Relazione anno 2006 sull attività di ricerca svolta e sull utilizzo dei fondi.

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1 Alle famiglie dell Associazione Gli Amici di Valentina Torino, 2 nov. 06 Relazione anno 2006 sull attività di ricerca svolta e sull utilizzo dei fondi. Gent.li famiglie, Nel , il nostro laboratorio ha continuato il proprio lavoro sulla diagnostica dell Atassia Telangiectasia (A-T) e delle sindromi correlate. Come sapete il nostro impegno è quello di fornire un supporto diagnostico alle famiglie Italiane, in modo che la diagnosi di A-T sia eseguita nel modo più rapido ed accurato possibile. Questo lavoro é importante, perché in alcuni casi la clinica di per sé è insufficiente a confermare la diagnosi stessa, o comunque anche in presenza di un bimbo con clinica compatibile con A-T, è indispensabile avere un test che la confermi. Da diversi anni, grazie al contributo dell Associazione abbiamo messo a punto una serie di test sempre più efficaci. Numerosi gruppi in Italia stanno inviandoci pazienti con sospetta Atassia Telangiectasia per l esame. Nell ultimo anno sono arrivate al nostro centro richieste di conferma diagnostica per 11 casi, 6 delle quali sono risultate A-T. Cinque pazienti sono ancora in analisi. Il numero totale di famiglie A-T raccolte dal nostro centro è al momento 19, ma altri 20 casi circa non sono risultati A-T, pur avendo una clinica compatibile. La conferma della diagnosi (eseguita mediante una tecnica nota come Western blot, che mostra nei pazienti come manchi la proteina ATM), viene seguita dalla ricerca delle due mutazioni. Spesso ci viene chiesto quanto tempo è necessario per eseguire il test. I tempi sono al momento variabili tra i 4 mesi e i 12 mesi, ma mediamente un analisi viene completata in sei mesi circa. Alcune mutazioni risultano più difficili da identificare di altre. Negli anni ci sono però capitati casi estremi; un paziente ci ha ad esempio tenuto impegnati per più di due anni, ma alla fine la mutazione è stata identificata. Di solito si tratta di mutazioni così particolari da essere interessanti per tutta la comunità scientifica che si occupa di A-T e che sono state poi oggetto di comunicazioni a congresso e pubblicazioni. A che cosa serve il lavoro di identificare le mutazioni: 1) confermare oltre ogni dubbio che si tratti di AT; senza mutazioni nel gene, si potrebbe trattare di una malattia simile, ed al momento ci sono malattie che assomigliano ad A-T come l aprasssia oculomotoria di tipo I. L evoluzione di questa malattia è diversa da A-T e sicuramente più lieve. 2) Nei casi in cui i genitori vogliano avere altri figli, identificare le mutazioni rende

2 possibile un test prenatale sui villi-coriali. Conoscendo le due mutazioni è molto facile, per un laboratorio attrezzato, sapere se il nascituro è a rischio di sviluppare A-T. Al momento non ci sono ancora state diagnosi prenatali, ma è importante che il nostro laboratorio sia attrezzato per eseguirle. 3) Infine, le strategie terapeutiche in corso di studio potrebbero essere mutazione specifiche ; si tratta di una prospettiva, e non di una possibilità reale al momento, ma tutti conoscete il lavoro del Prof. Gatti sulle mutazioni stop e gli antibiotici aminoglicosidi. Altre vie si stanno aprendo per mutazioni diverse. Conoscere il tipo di mutazioni presenti in un paziente potrebbe essere quindi importante per scegliere in futuro l approccio da seguire. Che cosa abbiamo fatto con i soldi dell Associazione? Da Ottobre 2005 a Settembre 2006, è stato attivato un Assegno di Ricerca, di cui è beneficiaria la Dott.ssa Simona Cavalieri. Si tratta di una sorta di borsa di studio con un minimo di contributi INPS. L assegno ha un importo minimo lordo di euro, per cui sono stati usati i fondi degli ultimi due anni 2005 (8.000 euro) e 2006 ( euro), che hanno coperto la cifra totale. La Dott.ssa Cavalieri lavora da ormai sei anni sul progetto A-T, ed ha messo a punto tutte le tecniche diagnostiche oggi disponibili. E lei che esegue i test, e che svolge la vera e propria attività di laboratorio. Il suo lavoro però non si limita alla diagnostica, ma comporta anche una parte di ricerca, che nell ultimo anno ci ha consentito di pubblicare un lavoro sulla rivista internazionale Human Mutation, specializzata nel campo della Genetica Umana. Il lavoro (di cui è allegato un riassunto) riassume lo studio di 13 famiglie A-T italiane dal 2000 al 2005 e riporta le mutazioni identificate nel gene ATM. A differenza di altri lavori, questo è uno dei pochi che ha cercato di identificare tutte le mutazioni, anche quelle più difficili. Il risultato è che su 13 pazienti riportati abbiamo trovato 26 mutazioni cioè tutte quelle attese. Infine sono state trovate mutazioni note come delezioni: si tratta di veri e propri buchi nel gene che ne interrompono la struttura inattivandolo. Pochi gruppi al mondo hanno avuto questo dettaglio nel cercare le mutazioni ATM, perché sono complesse da trovare, ed è necessario molto tempo e lavoro. Ogni anno, l Associazione Amici di Valentina attraverso il nostro gruppo presenta un poster con i propri risultati al congresso internazionale ASHG (La più importante Società di Genetica Umana a livello mondiale) e alla SIGU (la società Italiana di Genetica Umana). In occasione dell ASHG, sia lo scorso anno che quest anno, abbiamo anche presentato una relazione orale al meeting satellite sull A-T, presieduto da Stephen Meyrn e Richard Gatti. Un riassunto del nostro lavoro è stato anche mandato al congresso workshop on Ataxia-Telangiectasia (A-T) and ATM tenutosi a Banff in Canada nel settembre Alla fine di Ottobre ha infine tenuto la presentazione della tesi di laurea triennale la Dott.ssa Giulia Mancini, che ha preparato una tesi compilativa su A-T (allegata) e che farà parte del nostro gruppo come studente per i prossimi tre anni. Infine, il nostro lavoro su A-T è eseguito in collaborazione con Richard Gatti. Il Prof. Gatti si dimostra sempre un valido aiuto soprattutto nei casi in cui dobbiamo far da tramite con qualche famiglia, che ha domande inusuali a cui solo lui può rispondere. Nel progetto per il prossimo anno, che è dettagliato in allegato, continueremo la parte diagnostica di routine, ma intendiamo migliorare le tecnologie diagnostiche relative ad un particolare gruppo di mutazioni: le delezioni e duplicazioni del gene ATM. Infine continueremo a sviluppare, come già fatto negli scorsi anni nuove tecniche diagnostiche

