = 4.76). Ciò è dovuto alla repulsione che si instaura tra i protoni che vengono liberati e la carica positiva del gruppo α aminico (con le sue cariche + stabilizza la carica del COO - dissociato) il pka del gruppo aminico della Glicina viene modificato verso il basso rispetto ai valori medi di un gruppo aminico primario: ciò è dovuto alla forza di attrazione degli atomi elettronegativi dell ossigeno del -COOH, aumentando contemporaneamente la tendenza del gruppo NH 3 a cedere un H + tutti gli amminoacidi mono amino mono carbossilici con gruppi R privi di carica hanno valori di pk 1 quasi uguali ( ) così per i valori di pk 2 (8.8-11). Le curve di titolazione sono simili a quelle della Glicina il gruppo - carbossilico dall a. aspartico e il - carbossilico dell a. glutammico sebbene completamente ionizzati a ph 7 hanno valori di pk molto più alti dei gruppi α COOH, cioè molto più simili a quelli degli acidi carbossilici semplici come a. acetico il gruppo SH delle cisteine e il gruppo OH della tirosina sono debolissimi acidi. A ph 7 SH è ionizzato all 8%, mentre l -OH è ionizzato all 0.01% Queste considerazioni sono importanti per spiegare, per esempio, il meccanismo di catalisi nel sito attivo degli enzimi.

37 Metodi per l analisi qualitativa e quantitativa degli AA 1. SEPARAZIONE e ANALISI QUALITATIVA degli AA Tecniche basate sulle proprietà di adsorbimento e miscibilità (o ripartizione) 1. cromatografia su carta 2. su strato sottile (TLC) 3. liquida ad alta pressione (HPLC) Principi in base ai quali operano le suddette tecniche: 1. principio di ripartizione 2. di ripartizione o di adsorbimento 3. di ripartizione o di adsorbimento (sc. ionico) Tecniche basate sulle proprietà di carica 1. elettroforesi su carta 2. cromatografia a scambio ionico 2. ANALISI QUANTITATIVA Analisi spettrofotometrica per tirosina, triptofano fenilalanina 1. colorimetrica (ninidrina fino a 1 mmole) 2. fluorimetrica (fluorescamina fino a 1 pmoli) (cloruro di dansile fino a 1 pmoli)

38 Analisi degli amminoacidi Reazione con la ninidrina per l analisi quantitativa colorimetrica degli amminoacidi La reazione con la ninidrina distrugge la molecola degli amminoacidi. Il composto colorato si sviluppa dopo esposizione degli amminoacidi a 100 C. La prolina, che è un imminoacido dà un composto giallo ( max = 440 nm). Sensibilità: micromole (10-6moli ); mg

39 Gli aminoacidi sono legati da un legame amidico Gruppo carbossilico attivato da: Nelson & Cox Nella cellula ha luogo grazie al macchinario di sintesi proteica.

40 Il legame peptidico è rigido e planare

41 L ossigeno carbonilico ha una parziale carica negativa e l azoto amidico una parziale carica positiva, formando un dipolo elettrico. Praticamente tutti i legami peptidici nelle proteine si formano in configurazione trans, favorita date le minori interazioni steriche

42 I legami C-N a causa del loro parziale carattere di doppio legame non possono ruotare liberamente. È invece permessa la rotazione dei legami N-Ca e Ca-C La rigidità del legame peptidico limita notevolmente il numero di conformazioni che una catena polipeptidica può assumere

43 PEPTIDI E PROTEINE Quando un amminoacido si lega con il suo gruppo a-carbossilico al gruppo a-amminico di un altro amminoacido si forma un legame peptidico con eliminazione di una molecola d acqua. 2 amminoacidi dipeptide 3 amminoacidi tripeptide 4 amminoacidi tetrapeptide e così via. Sono chiamati oligopeptidi le catene formate da pochi (10-20) residui amminoacidici. Un polipeptide è formato invece da residui amminoacidici. Una catena formata dall unione di molti amminoacidi (più di 100) prende il nome di proteina. I polipeptidi, e i peptidi in genere, presentano ad una estremità della catena un gruppo amminico libero (estremità amminoterminale o N-terminale) che identifica l inizio della catena, e all altra estremità un gruppo carbossilico libero (estremità carbossiterminale o C-terminale) che identifica la fine della catena.

44 I peptidi sono polimeri costituiti da 2 a 11 amminoacidi. Catene più lunghe sono denominate polipeptidi o proteine. Dal p.d.v. funzionale si distinguono in base alla sequenza degli AA: ROMA RAMO: stesse lettere, diversa sequenza, diverso significato Es. polipeptidi secreti del pancreas ad azione antagonista: Glucagone 29 AA Insulina AA (una proteina con 2 catene polipeptidiche)

45 Nel peptidi distinguiamo una catena principale, o scheletro, dovuta ai gruppi amminici e carbossilici legati al Ca che si ripetono in sequenza e una parte variabile costituita dalle catene laterali di ciascun amminoacido. Ogni amminoacido che fa parte di un peptide è chiamato residuo da: Nelson & Cox Ogni catena peptidica presenta 2 estremità differenti = i peptidi sono polimeri polari

46 PROPRIETA DEI PEPTIDI CHIMICHE L NH 2 terminale e COOH terminale dei peptidi danno le stesse reazioni caratteristiche degli a-ammino e a-carbossi gruppi degli AA. Caratteristica dei peptidi reazione del BIURETO (N.B. :AA ninidrina)

47 Classificazione e caratteristiche dei peptidi I peptidi possono essere di origine proteica (prodotti dalla idrolisi enzimatica o chimica delle proteine) o essere presenti come tali nella cellula con uno specifico ruolo biologico (peptidi di origine non proteica) I peptidi di origine non proteica biologicamente attivi hanno in genere una struttura diversa da quelli che derivano dalla idrolisi delle proteine: D-AA, -AA, legami -peptidici, possono essere ciclici. Queste caratteristiche li proteggono dalle proteasi. I peptidi di origine non proteica sono sintetizzati da un complesso di enzimi diversi dal macchinario della sintesi proteica (ribosomi, ecc.).

48 Bradichinina (antinfiammatorio) Ossitocina TRH peptidi oppiacei; Met-encefaline (analgesici endogeni) Leuencefaline GRAMICIDINA S (antibiotico)

49 Vasopressina e Ossitocina sono un esempio di relazione fra struttura e funzione: sono entrambi nonapeptidi ; differiscono solo per 2 amminoacidi.

50 . La Vasopressina, detta anche ormone antidiuretico (ADH), è un nonapeptide modificato prodotto dalla ghiandola pituitaria: stimola il riassorbimento dell acqua nei reni (azione antidiuretica) e la contrazione del muscolo liscio. Quest ultima attività contribuisce alla regolazione della pressione sanguigna. E un neuropeptide: influenza anche il sistema nervoso centrale.

51 (Arg) (Phe) L Ossitocina è l ormone pituitario che stimola la lattazione e la contrazione dei muscoli dell utero nelle donne in gravidanza. E un neuropeptide: influenza anche il sistema nervoso centrale.

52 Oltre che la funzione, il cambiamento di 1 o pochi amminoacidi può avere sui peptidi effetti drastici su: carica netta, solubilità, stabilità, reattività, legami a recettori