GENOMICA. = conoscenza del DNA. Creazione banche banchedati datidel del DNA. Conoscenza di difenomeni biologici

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1 GENOMICA = conoscenza del DNA Conoscenza di difenomeni biologici Creazione banche banchedati datidel del DNA DNA Prevenzione e cura curadi dimalattie (screening del (screening DNA del per DNA malattie per genetiche, malattie produzione genetiche, test produzione genetici test per genetici per diagnosi,, etc) diagnosi, etc)

2 GENOMICA Analisi della sequenza di interi genomi Genomica comparativa (somiglianze genetiche (somiglianze tra genetiche specie) tra specie) Genomica funzionale (funzione dei (funzione geni) dei geni) Progetto Genoma Umano Umano

3 RIDURRE LA COMPLESSITA! Librerie (o banche) genomiche Librerie (o banche) cromosomiche

4 CGGCATTTGCGTATTCGGCC TAGCTACTCGTACCCCTGAT AGGTGTGCATTTAGGGCACT GCAGGGCCTCGGCAATCCGC CCCGGTGTGAATAAATCGTA

5 INGEGNERIA GENETICA Insieme di tecnologie e strumenti molecolari per lo studio e la manipolazione del DNA finalizzate: 1) a risolvere la sua complessità 2) al suo clonaggio 3) alla sua collezione in biblioteche molecolari

6 STRUMENTI DELL INGEGNERIA GENETICA ENZIMI DI RESTRIZIONE : consentono di tagliare il DNA in punti specifici,, in modo da separare il tratto di DNA desiderato, di legarlo al vettore prescelto, o modificarlo in vitro, in modo conveniente alle proprie necessità. VETTORI: : consentono l ingresso del gene scelto nella cellula ospite, provvedono alla replicazione del DNA eterologo ed alla sua espressione. ssione. ORGANISMI OSPITI: : batteri, cellule animali e vegetali, lieviti. Sono dotati di caratteristiche genetiche o biochimiche altamente specifiche che li rendono più o meno adatti a determinate applicazioni pratiche o ad ospitare vettori. Consentono di amplificare la sequenza di DNA clonata nel vettore.

7 Studiare il Genoma Tagliare il DNA in punti specifici (enzimi di restrizione) Localizzare specifiche sequenze di DNA (Southern blotting e FISH) Amplificare una sequenza di DNA generando quantità manipolabili (PCR PCR e applicazioni) Mutare e/o unire frammenti di DNA per produrre sequenze desiderate (mutagenesi e clonaggio genico) Trasferire nuove sequenze di DNA in cellule riceventi e selezione di cloni positivi Costruzione di biblioteche molecolari (genoteche o libraries)

8 TAGLIARE IL DNA

9 1 2 Digestionevettorecon lo stesso enzima di restrizione 3 Ligazione Sau3A 5 -GGATCC-3 3 -CCTAGG-5 5 -G 5 -GATCC-3 3 -CCTAG-5 G-5

10 OSSERVARE I FRAMMENTI DI DNA

11 L elettroforesi su gel permette di separare i frammenti di DNA in base alle dimensioni

12 1-Il DNA, insieme ad un colorante che permette di seguirne la corsa, si carica sul gel di agarosio 3- Il DNA si può osservare grazie alla presenza nel gel di bromuro di etidio, un intercalante in grado di emettere fluorescenza quando eccitato da raggi UV (emessi da un trans-illuminatore) 2- L apparato di elettroforesi si collega ad un alimentatore e si applica una corrente elettrica che permette la migrazione del DNA verso il polo positivo (elettrodo rosso in figura)

13 L elettroforesi su gel consente di separare molecole di DNA di dimensioni diverse

14 Pst1 AatII Frammenti attesi dalla digestione con i seguentienzimidirestrizione: Pst1 2840bp 0 AatII 900bp e 1940bp (2840bp) XhoI XhoI 2840bp E dadoppiedigestioni? AatII Pst1+XhoI AatII+XhoI 700bp e 2140bp 500bp, 400bp e 1940bp

15 Costruzione di una mappa di restrizione in un frammento di DNA

16 M ctr E B E/B 5 4, ,5 2 0,5 0,5

17 Digestione di molecole di DNA relativamente piccole Digestione di DNA genomico Come identificare la banda di interesse?

