Il ruolo del laboratorio di Microbiologia nella diagnosi delle zoonosi

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1 SORVEGLIANZA DELLE ZOONOSI Jesi, 8 settembre 2012 Il ruolo del laboratorio di Microbiologia nella diagnosi delle zoonosi Paola Pauri Direttore U.O. Patologia Clinica Ospedale di Jesi Area Vasta 2 Delegato regionale Associazione Microbiologi Clinici Italiani (AMCLI)

2 LE ZOONOSI: ALLEANZA E PREVENZIONE, OSPEDALE E TERRITORIO Incontrarsi Fabriano, 29 gennaio 2010 GRUPPO DI LAVORO DEL PROGETTO DEL PIANO REGIONALE DELLA PREVENZIONE: LOTTA A CHIKUNGUNYA, WEST NILE lungo la DISEASE, DENGUE E PRINCIPALI ZOONOSI (PF TECNOLOGIE - ARS MARCHE, ISTITUTO ZOOPROFILATTICO) Ancona, 29 febbraio 2012 (1 riunione) strada. INCONTRO SCIENTIFICO REGIONALE AMCLI 15 dicembre febbraio 2012 PRESENTAZIONE PROTOCOLLI E PROCEDURE CONDIVISE PER LA STANDARDIZZAZIONE DELL APPROCCIO DIAGNOSTICO: DIARREE, LIQUOR CEREBRO-SPINALE, INFEZIONI SESSUALMENTE TRASMESSE

3 EUROPA DATI EPIDEMIOLOGICI CAMPYLOBACTER: zoonosi più notificata (45.2/ ) SALMONELLA: zoonosi seconda per notifica ma con trend significativamente in diminuzione negli ultimi anni (31/ ) BRUCELLA: il maggior numero di casi si osserva nei Paesi non ancora ufficialmente indenni da brucellosi negli animali (EU 0.1/ ; Grecia 0.9/ ) ITALIA SALMONELLA: zoonosi più notificata ma con trend significativamente in diminuzione negli ultimi anni (7.6/ ) CAMPYLOBACTER: zoonosi sottostimata (1.1/ ) BRUCELLA: zoonosi in forte diminuzione negli ultimi anni (0.1/ ): 7 Regioni e 20 Provincie sono ufficialmente indenni da Brucella e 8 Regioni e 5 Provincie sono ufficialmente indenni da B. melitensis RAPPORTO ZOONOSI 2007 EFSA (European Food Safety Authority) ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control)

4 MARCHE DATI EPIDEMIOLOGICI SALMONELLA: zoonosi più notificata (13.6/100.00) CAMPYLOBACTER: zoonosi sottostimata BRUCELLA: Le Marche sono ufficialmente indenni da brucella bovina e ovi-caprina dal Negli ultimi anni 5 casi autoctoni, ma tutti con consumo di alimenti a rischio ARCHIVI Schede di Dimissione Ospedaliera (SDoVISION ARS Marche) Notifiche malattie infettive obbligatorie D.M 15/12/90 Dati IZS per Profilassi di Stato bovina e ovina

5 MARCHE: DATI ATTIVITA 2011 e % POSITIVITA (dati preliminari) LABORATORI RISPONDENTI: Ospedali Riuniti, Fabriano, Fano, Jesi, Osimo, Senigallia GERME N % positivi prestazioni Salmonelle Campylobacter E. Coli VTEC ,9 Epatite A IgG ,9-55 Epatite A IgM Statistiche prestazioni effettuate 2011 Laboratori rispondenti raccolti nell ambito delle attività del GdL Zoonosi

6 I PROBLEMI DELLA DIAGNOSI Difficoltà di diagnosi clinica Grave sottonotifica in ambito medico e veterinario Difficoltà di diagnosi di laboratorio (sono necessarie richieste specifiche) Difficoltà di ricercare e riconoscere i fattori di rischio Mancanza di una formazione specifica degli operatori sanitari Mancanza/difficoltà di raccordo fra gli operatori sanitari coinvolti

7 DIAGNOSI MICROBIOLOGICA A causa della epidemiologia attuale l'utilità della coprocoltura convenzionale è discussa (cercare solo Salmonelle?) E' necessario che il medico richiedente (MMG/ospedaliero) usi un approccio diverso alla richiesta Un'accurata indagine clinico-anamnestica permetterebbe di utilizzare flow-chart decisionali microbiologiche POTREBBE ESSERE UTILE UN APPROCCIO SINDROMICO/ PERSONALIZZATO?

