Trasformazione genetica di cellule vegetali: introduzione ed inserzione nel genoma nucleare di un nuovo gene, senza utilizzare la fecondazione.

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2 Trasformazione genetica di cellule vegetali: introduzione ed inserzione nel genoma nucleare di un nuovo gene, senza utilizzare la fecondazione. Problemi tipici dei vegetali: 1- Presenza della parete vegetale 2- Scarsa ricombinazione omologa 3- Mancanza di linea germinale 4- Ciclo vitale dei virus al di fuori del nucleo o dei cromosomi. Non tutti già risolti: 1- Sorpassare la parete grazie a batteri (metodi indiretti) o proiettili (metodi diretti), oppure rimuovere la parete (metodi diretti) 2- Integrazione illegittima 3- Obbligo quasi sempre di rigenerare una nuova pianta da cellule somatiche trasformate 4- Vettori virali solo per espressione transiente

3 Agrobacterium tumefaciens: agente eziologico della galla del colletto crown gall.

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5 Agrobacterium Famiglia rhizobiaceae Esistono all interno del genere specie correlate che causano malattie in qualche modo simili: Agrobacterium tumefaciens: galla del colletto (crown gall) Agrobacterium rhizogenes: radici avventizie (hairy roots) Agrobacterium rubi: galla del fusto Agrobacterium radiobacter: non virulento

6 Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo stesso di trasformazione genetica 1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che continuano a crescere anche in assenza di A.t. Tumor inducing principle Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal tipo di pianta. 1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a 37 /42 C il batterio (curato) contiene un plasmide? 1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide. Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore prima evidenza della trasformazione genetica.

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8 Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo stesso di trasformazione genetica 1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che continuano a crescere anche in assenza di A.t. Tumor inducing principle Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal tipo di pianta. 1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a 37 /42 C il batterio (curato) contiene un plasmide? 1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide. Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore prima evidenza della trasformazione genetica.

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10 Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo stesso di trasformazione genetica 1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che continuano a crescere anche in assenza di A.t. Tumor inducing principle Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal tipo di pianta. 1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a 37 /42 C il batterio (curato) contiene un plasmide? 1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide. Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore prima evidenza della trasformazione genetica.

11 Tutti i ceppi virulenti di Agrobacterium possiedono un mega-plasmide ( Kb, Ti). Prove su Agrobacterium tumefaciens ceppo C58 Coltura a 28 C Recupero delle colonie Infezione delle piante Tutte le colonie provocano la malattia Coltura a 37 C Recupero delle colonie Infezione delle piante Alcune colonie non provocano la malattia Plasmide Ti presente Plasmide Ti assente

12 Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo stesso di trasformazione genetica 1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che continuano a crescere anche in assenza di A.t. Tumor inducing principle Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal tipo di pianta. 1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a 37 /42 C il batterio (curato) contiene un plasmide? 1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide. Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore prima evidenza della trasformazione genetica.

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16 Struttura modulare plasmide Ti bp, codifica per 155 proteine raggruppate in operoni presenti in 5 porzioni: 1- regione T (T-DNA), DNA fisicamente trasferito 2- regione vir trasferimento DNA 3- regione rep replicazione batterica 4- regione tra coniugazione tra batteri 5- uptake e metabolismo opine. 1- T-DNA: delimitato da RB e LB, 25 bp ripetute dirette. Il RB è indispensabile per il trasferimento. Contiene geni con proprietà vegetali deputati alla sintesi di auxine (iaam e H), citochinine (ipt) e opine (ocs, nos, etc). Mutanti inattivati da trasposoni portano a tumori hairy o rooty o privi di opine geni vir organizzati in 6 operoni (A G) sono indispensabili per il trasferimento vird1 e D2: tagli singola elica al RB, D2 rimane legata covalentemente virb (11 geni) crea l apparato di trasferimento (pilo) vire2 media la localizzazione (insieme a D2) nel nucleo, Single strand DNA binding protein. Funzione necessaria solo in pianta.