18 LOCALIZZARE I FRAMMENTI DI DNA

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20 Una sonda è una sequenza di DNA o RNA (a singolo o doppio filamento), complementare ad un DNA o RNA di interesse. L ibridazione tra la sequenza target e la sonda può essere rivelata attraverso la radioattività (sonda marcata con isotopi radioattivi) o la fluorescenza (sonda marcata con un fluoroforo). + Denaturazione Ibridazione

21 Denaturazione (A) e rinaturazione (B) del DNA (A) (B) La denaturazione a C, seguita dal raffreddamento, permette rinaturazione delle molecole del DNA omologhe la La rinaturazione tra molecole di DNA con totale omologia avviene a temperature più alte (alta specificità) rispetto a quelle con omologia parziale (bassa specificità)

22 Una sonda di DNA (omologa o eterologa) può essere: 1- un cdna parziale o full-length 2- un oligonucleotide 3- un amplificato da PCR 4- il DNA del gene Una sonda di RNA

23 Identificazione di una sequenza per ibridazione con una sonda riconoscimento della sequenza d interesse

24 SOUTHERN BLOTTING: come identificare un ago (gene) in un pagliaio (genoma)

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26 Southern blotting (1970- Dr. Edward Southern) Procedura Procedura Isolamento Isolamento del del DNA DNA genomico genomico Digestione Digestione con con enzimi enzimi di di restrizione restrizione specifici specifici Separazione Separazione mediante mediante elettroforesi elettroforesi su su gel gel d agarosio d agarosiodei dei frammenti frammenti di di DNA DNA Denaturazione Denaturazione del del DNA DNA per per separare separare i i filamenti filamenti complementari complementari Trasferimento Trasferimento del del DNA DNA su su membrana membrana per per capillarità capillarità Ibridazione Ibridazione con con una una sonda sonda marcata marcata Autoradiografia Autoradiografia

27 Gel di agarosio colorato con EtBr Autoradiografia

28 Il Southern blotting permette di: -determinare la presenza o assenza di specifici frammenti genici - studiare la struttura e l organizzazione l di un gene

29 Applicazioni Diagnosi di malattie genetiche ereditarie (es. anemia falciforme, Corea di Huntington, etc) sia prenatale che preclinica Medicina forense (determinazione dell impronta genetica) Individuazione di agenti patogeni nelle infezioni Analisi filogenetiche Mappatura del genoma

30 Una mutazione associata alla malattia (non necessariamente causale) può causare la perdita o l acquisizione di un sito di restrizione e quindi modificare il normale pannello di restrizione. A1A1 A1A2 A2A2

31 E il caso del gene della globina β mutata nell anemia falciforme (normale) (mutata) La mutazione (causa della malattia) modifica un sito di restrizione

32 sonda sonda Il Southern Blotting permette di fare una diagnosi molecolare della malattia

33 Il Southern blotting nello studio della variabilità genetica RFLP (Restriction( Fragment Lenght Polymorphism) Quattro individui che presentano una diversa lunghezza dei frammenti di restrizione nel medesimo locus genico, rivelati per Southern Blotting mediante la sonda indicata in figura.

34 Varianti del Southern Blotting: Northern Blotting analisi di RNA Western ern Blotting analisi di proteine Eastern Blotting analisi di PTM

35 Northern Blotting una variante del Southern Blotting per identificare un trascritto (RNA) Procedura Procedura Isolamento Isolamento dell RNA dell RNA Elettroforesi Elettroforesi dell RNA dell RNA su su gel gel di di agarosio agarosio Trasferimento Trasferimento dell RNA dell RNA su su membrana membrana Ibridazione Ibridazione con con una una sonda sonda marcata marcata Autoradiografia Autoradiografia

36 Il Northern blotting permette di: -determinare la dimensione e la quantità di specifici RNA - studiare l espressione l genica Applicazioni Espressione di un trascritto in diversi tessuti Come varia l espressione di un trascritto Caratterizzazione di diversi trascritti (es.isoforme di splicing)

37 Espressione di un trascritto in diversi tessuti Es. Northern Blotting con mrna estratti da tessuti diversi. Si ottengono diverse informazioni: 1- livello di espressione nei tessuti esaminati 2- tipo di mrna prodotto

38 Come varia l espressione l di un trascritto trattamento Controllo di caricamento Gene housekeeping Gene di interesse Es. Northern Blotting in una stessa linea cellulare prima e dopo trattamento con un farmaco