8 STUDIO ISS 2010 su 36 LABORATORI ITALIANI Pochi patogeni ricercati routinariamente Scarsa sensibilità dei metodi utilizzati (colturali, immunocromatografia per antigeni, ecc) Criticità della fase pre-analitica rispetto a: Intervallo fra insorgenza dei sintomi e raccolta del campione Trasporto, conservazione, consegna del campione rispetto al momento della semina VI Workshop Nazionale di Epidemiologia Veterinaria L epidemiologia veterinaria nel contesto one world, one health - Orvieto, 1-2 dicembre 2011

9 STUDIO ISS 2010 su 36 LABORATORI ITALIANI N campioni % positivi Salmonella Shigella spp Campylobacter spp Giardia spp ,22 Entamoeba histolitica ,21 Rotavirus Norovirus Aeromonas spp Clostidium perfringens Bacillus cereus

10 TARIFFARIO REGIONALE IN VIGORE La coprocoltura standard prevede solo la ricerca di Salmonella e Shigella (cod ) Ricerche microbiologiche specifiche ulteriori da eseguire devono essere espressamente richieste ESEMPIO 1. E. coli enteroemorregica con eventuale identificazione (cod ) 2. Campylobacter coltura con eventuale ATB (cod ) 3. Yersinia (cod ) 4. Vibrio (cod )

11 I COMPONENTI OPERATIVI DEL GRUPPO DI LAVORO MARCHE Lotta a Chikungunya, West Nile Disease, Dengue e principali zoonosi Rigorosamente in ordine alfabetico Barocci S, Bellesi J, Ciarrocchi G, Duranti A, Gavaudan S, Gironacci L, Manganaro F, Manso E, Marziali A, Maurizi E, Pauri P, Pieretti B, Luzi R Pubblica Funzione Tecnologie ARS Marche Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell Umbria e delle Marche Laboratori Aziende Ospedaliere e ASUR Marche

12 COSA HA FATTO IL GRUPPO DI LAVORO MARCHE Lotta a Chikungunya,.principali zoonosi Confrontato, ragionato, condiviso Studiato strategie Raccolto dati ed evidenze Deciso passo per passo gli approcci migliori da adottare IN UN OTTICA DI RETE DEI SERVIZI ORIENTATA AL MIGLIORAMENTO

13 COSA HA FATTO IL GRUPPO DI LAVORO MARCHE Lotta a Chikungunya,.principali zoonosi Gli strumenti e le fonti utilizzate Percorso Diagnostico presentato al XXXVIII Congresso Nazionale AMCLI Rimini, novembre 2009 Enteriti d origine infettiva (Esame microbiologico delle Gastroenteriti) a cura di Stefano Andreoni con la collaborazione di: Gruppo di lavoro Nomenclatore e Percorsi Diagnostici Ricerca bibliografica su Medline

