Meccanismi e aspetti cinetici

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1 Reazioni di Idrolisi Trasformazioni idrolitiche di esteri e ammidi (proteasi( proteasi, esterasi, lipasi) Vantaggi: assenza di cofattori sensibili, disponibilità di un largo numero di enzimi non altamente specifici. Ampio utilizzo in sintesi organica (2/3 delle biotrasformazioni) Meccanismi e aspetti cinetici Meccanismo di idrolisi enzimatica di ammidi e esteri Attacco nucleofilo da parte di un gruppo attivo dell enzima enzima alla gruppo carbonilico dell estere estere o ammide (idrolisi basica) Gruppo attivo: -OH OH (serina serina) esterasi di fegato di maiale, lipasi microbiche -COO - (acido aspartico) pepsina -SH (cisteina cisteina) papaina Meccanismo serina idrolasi

2 Meccanismo serina idrolasi Idrolisi di proteine enzima catalizzata istidina serina Acido aspartico Enzima Chimotripsina (serina proteasi) Substrato

3 Complesso Enzima-Substrato Intermedio tetraedrico

4 Nuovo peptide N-terminale In ambienti con basse concentrazioni di acqua altri nuclofili competono con l acqua: Acil transfer: reazione di un altro alcol (trans( trans-esterificazione) Amminolisi: : reazione di RNH 2 (ammide N-sostituita) N Reazione con H 2 O 2 (peracidi, RCOOOH) Reazione con tioli (tioesteri) non avviene

5 Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Si genera un nuovo stereocentro grazie alla tautomeria cheto enolica

6 Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Reagisce preferenzialmente uno dei gruppi enantiotopici Si genera una nuova unità stereogenica

7 Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Processo ad uno stadio (diesteri( diesteri) Idrolisi dell diestere dell acido malonico α,α-disostituito ad opera dell α-chimotripsina o dell esterasi esterasi di fegato di maiale (PLE) La reazione si ferma dopo l idrolisi l del primo gruppo poiché il prodotto è fortemente idrato in ambiente acquoso e non viene più accettato dall idrolasi Cosa accade se la reazione procede? (seconda idrolisi) Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Processo a due stadi (diacetato( diacetato) Il prodotto di mono-idrolisi idrolisi, monoacetato,, è meno polare per cui si ottiene anche il secondo processo che porta nuovamente ad un prodotto achirale. La velocità però è inferiore (processo meno favorito) quindi si può recuperare il monoestere chirale ad elevati ee

8 Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Composti meso (meso( meso-trick) Sintesi enzimatica stereoselettiva (substrati achirali) Composti meso (meso( meso-trick) Processo a doppio stadio, diacetato

9 Cinetiche processi a singolo stadio (reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile) Selettività S= substrati achirale con gruppi enantiotopici o composto meso P,Q= prodotti enantiomerici L ee dipende dal rapporto k 1 /k 2, che è costante nel corso di tutta la reazione Quindi l ee non varia al variare della conversione, è costante Cinetiche processi a doppio stadio (reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile) Il secondo processo è una risoluzione cinetica. Solitamente la selettività dell enzima è la stessa, per cui se k 1 >k 2 k 4 sarà maggiore di k 3. Con la conversione si otterrà un aumento nell ee ee del prodotto, mentre la resa in prodotto diminuisce Conversione

10 Cinetiche processi a doppio stadio (reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile) Resa chimica dipende da: Selettività dipende da: Per avere alte rese in prodotto [Q+P] Per avere alte stereoselezioni in prodotto [P] Cinetiche processi a doppio stadio (reazione in ambiente acquoso, processo irreversibile)

11 Enzimi come Biocatalizzatori PLE pig liver esterase,, PPL porcine pancreatic lipase Cambiando enzima si ottiene opposta stereoselezione (ee PLE = 42%, ee PPL =89%) La risoluzione cinetica aumenta l ee Risoluzione cinetica Primo esempio riportato risale al 1903 Nelle bio-trasformazioni le risoluzioni cinetiche sono 4 volte più frequenti delle trasformazioni stereoselettive

12 Risoluzione cinetica Resa massima teorica: 50% In alcuni casi k S >>k R, si trasforma solo uno dei due enantiomeri Cinetiche di risoluzioni enzimatiche (Sih( Sih) Selettività di una risoluzione = E = Enatiomeric Ratio Eutomero: enantiomero con la massima reattività Distomero: enantiomero con bassa reattività o indesiderata Risoluzione cinetica enzimatica Costanti cinetiche sono difficili da misurare Si preferisce utilizzare gli ee e la conversione