39 Caratterizzazione di isoforme di splicing

40 AMPLIFICARE IL DNA

41 Clonaggio in vettori e amplificazione in cellule ospiti (anche di sequenze non note) CGGCATTTGCGTATTCGGCC TAGCTACTCGTACCCCTGAT AGGTGTGCATTTAGGGCACT GCAGGGCCTCGGCAATCCGC CCCGGTGTGAATAAATCGTA CGGCATTTGCGTATTCGGCC TAGCTACTCGTACCCCTGAT AGGTGTGCATTTAGGGCACT GCAGGGCCTCGGCAATCCGC CCCGGTGTGAATAAATCGTA CGGCATTTGCGTATTCGGCC TAGCTACTCGTACCCCTGAT AGGTGTGCATTTAGGGCACT GCAGGGCCTCGGCAATCCGC CCCGGTGTGAATAAATCGTA CGGCATTTGCGTATTCGGCC TAGCTACTCGTACCCCTGAT AGGTGTGCATTTAGGGCACT GCAGGGCCTCGGCAATCCGC CCCGGTGTGAATAAATCGTA CGGCATTTGCGTATTCGGCC TAGCTACTCGTACCCCTGAT AGGTGTGCATTTAGGGCACT GCAGGGCCTCGGCAATCCGC CCCGGTGTGAATAAATCGTA CGGCATTTGCGTATTCGGCC TAGCTACTCGTACCCCTGAT AGGTGTGCATTTAGGGCACT GCAGGGCCTCGGCAATCCGC CCCGGTGTGAATAAATCGTA Amplificazione di sequenze note mediante la reazione a catena della DNA polimerasi o PCR CGGCATTTGCGTATTCGGCC TAGCTACTCGTACCCCTGAT AGGTGTGCATTTAGGGCACT GCAGGGCCTCGGCAATCCGC CCCGGTGTGAATAAATCGTA

42 PCR (Polymerase( Chain Reaction) La reazione a catena della polimerasi Mullis- Nobel 1993 È una metodica che consente di ottenere un numero enorme di copie di una specifica sequenza di DNA partendo da una piccola quantità di templato

43 Cicli Cicli di di denaturazione denaturazione annealing annealingdei dei primers primers allungamento allungamento (polimerizzazione) (polimerizzazione) La Taq polimerasi (da Thermus aquaticus) è una DNA polimerasi resistente alle alte temperature

44 Cicli Cicli di di denaturazione denaturazione annealing annealingdei dei primers primers allungamento allungamento (polimerizzazione) (polimerizzazione) La Taq polimerasi (da Thermus aquaticus) è una DNA polimerasi resistente alle alte temperature e per questo utilizzata nella PCR

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47 Il SYBR Green I emette fluorescenza solo dopo il legame al DNA la quantità di fluorescenza è proporzionale alla quantità totale di DNA a doppio filamento presente. La fluorescenza aumenta man mano che il target viene amplificato Real-time PCR o PCR quantitativa

48 Vantaggi della PCR: Amplificazione di di tracce minime di di DNA Diagnosi molecolare diretta senza l uso di di sonde radioattive

49 Applicazioni della PCR: Diagnosi di malattie genetiche ereditarie sia prenatale che preclinica Amplificazione di DNA per clonaggio e sequenziamento Medicina forense (determinazione dell impronta genetica) Individuazione di agenti patogeni nelle infezioni

50 DNA amplificato per PCR DNA amplificato per PCR Es. dell anemia falciforme La PCR sequita da digestione con enzimi di restrizione (DdeI) permette di fare una diagnosi molecolare della malattia

51 RT= retrotrascrizione PCR PCR

52 Uso della PCR per rivelare la presenza di un genoma virale in un campione di sangue

53 CLONARE IL DNA

54 Fasi di un esperimento di clonaggio: 1) isolamento di un frammento di DNA (frammento di restrizione o amplificato per PCR) 2) unione del filamento ad un vettore di clonaggio (tipi di vettori) 3) introduzione del DNA ricombinante nelle cellule ospiti (trasformazione batterica) 4) identificazione delle cellule contenenti le molecole di DNA ricombinante di interesse (selezione dei batteri trasformati) 5) isolamento del DNA di interesse ed eventuale sequenziamento

55 Vettori di clonaggio Permettono il trasferimento di DNA nella cellula ospite in modo da farlo replicare e trasmetterlo alle cellule figlie. Alcuni rimangono in forma episomale,, altri si integrano nel genoma dell ospite Tipi di vettore Elementi genetici extracromosomici (cosmidi o plasmidi) Vettori virali (fagi( o virus animali)

56 Caratteristiche di un vettore ideale

57 Ogni tipo di vettore possiede caratteristiche che lo rendono adatto al tipo di applicazione di interesse Plasmidi di piccole dimensioni, facili da isolare e purificare, con capacità di replicazione autonoma, conferita anche da un origine di replicazione. Es. pbr322. Fagi ospitano frammenti di DNA più lunghi rispetto ai plasmidi. es. fago lambda con genoma completamente sequenziato e fornito di appropriate mutazioni, in modo da adattarlo alle necessità del clonaggio (vengono eliminati alcuni geni del fago che sono sostituiti dal DNA esogeno).