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19 X X Tumore formato da germogli Tumore formato da radici

20 Struttura modulare plasmide Ti bp, codifica per 155 proteine raggruppate in operoni presenti in 5 porzioni: 1- regione T (T-DNA), DNA fisicamente trasferito 2- regione vir trasferimento DNA 3- regione rep replicazione batterica 4- regione tra coniugazione tra batteri 5- uptake e metabolismo opine. 1- T-DNA: delimitato da RB e LB, 25 bp ripetute dirette. Il RB è indispensabile per il trasferimento. Contiene geni con proprietà vegetali deputati alla sintesi di auxine (iaam e H), citochinine (ipt) e opine (ocs, nos, etc). Mutanti inattivati da trasposoni portano a tumori hairy o rooty o privi di opine geni vir organizzati in 6 operoni (A G) sono indispensabili per il trasferimento vird1 e D2: tagli singola elica al RB, D2 rimane legata covalentemente virb (11 geni) crea l apparato di trasferimento (pilo) vire2 media la localizzazione (insieme a D2) nel nucleo, Single strand DNA binding protein. Funzione necessaria solo in pianta.

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22 Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali: 1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici inusuali come l'acetosiringone; 2- l'acetosiringone induce l'attivazione dei geni vir sul plasmide Ti; 3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo filamento il quale è importato nella cellula vegetale; 4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale; 5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi: produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine; biosintesi delle opine

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24 Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali: 1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici inusuali come l'acetosiringone; 2- l'acetosiringone induce l'attivazione dei geni vir sul plasmide Ti; 3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo filamento il quale è importato nella cellula vegetale; 4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale; 5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi: produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine; biosintesi delle opine

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27 Vir Genes and their Function Vir Gene Vir A, Vir G VirD2 Vir D1 Vir D2 Vir C Vir E2 Vir E1 Function Sense phenolic compounds from wounded plant cells and induce expression of other virulence genes Endonuclease; cuts T-DNA at right border to initiate T-strand synthesis Topiosomerase; Helps Vir D2 to recognise and cleave within the 25bp border sequence Covalently attaches to the 5 end of the T-strand, thus forming the T-DNA Complex. Also guides the T-DNA complex through the nuclear pores Binds to the 'overdrive' region to promote high efficiency T-strand Synthesis Binds to T-strand protecting it from nuclease attack, and intercalates with lipids to form channels in the plant membranes through which the T-complex passes Acts as a chaperone which stabilises Vir E2 in the Agrobacterium

28 Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali: 1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici inusuali come l'acetosiringone; 2- l'acetosiringone induce l'attivazione dei geni vir sul plasmide Ti; 3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo filamento il quale è importato nella cellula vegetale; 4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale; 5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi: produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine; biosintesi delle opine

29 5 3 LB RB LB RB LB RB 3 5

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32 Agrobacterium tumefaciens cells attached to a plant cell.

33 Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali: 1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici inusuali come l'acetosiringone; 2- l'acetosiringone induce l'attivazione dei geni vir sul plasmide Ti; 3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo filamento il quale è importato nella cellula vegetale; 4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale; 5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi: produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine; biosintesi delle opine

34 Vir D2 e Vir E2 contengono segnali di localizzazione nucleare NLS

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36 Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali: 1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici inusuali come l'acetosiringone; 2- l'acetosiringone induce l'attivazione dei geni vir sul plasmide Ti; 3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo filamento il quale è importato nella cellula vegetale; 4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale; 5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi: produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine; biosintesi delle opine

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38 Utilizzo biotecnologico di A. tumefaciens come sistema di trasformazione vegetale

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40 Sistema del vettore binario: i geni vir possono agire anche in trans. Sistema binario a due plasmidi: - Plasmide Ti delezione del T-DNA originale disarmato residente - Plasmide di E. coli con nuovo T-DNA (2 border, geni interesse), origine di replicazione per E. coli e A. tumefaciens.

41 Sistema co-integrato ad un plasmide: - Plasmide Ti nessuna delezione del T-DNA originale - Plasmide di E. coli con nuovo T-DNA (2 border, geni interesse), origine di replicazione per E. coli ma NON ha quella per A. tumefaciens, regioni di omologia prima e dopo T-DNA Le regioni di omologia tra i plasmidi innescano doppia ricombinazione omologa scambio dei T-DNA Il plasmide del E. coli non si replica nell A.t. viene perso

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43 Esperimenti di co-coltivazione