13 Dipendenza del valore di ee contro la conversione

14 Processo di risoluzione enzimatica a due stadi I stadio: la reazione viene bloccata al 40% per il quale il prodotto ha un ee/resa massimizzata (vicini al punto X) II stadio: il substato viene idrolizzato nuovamente fino ad una conversione complessiva del 60%, con un recupero di reagente ee/resa ottimale. Si sacrifica il 20% di prodotto Processo di risoluzione enzimatica reversibile

15 L ee del substrato varia ha un profilo diverso rispetto a quello delle le reazioni irreversibili. Ad alti livelli di conversione la reazione inversa diventa più importante. i Ovviamente sarà lo stesso enantiomero a reagire preferenzialmente, portanto ad una diminuzione dell ee globale del substrato. Per cui si deve operare in condizioni in cui la reazione sia irreversibile (per esempio aumentando la concentrazione del nucleofilo) Risoluzione biocatalitica sequenziale Il substrato racemo ha due siti di reazione uguali, per cui la reazione r procede due volte con la formazione di un mono estere intermedio In pratica il substrato deve coordinarsi al sito attivo e reagire e due volte Si ottengono selettività molto alte

16 Etot rappresenta la selettività che un singolo processo dovrebbe avere per ottenere questi ee

17 Risoluzione enzimatica sequenziale: idrolisi - esterificazione Meccanismo L acetato racemo A e B viene idrolizzato per dare gli alcoli P e Q in un mezzo organico contenente il minimo quantitativo di acqua. Per cui, per azione della stessa lipasi, si ha l esterificazione degli alcoli P e Q ad opera dell acido cicloesanoico presente nella miscela di reazione. Il processo avviene quindi due volte con un notevole incremento della stereoselezione del processo Nel caso specifico si ottiene una E apparente =400 utilizzando processi che hanno E 1 =8 (idrolisi) e E 2 =97 per l esterificazione di P/Q con l acido cicloesanoico

18 Deracemizzazioni Risoluzione cinetica: svantaggi -Massima resa del 50%. Scarsa importanza dell enantiomero enantiomero non voluto -Separazione del substrato dal prodotto può essere complessa e costosa -Eccesso enantiomerico dei prodotti non ottimale Per evitare questi svantaggi si possono utilizzare varie strategie: Risoluzione Ripetuta Inversione in-situ Risoluzione Dinamica Risoluzione Ripetuta L enantiomero non voluto (distomero( distomero), dopo separazione, viene racemizzato e riutilizzato nel successivo ciclo di risoluzione cinetica Approccio importante in processi industriali (sistemi in continuo) o) Conversione totale nel prodotto voluto (virtuale) Ciclo Eutomero (%) Distomero (%) Dopo 4 cicli teorica resa del ca 94% Rese reali più basse a causa delle condizioni energiche richieste e per la racemizzazione Uso di racemasi

19 Racemasi In generale riescono a racemizzare: -sistemi che contengono stereocentri con un protone -sistemi nei quali il protone è vicino ad un gruppo elettron attrattore attore ammino acidi H 2 N H R COOH HO H R COOH α-idrossiacidi, Classificazione in base ai siti basici nel sito attivo Enzimi one-base (alanina( racemasi) Richiedono il piridossil fosfato (PLP) come cofattore Enzimi two-base (proline, idantoina racemasi) Meccanismo di azione non ancora chiarito

20 Racemasi e relativi substrati

21 Inversione in-situ Utilizzabile con molecole che contengono un singolo stereocentro. A seguito di una risoluzione cinetica il reagente e il prodotto vengono ottenuti nelle due forme enantiomeriche.. Il reagente o il prodotto, opportunamente modificato, viene trasformato mediante un processo stereospecifico,, portando ad un derivato del prodotto o del reagente con la stessa configurazione assoluta. Esempio: idrolisi di esteri In una reazione di idrolisi, l alcol che si ottiene viene trasformato rmato in tosilato o triflato che viene poi idrolizzato con inversione di configurazione. Nelle stesse condizione l estere a opposta configurazione viene idrolizzato con ritenzione di configurazione Inversione in-situ Poiché ee S e ee P dipendono dalla conversione, la conversione deve essere calcolata in funzione del valore di E (usualmente intorno al 50%)

22 SOSTITUZIONE NUCLEOFILA BIMOLECOLARE Alogenuri metilici, primari e molti secondari reagiscono con nucleofili attraverso un processo bimolecolare. Processo a 10 e-, e, improbabile per un carbonio elettrofilo Meccanismo concertato

23 SOSTITUZIONE NUCLEOFILA BIMOLECOLARE SOSTITUZIONE NUCLEOFILA BIMOLECOLARE Cinetica S N 2 Reazione elementare

24 Decorso stereochimico di una reazione S N 2 Produzione di prodotti a configurazione opposta a partire da reagenti enantiopuri Paul Walden Quale è il prodotto principale per le due reazioni? Indicare la configurazione assoluta dei prodotti