14 ESTREMA CRITICITA DELLA FASE PRE-ANALITICA RACCOLTA, CONSERVAZIONE E TRASPORTO DEL CAMPIONE

15 PRECAUZIONI DA OSSERVARE Quando possibile, effettuare la raccolta delle feci prima dell assunzione di antimicrobici Il paziente deve essere istruito ad evacuare in un recipiente pulito (es. padella, piatto di plastica) e a trasferire nell apposito contenitore con tappo a vite un aliquota del campione delle dimensioni di una noce (feci semiformate) o di 5-10 ml (feci liquide) E opportuno selezionare le porzioni delle feci maggiormente rappresentative raccogliendo eventuali fiocchi di muco, sangue o pus I campioni prelevati mediante tampone rettale non sono idonei per le ricerche di antigeni e/o tossine e/o per l esame parassitologico: per quest ultimo è possibile inviare feci fresche o già fissate in relazione alle tecniche che il laboratorio intende utilizzare I campioni di feci devono essere inviati in laboratorio entro 2-4 ore dall emissione (ottimale 1-2 ore) La conservazione a temperatura di frigorifero (+4 C) può compromettere la vitalità di alcuni patogeni, per contro la conservazione del campione in appositi terreni di trasporto può non essere idonea per tutte le ricerche In ogni caso il laboratorio dovrebbe fornire al paziente istruzioni scritte circa le modalità di raccolta, conservazione e trasporto del campione di feci in riferimento alle indagini richieste dal curante

16 Coprocoltura Il contenitore in plastica con tappo a vite e palettina può essere fornito dalla Segreteria dell UO, oppure acquistato in farmacia. L uso del tampone è ammesso solo per i pazienti non collaboranti e per i pazienti pediatrici. Il materiale deve essere raccolto nella fase acuta, cioè nel momento della diarrea e comunque il più presto possibile dopo l insorgenza dei sintomi (al massimo entro 4 giorni), possibilmente prima dell inizio della terapia antibiotica. La coprocoltura standard prevede la ricerca di Salmonella e Shigella. La ricerca di altri germi (Clostridium difficile, Campylobacter, ecc) deve essere richiesta separatamente e comunque sono esami riservati a feci diarroiche. Effettuare la raccolta delle feci emesse spontaneamente, non contaminate da urine o altri fluidi biologici (sangue mestruale, liquido spermatico) defecando in un contenitore pulito ed asciutto (piatto di carta, catino, vaso da notte, ecc) posto eventualmente nel bidet. Non utilizzare per la raccolta del campione carta igienica, che potrebbe contenere sali di bario, che inibiscono la crescita di alcuni patogeni gastroenterici. Raccogliere il campione mediante la palettina, prelevando una quantità equivalente ad una nocciola (del peso di 1-2 grammi) includendo eventuali fiocchetti di muco. I campioni di feci devono essere trasportati in laboratorio e processati il più presto possibile (entro 2 ore al massimo). Rev. 3 del 15 giugno Esame parassitologico delle feci Per la raccolta è necessario munirsi dell apposito contenitore in plastica con tappo a vite, contenente un terreno liquido di trasporto e formalina che migliora la conservazione di parassiti, uova e cisti; il contenitore deve essere ritirato presso la Segreteria dell UO. Effettuare la raccolta delle feci emesse spontaneamente...è preferibile secondo le indicazioni delle più recenti linee guida internazionali, raccogliere 3 campioni di feci a giorni alterni, che possono essere conservati a temperatura ambiente e consegnati tutti insieme alla Segreteria dell UO.

17 APPROPRIATEZZA DELLA RICHIESTA Si concorda sulla necessità di condividere con MMG le indicazioni della letteratura internazionale riguardo alle manifestazioni cliniche che richiedono il ricorso ad accertamenti microbiologici fecali, come riportato nel documento AMCLI Marche proposto, ma comunque da sottoporre ad ulteriore validazione diarrea acquosa con segni di disidratazione febbre >38 C 3-6 evacuazioni nelle 24 ore diarrea acuta protratta (> 5 giorni) o persistente diarrea con presenza di sangue nelle feci diarrea in paziente proveniente da aree endemiche per patologie gastroenteriche diarrea associata a probabile evento epidemico presenza di dolori addominali in soggetti età >50 anni diarrea in soggetti anziani ed in soggetti immunocompromessi (sempre)

18 SCHEDA DI RICHIESTA Tutte le Linee Guida sostengono in questo ambito la necessità che il campione clinico sia accompagnato da una scheda di richiesta (informatica o cartacea), in cui vanno indicati i dati del paziente, la sindrome clinica, la data di esordio dei sintomi, il motivo per cui si richiede l accertamento Si concorda la preparazione di una scheda anamnestica, tramite software SCS per l invio dei campioni interni, cartacea per gli esterni