58 Vettori di clonaggio Vettore dimensione dell inserto (kb) Esempi Plasmidi 0, puc18, pbr322 Fagi 8-22 λ Cosmidi pjb8 BAC pbac108l YAC * pyac4 *2000kb= 2Mbp NB: Il cromosoma più piccolo, il 21, ha circa 46 Mbp

59 Clonaggio di DNA in un vettore plasmidico Sito di taglio

60 Amp+ La trasformazione e l uso di marcatori selezionabili I batteri I batteri trasformati sono trasformati sono piastrati su piastrati su terreno terreno selettivo selettivo (+ampicillina) (+ampicillina) Trasformazione Trasformazione batterica batterica Colonie Colonie resistenti resistenti all ampicillina ampicillina all ampicillina NB

61 Uso di lacz come marcatore di clonaggio

62 Vettori derivati da batteriofagi Es. il fago λ

63 Selezione e amplificazione: infezione batterica placche fagiche Ciclo litico

64 Vettori cosmidici Caratteristiche: ospitano fino a circa 45 kb di DNA origine replicazione plasmidica uno o più siti di restrizione unici uno o più marcatori selezionabili uno o più siti cos* *cos cos= estremitàcoesive del batteriofago; permettono l'impacchettamento del DNAnel virione.

65 Cosmidi Un cosmide è un plasmide, di circa 5 Kpb, contenente un sito cos di λ. Come tutti i vettori plasmidici contiene: una ori un marcatore di resistenza un sito unico di restrizione per l inserimento del DNA Il cosmide ricombinante, per essere un buon substrato per la reazione di packaging deve avere dimensione tra Kb. Ciclo lisogenico Si clona come un plasmide e si propaga come un fagoλ Considerando la dimensione media di un vettore cosmidico, la dimensione di un inserto che può essere clonato in un cosmide varia tra 32 e 45Kb, che rappresenta più di quanto è possibile clonare nei vettori lambda (8-22Kb)

66 Cromosomi artificiali Un estensione logica nella produzione di vettori per il clonaggio di grossi frammenti di DNA è quella di ricostruire un cromosoma a replicazione autonoma nel quale possono essere inseriti frammenti di DNA esogeno. I cromosomi naturali eucariotici per la loro stabilità e funzionalità hanno le seguenti strutture: - Telomeri (DNA e proteine all estremità dei cromosomi, che hanno una funzione protettiva) - Centromeri (segmenti di DNA altamente ripetuti che sono essenziali per il controllo e la segregazione cromosomica)

67 Cromosomi artificiali batterici (BAC): kb di DNA Cromosomi artificiali di lievito (YAC): ospitano fino a kb di DNA origine di replicazione di lievito 2 telomeri (stabilità) 1 centromero

68 Cromosomi artificiali batterici: BAC I vettori BAC contengono: - siti cos del fago λ - marcatori di selezione (CAM R = resistenza al cloramfenicolo) - oris e repe per la replicazione del fattore F - polylinker per il clonaggio di inserti I Cromosomi Artificiali Batterici (BAC) sono vettori che derivano dal fattore sessuale F

69 Cromosomi artificiali di lievito:yac I vettori YAC contengono: - un centromero (CEN4) - una sequenza a replicazione autonoma (ARS1) che permette la replicazione autonoma rispetto alle origini di replicazione cromosomiche - telomeri (TEL) necessari per la replicazione e il mantenimento dei cromosomi - marcatori di selezione in lievito (ura3 e trp1) - origine di replicazione (oric) e un marcatore selettivo batterico, per la propagazione in E. coli prima del clonaggio. Trasformazione di cellule di lievito e selezione in terreno minimo (ura- e trp-)

70 Vettori di espressione Il gene esogeno può essere trascritto e tradotto. Promotore la trascrizione del Es. vettore di espressione

71 A cosa serve clonare il DNA? Con il clonaggio del DNA si possono isolare i geni Genoteca genomica