25 Reattività degli alcoli OH - è un cattivo gruppo uscente perché è una base forte L OH - deve essere trasformato in un miglior gruppo uscente Mediante reazione acido-base si genera l alcol protonato H 2 O è un buon gruppo uscente perché è una base debole

26 Solo HBr e HI forniscono sostituzioni nucleofile con alcoli primari HCl in presenza di ZnCl 2 ESTERI SOLFONICI O O Me S OR O O F 3 C S OR O O S OR Sintesi

27 Sostituzione intermolecolare Sostituzione intramolecolare alcol solfonato prodotto di sostituzione alcol prodotto di sostituzione Vantaggi dell uso di solfonati: La reazione è stereospecifica (alcoli secondari) Si evita la formazione di carbocationi intermedi e quindi eventuali riarrangiamenti Si possono usare molti nucleofili

28 Come effettuereste la seguente trasformazione? Risoluzione Dinamica La risoluzione avviene in condizioni nelle quali il substrato racemizza rapidamente. Diverse reazioni avvengono contemporaneamente: L enzima deve avere un elevata specificità per uno degli enantiomeri (k S >>k R o k R >>k S ). L idrolisi non catalizzata deve essere trascurabile La racemizzazione del substrato deve avvenire a velocità uguali e maggiori della reazione enzimatica (k( Sub rac k R o k S ) al fine di consentire concentrazioni sufficienti di enantiomero buono La racemizzazione del prodotto deve essere trascurabile

29 Risoluzione Dinamica diminuzione di ee P a causa delle risoluzione cinetica Risoluzione Dinamica con la risoluzione dinamica si possono ottenere elevati valori di ee P solo per elevate stereoselezioni E=19 ee P =90%; E=40 ee P =95%; E=100 ee P =98%

30 Idrolisi del legame ammidico L idrolisi delle ammidi è naturalmente legato al mondo dei peptidi e ammino acidi Produzione mondiale superiore ai 0.5 milioni di tonellate Ammino acidi più importanti: Idrolisi del legame ammidico Acido L-glutammicoL L-lisina D,L-methionina Prodotti per fermentazione o per via sintetica

31 Idrolisi del legame ammidico D e L ammino acidi vengono prodotti con metodi enzimatici Idrolisi del legame ammidico Metodi più importanti per la produzione di ammino acidi Risoluzione di substrati racemi via idrolisi con proteasi, esterasi e lipasi: metodo più usato perché facile ed economico

32 Criteri generali Idrolisi del legame ammidico Generalmente il substrato con configurazione L viene accettato dall enzima e trasformato mentre il D non reagisce e viene recuperato erato dal mezzo di reazione. Se l enantiomero D è il prodotto desiderato lo si può ottenere utilizzando opportuni gruppi protettori. Con opportuni enzimi (idantoinasi( idantoinasi) ) sono disponibili anche enzimi che accettano preferenzialmente l enantiomero D. I due enantiomeri si separano agevolmente sfruttando le diverse caratteristiche del reagente e del prodotto, per esempio solubilità ità a diversi ph.. Questo consente la separazione via estrazioni o cromatografie con resine a scambio ionico. Generalmente questi enzimi accettano solo ammino acidi α-sostituiti Idrolisi del legame ammidico Riciclo enantiomero non desiderato via racemizzazione Il prodotto non voluto viene generalmente racemizzato come estere per via termica ( C). 170 C). Le ammidi possono essere racemizzate via trasformazioni in basi di Shiff con aldeidi aromatiche (benzaldeide, aldeide salicilica), metodo più blando Possono essere usati enzimi quali le racemasi

33 Risoluzioni con esterasi o proteasi La risoluzione avviene per azione di una esterasi (che è in grado di idrolizzare solamente una funzione esterea) ) o di una proteasi La funzione amminica è solitamente protetta R 2 =Ac, Z, Boc per evitare reazioni collaterali. R 1 è una catena alifatica corta per consentire velocità di reazioni ragionevoli. α-chimotripsina Idrolisi del legame ammidico Sistema molto studiato e di cui si conosce bene il meccanismo di azione. Risolve l enantiomerol L

34 Risoluzione dinamica con una proteasi Idrolisi del legame ammidico PLP può essere sostituito dall analogo derivato non fosforilato o dall aldeide salicilica Risoluzioni con amidasi Idrolisi del legame ammidico Le amidasi possono essere ottenute da reni e pancreas di mammiferi o da microorganismi (Pseudomonas, Aspergillus o Rhodococcus sp.)

35 Risoluzioni con acilasi Idrolisi del legame ammidico Sintesi di prodotti naturali (feromoni( feromoni,, penicilline) Idrolisi del legame ammidico

36 Risoluzioni con idantoinasi Idrolisi del legame ammidico Risoluzioni con lattamasi Idrolisi del legame ammidico