19 IDONEITA DEL CAMPIONE Spesso vengono inviate in laboratorio per la ricerca di patogeni fecali anche campioni di feci formate, nei quali la probabilità di isolare gli enteropatogeni è molto bassa Si concorda di scartare i campioni di feci formate, considerandoli come non idonei e di testare solo i campioni diarroici, identificando anche quelli emorragici da sottoporre alla ricerca di E. coli. Per fare ciò deve essere risolto il problema del pagamento anticipato del ticket, per rimborsare l utente che avendo già pagato la prestazione non riceve la risposta, ma deve portare un ulteriore campione. In fase di sensibilizzazione dei MMG, per i pazienti esterni verrà sottolineata la necessità di effettuare le ricerche solo su campioni di feci diarroiche

20 Gastroenteriti da Salmonella vie di trasmissione Serbatoio: animali domestici e selvatici (zoonosi) Sono causate da sierotipi ubiquitari, ampiamente diffusi negli animali Trasmissione per via orale e alimentare (carne cruda di maiale, più raramente di manzo; interiora; insaccati; prodotti caseari; pollame, uova; pesci; molluschi, soprattutto cozze e ostriche crude) Dose infettante molto elevata

21 SALMONELLE Il Centro di Referenza Enteropatogeni (CRE) effettua su ogni ceppo inviato la tipizzazione sierologica per la definizione della specie e un antibiogramma che testa un set di antibiotici utile per la sorveglianza dell antibioticoresistenza Tale set è utile anche per individuare similitudini tra ceppi diversi, che vengono poi confermate con la caratterizzazione genetica (pulsotipo) al fine di evidenziare focolai di infezione Tutti i campioni positivi saranno inviati al CRE e sarà possibile utilizzare un accesso al servizio VIEW per la consultazione del referto sul sito Enternet

22 CAMPYLOBACTER I laboratori dell INRCA, Jesi, Fano, Fabriano, Senigallia, Ospedali Riuniti di Ancona effettuano la ricerca colturale del Campylobacter Il germe è labile ed esigente: richiede arricchimento, terreni selettivi, microaerofilia, ecc Si sta valutando l utilità di effettuare la ricerca del Campylobacter mediante il test cromatografico per l antigene, che non è influenzato dalla perdita di vitalità del

23 L INFEZIONE DA E. COLI VTEC E UNA ZOONOSI: I RUMINANTI SONO IL SERBATOIO NATURALE Appartengono principalmente al sierotipo O157:H7, riconosciuto come causa crescente di infezioni acquisite per via alimentare. Il cibo più spesso coinvolto è la carne macinata di manzo contaminata durante la lavorazione e consumata poco cotta (malattia dell hamburger); ma anche alimenti liquidi (acqua, latte, succhi di frutta) contaminati da feci bovine. È sufficiente una carica infettante bassissima (circa 50 batteri)

24 E. COLI Secondo il rapporto ECDC 2010 i siero gruppi da ricercare sono O26, O91, O103, O111, O145, O157. Tali ricerche (tranne O91) sono possibili presso la Microbiologia dell Azienda Ospedali Riuniti mediante metodica immunoenzimatica Si concorda di effettuare la ricerca in tutti i casi di feci emorragiche, inviando i campioni direttamente al laboratorio di Microbiologia di Ancona, che effettua la ricerca mediante amplificazione genica realtime multiplex e che permette di rilevare le tossine shiga-like stx1/stx2, ipah, eae. Tale metodica permette di rilevare in 2 ore (da feci o da coltura) se si tratta di un ceppo enteroemorragico (EHEC), produttore di shigatossina (STEC), enteropatogeno enteroinvasivo. Il costo per test è intorno a 18 euro Viene inoltre sottolineata l importanza di effettuare, per i ceppi isolati, una caratterizzazione di specie; per individuare gli alimenti fonte di infezione e poter intervenire, in alcuni casi negli allevamenti origine dei prodotti, in altri con il rintraccio degli alimenti contaminati, oppure con la prevenzione delle contaminazioni da parte dei servizi dei Dipartimenti di Prevenzione che si occupano di vigilanza sugli alimenti

