LA FECONDAZIONE 2) 3) Si attua in 4 fasi: Avvicinamento dei gameti Penetrazione delle barriere dell uovo Reazioni dell uovo Unione dei cromosomi

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1 LA FECONDAZIONE 1) 2) 3) 4) Si attua in 4 fasi: Avvicinamento dei gameti Penetrazione delle barriere dell uovo Reazioni dell uovo Unione dei cromosomi

2 Trasporto nelle vie spermatiche Le vie spermatiche sono i canali che vanno dai tubuli seminiferi all uretra Maturazione degli spermatozoi nell epididi- mo (è un canale lungo circa 7 metri) gli spermatozoi vi risiedono per circa 1-2 settimane e 1. acquistano la capacità di muoversi e di fecondare l uovo. 2. sono ricoperti da glicoproteine protettive. 3. Il fluido tubulare (prodotto soprattutto dalle cellule del Sertoli) e gli spermatozoi, che passano da 50 mln/ml a 5 mld/ml) ne escono concentrati circa 100 vescica volte. dotto eiaculatorio 4. La composizione del fluido seminale è determinata uretra dalle vescichette seminali (per il 60%), dalla prostata (30%) e dalle ghiandole bulbo-uretrali o di Cowper. epididimo pene In un campione di seme umano di 2-4 ml sono contenuti dai 200 ai 400 mln di spermatozoi (conc. minima=20 mln/ml) vitali per il % vescichetta seminale prostata dotto deferente testicolo

3 60% 30% Vie genitali maschili e ghiandole accessorie

4 Epitelio pseudostratificato con stereociglia (epididimo di ratto). Ematossilina-Eosina.

5 Epididimo 3 funzioni principali Maturazione degli spermatozoi (2-12 gg) Conservazione degli spermatozoi fino alla eiacualzione Trasporto peristaltico lungo il canale dell epididimo

6 Trasporto nelle vie genitali femminili Diagramma dell apparato genitale femminile e del percorso che gli spermatozoi devono compiere per raggiungere l ovocita (30-40 cm)

7 Spermatozoi che stanno uscendo dal coagulo formatosi nella vagina. Gli enzimi coagulanti sono prodotti nella prostata e reagiscono al ph acido vaginale con substrati prodotti nelle vescichette seminali, tra cui la seminogelina1. Questa glicoproteina è presente solo nell uomo e nei primati più evoluti e sembra avere anche altre funzioni sul liquido seminale.

8 Spermatozoi che stanno uscendo dal coagulo formatosi nella vagina. Dopo min il coagulo si fluidifica ad opera del PSA, antigene prostatico-specifico, una proteasi secreta dalla prostata come proenzima inattivo. La PSA è una glicoproteina specifica delle sole cellule epiteliali della prostata dove assume il ruolo di marker nel cancro prostatico.

9 Trasporto nelle vie genitali femminili Dalla vagina al collo dell utero (cervice uterina): solo l 1% degli spermatozoi sopravvive; Una volta superato l ostacolo, essi risalgono l utero e si dirigono preferenzialmente nella tuba che contiene l ovocita. La propulsione è data dal flagello e dalle correnti ciliari dell ovidutto.

10 Trasporto nelle vie femminili Spermatozoi prelevati dal liquido seminale non sono capaci di fecondare. Probabilmente nell epididimo, gli spermatozoi sono ricoperti da glicoproteine protettive che mascherano gli antigeni di superficie della membrana plasmatica impedendo l agglutinazione, la reazione acrosomiale prematura e la spermofagia ma anche la fecondazione. CAPACITAZIONE Tale rivestimento scompare progressivamente solo se lo spermatozoo passa nelle vie genitali femminili (cervice uterina, utero ed ovidotti) o in soluzioni saline (se trattato in vitro).

11 L attivazione degli spermatozoi 1. L acrosoma si rigonfia ed avviene la reazione acrosomale (vedi figura successiva) 2. Moti irregolari della coda dello spermatozoo. 3. La membrana plasmatica della testa dello spermatozoo diventa capace di fondersi con la membrana dell uovo. L attivazione avviene in prossimità dell uovo e le cause dell attivazione sono ancora da chiarire.

12 La reazione acrosomale. In presenza di Ca++ e in vicinanza dell uovo, l acrosoma si rigonfia, la membrana plasmatica si fonde con la membrana acrosomale esterna e gli enzimi dell acrosoma sono riversati all esterno. Quelli legati (ad es.: l acrosina) alla parete interna della m. acrosomale saranno utilizzati per attraversare la zona pellucida.