25 Rete Internazionale di Sorveglianza per le infezioni Enteriche da Salmonella e da VTEC 0157 SORVEGLIANZA delle INFEZIONI da E.COLI PRODUTTORI di VEROCITOTOSSINA (VTEC) nella POPOLAZIONE UMANA: * In Italia nel periodo compreso tra il 1988 e il 2004 sono stati notificati complessivamente 344 casi di infezione da VTEC. Si tratta per lo più di infezioni sporadiche. Tuttavia negli anni 1992, 1993 e 1997 sono stati evidenziati alcuni episodi epidemici identificati attraverso la registrazione di cluster di casi di SEU. Nel grafico è rappresentato il numero di casi di infezione da VTEC identificati, per anno e ripartiti tra i casi di SEU notificati principalmente attraverso la sorveglianza SEU pediatrica (73% dei casi totali) e i casi di diversa provenienza

26 PARASSITI FECALI Le procedure di rilevazione dovrebbero prevedere secondo le Linee Guida Operative AMCLI per la diagnosi delle parassitosi intestinali la raccolta di 3 campioni in media, a giorni alterni l'esame microscopico a fresco per identificare i trofozoiti la concentrazione mediante sedimentazione ed in particolare concentrazione Formolo Etere o Etilacetato (FEA) colorazioni permanenti (tricromica, ematossilina ferrica, Giemsa) per Dientamoeba fragilis, con Lugol per GIARDIA scotch test per ossiuri, che rappresentano l'elmintiasi più diffusa in Italia tecniche specifiche per Strongyloides stercoralis (metodo di Baermann e/o coltura; per Cryptosporidium (colorazione Ziehl Neelsen) La parassitologia fecale potrebbe essere centralizzata a livello di area vasta, con personale formato ad hoc

27 SORVEGLIANZA BASATA SUI LABORATORI A causa dei problemi di sottonotifica si sta valutando se possa essere utile organizzare una sorveglianza basata sui Laboratori Si concorda inoltre sulla necessità di raccogliere i dati di attività con % di positività a livello dei Laboratori della regione Verrà definita nel dettaglio la rete identificando test di 1 livello, di approfondimento e di conferma

28 STANDARDIZZAZIONE PROCEDURE E LINEE GUIDA REGIONALI Il Gruppo ritiene necessario standardizzare le procedure utilizzate da ogni laboratorio ed anche procedere ad una specifica formazione del personale su questi argomenti Si concorda sulla necessità di predisporre Linee Guida regionali da ufficializzare e da diffondere anche agli specialisti ospedalieri e ai MMG Per quanto riguarda l inserimento del Campylobacter all interno della voce coprocoltura nel tariffario regionale si propone di effettuare una valutazione dei costi (anche sulla base delle positività rilevate mediante l indagine regionale 2011) ed una indagine di mercato dei kit disponibili per l antigene

29 ALCUNI ESEMPI PER LA COSTRUZIONE DI UN PERCORSO DIAGNOSTICO-TERAPEUTICO PAZIENTE AMBULATORIALE/NON RICOVERATO Diarrea con presenza di sangue nelle feci = Coprocoltura + E. Coli STEC/EHEC + Esame parassitologico feci (protozoi, metazoi parassiti, loro uova o cisti a fresco e dopo arricchimento). Diarrea acuta con presenza di dolore al quadrante addominale inferiore destro e febbre = Coprocoltura + Yersinia enterocolitica Diarrea in paziente reduce da recente ricovero in ospedale, intervento chirurgico e/o in terapia chemioantibiotica = Coprocoltura + Clostridium difficile Diarrea acuta in individui provenienti da paesi extracomunitari (diarrea dei viaggiatori) = Coprocoltura + Esame parassitologico feci Diarrea acuta in contatti di pazienti in età pediatrica sintomatici = Coprocoltura + ricerca Rotavirus e Adenovirus Diarrea acuta protratta o persistente in soggetto immunocompetente = Coprocoltura + Esame parassitologico feci + Cryptosporidium Deve essere sempre specificata la richiesta dei seguenti parassiti: Cryptosporidium, Microsporidi; antigeni di G.lamblia, di E.hystolitica e Cryptosporidium, che richiedono l impiego di tecniche speciali microscopiche e non

30 MORSO DI ZECCA Vista l importanza sia per il fastidio e le irritazioni che provocano, sia per le patologie che possono trasmettere e visto che l IZS è la struttura territoriale di riferimento per l identificazione, si propone di redarre una procedura che prevede il prelievo degli ectoparassiti dai pazienti che si presentano al Pronto Soccorso e l invio all IZS che procederà all identificazione ed all esecuzione di test biomolecolari per la ricerca di alcune patologie da vettori, se necessario

31 I PROBLEMI DOVUTI ALLE PERFORMANCE DEI TEST I risultati della sierologia devono essere interpretati con cautela, ponendo attenzione sia al falso negativo, che più frequentemente al falso positivo, soprattutto IgM (borreliosi, malattie autoimmuni, ( sifilide Uno studio già del 1996 (Seltzer) ha messo in evidenza i problemi che nascono con l uso eccessivo di test sierologici in pazienti con una bassa probabilità di avere la malattia di Lyme Test con sensibilità e specificità sotto il 90%, come è il caso dei test per la Borrelia, dovrebbero essere utilizzati in una popolazione di pazienti con alta probabilità di avere la malattia, quindi con sintomi il più possibile specifici L uso eccessivo e inappropriato dei test porta ad un eccesso di diagnosi (con tutti i problemi conseguenti per il paziente) e di terapia non necessaria

32 USA - AREE DI RISCHIO DI INFEZIONE Montana Maine

33 Test EIA con sensibilità 70% e specificità 83% LR(+) 4,1 LR(-) 0.36 Caso A. Ragazzo del Montana (bassissima prevalenza nella popolazione generale stimabile intorno allo 0.1%) con sintomi aspecifici (astenia, mialgia, artralgia aspecifica) che raddoppiano la probabilità clinica (0.2%) con un test positivo la P-post-T è del 2% con un test negativo la P-post-T è sotto lo zero In questo caso il test non andrebbe richiesto: la positività non aggiunge niente ad una probabilità clinica già estremamente bassa (la positività in questo caso sarebbe con ogni probabilità falsa) Nel caso di negatività ovviamente è possibile escludere la diagnosi

34 Test EIA con sensibilità 70% e specificità 83% LR(+) 4,1 LR(-) 0.36 Caso B. Ragazzo del Montana (bassissima prevalenza nella popolazione generale stimabile intorno allo 0.1%) con rush cutaneo tipo eritema migrante e puntura di zecca 1 mese prima (probabilità clinica del 60%) con un test positivo la P-post-T è del 92% con un test negativo la P-post-T è del 35% In questo caso il test è utile perché modifica significativamente le probabilità pre-test: una probabilità clinica elevata, anche in presenza di una bassa prevalenza dell infezione, deve essere approfondita. Il caso rientra nelle indicazioni delle linee guida ACP-CDC Nel caso di negatività una P-post-T del 35% non permette di escludere la diagnosi

35 Test EIA con sensibilità 70% e specificità 83% LR(+) 4,1 LR(-) 0.36 Caso C. Ragazzo del Mayne (prevalenza elevata circa 3%) con vaga storia di lesioni cutanee e attacchi ricorrenti di dolore ad un ginocchio (probabilità clinica del 50%). con un test positivo la P-post-T è del 83% con un test negativo la P-post-T è del 18% In questo caso il test è utile perché modifica in qualche modo le probabilità pre-test: una probabilità clinica sospetta, in presenza di una prevalenza elevata dell infezione, deve essere approfondita. Il caso rientra nelle indicazioni delle linee guida ACP-CDC Nel caso di negatività una P-post-T del 18% non permette di escludere la diagnosi