13 Lo spermatozoo deve superare 3 barriere: La corona radiata La zona pellucida La membrana vitellina Le barriere dell uovo (6-7 µm di spessore)

14 Penetrazione dello spermatozoo nell uovo (circa min) 1. corona radiata: Ialuronidasi + enzima di penetrazione della corona; 2. zona pellucida: Attacco ai recettori ZP3 della zona pellucida ed attivazione della pro-acrosina in acrosina 3. La membrana vitellina: Fusione tra le membrane plasmatiche dello spermatozoo e dell uovo. Il nucleo ed un centriolo entrano nel citoplasma

15 Le fasi del legame e di adesione dello spermatozoo alla zona pellucida e all ovolemma ZP3

16 Lo spermatozoo viene a contatto con l ovocito disponendosi tangenzialmente rispetto ad esso. La fusione interessa dapprima la regione equatoriale della testa dello spermatozoo (dove è ancora presente la sua membrana plasmatica) per poi spostarsi all indietro. La parte anteriore della testa, rivestita della sola membrana acrosomiale interna, viene invece fagocitata da estroflessioni citoplasmatiche dell ovocito. Si realizza così la fecondazione con l ingresso del nucleo maschile, del centriolo prossimale, dei mitocondri e di parte del flagello di cui solo i primi due componenti restano attivi e funzionali nello zigote (così si chiama l uovo fecondato).

17 Fotografia di spermatozoi umani attorno all ovocita

18 Fotografia al MES di uno spermatozoo che ha iniziato ad entrare nell uovo.

19 Fusione tra spermatozoo e cellula uovo E un passaggio cruciale per la riproduzione sessuale, i cui dettagli molecolari finora erano sfuggiti alla comprensione dei biologi. Un nuovo studio pubblicato su Current Biology dai ricercatori del Karolinska Institut di Stoccolma, in Svezia, guidati da Luca Jovine, ha ricostruito la struttura tridimensionale di Juno, una proteina che riveste un ruolo essenziale nella fecondazione dei mammiferi. Questo processo è infatti preceduto dal legame tra Juno e la proteina Izumo1, presente sulla superficie degli spermatozoi. Han L, Nishimura K, Sadat Al Hosseini H, Bianchi E, Wright GJ, Jovine L. Divergent evolution of vitamin B9 binding underlies Juno-mediated adhesion of mammalian gametes. Curr Biol Feb 8;26(3):R doi: /j.cub PubMed PMID: ;

20 Il ruolo di Juno Juno è un recettore proteico della famiglia dei recettori per l'acido folico (vitamina B9) anche se è incapace di legarsi a quella vitamina. Juno si trova sulla membrana della cellula uovo e si lega a un'altra proteina, Izumo1, presente sulla superficie dello spermatozoo. La interazione di Juno con Izumo1 media il legame tra le membrane dei gameti. Topi mancanti di una delle due non sono fertili perché non può avvenire la fusione tra i due gameti. Dopo la prima fase della fecondazione, si verifica un repentina diminuzione di Juno dalla superficie dell ovocito che diviene completa dopo 40 minuti circa. Invece, se l uovo viene fecondato mediante iniezione intracitoplasmatica di uno spermatozoo, Juno non diminuisce. Ciò suggerisce un ruolo di Juno nel prevenire la polispermia.

21 I mitocondri sono ereditati per linea materna Il genoma mitocondriale è indipendente da quello nucleare racchiuso nei cromosomi. Recentemente (2012) è stato sequenziato da Ernesto Picardi e Graziano Pesole, rispettivamente ricercatore e direttore dell'istituto di biomembrane e bioenergetica del Consiglio nazionale delle ricerche (Ibbe-Cnr) e docenti di Biologia molecolare del dipartimento di Bioscienze, biotecnologie e scienze farmacologiche dell'universita' di Bari. Il Dna mitocondriale dà un suo contributo nella patogenesi di molte malattie genetiche. Quello dei mitocondri costituisce circa il 2% del DNA cellulare e assolve funzioni di importanza vitale. Mutazioni del genoma mitocondriale sono responsabili di malattie gravissime che compromettono la funzionalita' del sistema muscolare e nervoso o che sono associate a processi di invecchiamento e tumorigenesi. Le malattie cosiddette mitocondriali, come la sindrome di Leigh, di Kearns-Sayre, di Pearson o diverse encefalopatie e neuropatie, hanno un'incidenza media di 1/4000, colpiscono soprattutto bambini e si distinguono per il fatto che, come il DNA mitocondriale, sono ereditate esclusivamente per via materna. Per approfondimenti:

22 Le reazioni dell uovo Dopo l entrata dello spermatozoo, l uovo fecondato (zigote) deve: Impedire l ingresso di altri spermatozoi (polispermia) con la reazione corticale e con la reazione della zona (perdita dei recettori ZP3), eventi che si completano pochi minuti dopo la fecondazione Compiere la seconda divisione meiotica ed espellere il secondo globulo polare (entro circa 4 h dopo la fecondazione). Attivazione dell uovo: liberazione del Ca++ dai depositi citoplasm. brusco aumento del metabolismo respiratorio preparazione alla prima mitosi formazione del fuso

23 Attivazione dell uovo Dopo la fusione si ha un ingresso di ioni Na+ che determina un cambiamento nella polarità della membrana (ne consegue il blocco rapido della polispermìa).

24 Lo spermatozoo introduce una fosfolipasi specifica (plc-zeta) in grado di scatenare le oscillazioni della concentrazione del Ca++ nell uovo. *Contengono proteasi che modificano la conformazione di ZP2 e rimuovono carboidrati da ZP3 La mobilizzazione di ioni Ca++ dopo la fecondazione induce la reazione corticale: i granuli corticali* (prodotti durante la fase preovulatoria e contenenti enzimi digestivi) sono esocitati nello spazio perivitellino. Alla reazione corticale segue la reazione della zona, per cui nella zona pellucida si modificano i recettori ZP2 e ZP3

25 Con la reazione corticale, i granuli corticali (prodotti durante la fase preovulatoria) sono esocitati formando lo spazio perivitellino. Con la reazione della zona, la zona pellucida perde i recettori ZP3

26 La fecondazione avviene nella ampolla della tuba uterina entro ore dalla ovulazione.

27 L'enzima che blocca la polispermia Udx1 genera perossido di idrogeno e impedisce l'accesso agli spermatozoi Una cellula uovo (oocita) può essere circondata da innumerevoli spermatozoi contemporaneamente, eppure a uno soltanto è consentito di fecondarla. In effetti, un oocita deve subire una rapida e complessa serie di cambiamenti per impedire l'ingresso di più di uno spermatozoo, un fenomeno dannoso per il normale sviluppo chiamato polispermia. Uno studio pubblicato sul numero di dicembre 2004 della rivista "Developmental Cell" fornisce interessanti informazioni sulla scoperta di un enzima che consente a un oocita di bloccare fisicamente l'ingresso di ulteriori spermatozoi dopo la fecondazione. Impedire la polispermia nei ricci di mare e in molti altri animali richiede una drammatica trasformazione che comprende uno scatto respiratorio caratterizzato dalla massiccia produzione di perossido di idrogeno vicino alla superficie dell'uovo. Nonostante questo fenomeno fosse stato descritto già oltre 100 anni or sono, il meccanismo responsabile della generazione di perossido dopo la fecondazione non è ancora del tutto chiaro. Gary M. Wessel e colleghi della Brown University di Providence hanno scoperto nei ricci di mare un enzima, differente da quelli usati dai globuli bianchi del sangue, coinvolto specificatamente nella generazione di perossido di idrogeno al momento della fecondazione. L'enzima, chiamato Udx1 (urchin dual oxidase 1), agisce insieme ad altri componenti cellulari per produrre perossido che consente all'oocita di trasformare la sua parte esterna in una barriera contro altri spermatozoi. Julian Wong, Robbert Créton, Gary M. Wessel, The Oxidative Burst at Fertilization Is Dependent upon Activation of the Dual Oxidase Udx1. Developmental Cell, Vol. 7, No. 6 (dicembre 2004).

28 La metafase della 2^ divisione meiotica viene riattivata 2-3 ore dopo la fecondazione, per terminare 2-3 ore dopo. I cromosomi dell uovo e dello spermatozoo sono liberi nel citoplasma e vengono circondati da due distinte membrane nucleari formando i pronuclei dello zigote. LA FECONDAZIONE Questi, in ore, migrano verso il centro e duplicano i cromosomi Successivamente le membrane dei pronuclei si rompono ed i cromosomi si dispongono in piastra metafasica per la prima mitosi, completata in ore dopo la fecondazione.

29 Fecondazione assistita LA FECONDAZIONE LA FECONDAZIONE LA FECONDAZIONE

30 LA FECONDAZIONE