3 per malattie collegate ad AT come le aprassie oculomotorie. Non posso che ringraziare l Associazione per il sostegno che ci ha dato negli anni e rinnovarvi il nostro impegno nel campo dell A-T. Alfredo Brusco Associazione ONLUS Gli Amici di Valentina Via C.L.N. 42/A Grugliasco (TO) Tel Fax vale@aerre.it Torino, 2/11/06 Oggetto: presentazione progetto di ricerca anno Titolo: Diagnostica molecolare dell Atassia Telangiectasia e sindromi correlate Responsabili : Dott. Alfredo Brusco e Dott.ssa Simona Cavalieri Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica, via Santena 19, Torino, Tel , Fax , alfredo.brusco@unito.it Timbro e firma del responsabile scientifico Dott. Alfredo Brusco Ricercatore, Facoltà di Medicina Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica Università degli Studi di Torino

4 Introduzione. L identificazione di mutazioni nel gene ATM è fondamentale per una corretta diagnosi nei pazienti con Atassia Telangiectasia (A-T), e per un efficace consulenza genetica alle famiglie. La loro ricerca è tuttavia resa molto compleassa sia dall estensione del gene (>9Kb), sia dall assenza di punti preferenziali (hotspot): ad oggi sono infatti note più di 500 mutazioni diverse disperse lungo tutto il gene. Nell ultimo anno il nostro gruppo ha dimostrato che alcune mutazioni note come delezioni del gene non sono rare, e in un gruppo di 13 pazienti Italiani rappresentano il 10% di tutte le mutazioni attese. Inoltre molti pazienti con una clinica compatibile con A-T risultano poi negativi per mutazioni nel gene, suggerendo che altri geni siano responsabili della malattia. Il lavoro svolto dal nostro gruppo è sintetizzato nell allegato 1, che è il riassunto di un articolo recentemente pubblicato dal nostro gruppo sulla rivista Human Mutation. Sintesi del programma di ricerca Il nostro programma di ricerca per il prossimo anno sarà articolato in tre fasi: 1): Diagnostica di nuovi casi con sospetta A-T. Ci attendiamo l arrivo presso il nostro centro di nuovi pazienti nel corso del 2007, per i quali verrà effettuata la ricerca di mutazioni nel gene ATM. Attualmente la diagnostica di ATM procede secondo 4 fasi successive: a) analisi dell espressione della proteina in Western Blot (nei pazienti A-T è assente o fortemente ridotta); b) l analisi dei microsatelliti, che serve per individuare un eventuali mutazioni ricorrenti; si tratta cioè di una mutazione già descritta in altri pazienti; quest approccio funziona in pochi casi, perché quasi ogni paziente A-T italiano è diverso dall altro. Se ha successo l analisi di mutazioni si conclude in poche settimane; c) analisi in DHPLC, può tenerci impegnati per qualche mese, ed è in grado di identificare circa il 90% delle mutazioni. d) Analisi del cdna, per l individuazione di eventuali anomalie di splicing, effettuata nei casi più difficili; è stata utile in alcuni pazienti con mutazioni particolari. 2) Farà presto parte della procedura diagnostica standard lo studio di grosse delezioni o

5 duplicazioni gnomiche attraverso una nuova metodica chiamata MLPA. Queste mutazioni possono rappresentare anche il 10% delle mutazioni nel gene ATM. Al momento stiamo validando la metodica. Abbiano individuato una nuova delezione in un paziente, ed è in corso di caratterizzazione una duplicazione cioè la ripetizione di una grossa porzione di gene, mai descritta nel gene ATM. Questo nuovo approccio consentirà di migliorare ulteriormente la diagnostica di questa malattia. 3) Studio dei pazienti negativi per mutazioni nel gene ATM. Molti pazienti che arrivano in laboratorio con una diagnosi di possibile A-T risultano poi negativi. Il nostro impegno sarà anche quello di migliorare le tecniche diagnostiche per patologie simili ad A-T. In particolare nel corso del prossimo anno renderemo disponibile un analisi DHPLC per l Aprassia Oculomotoria tipo 1 (AOA1), dovuta a mutazioni nel gene della Apratassina (APTX). Questa malattia è facilmente confondibile con A-T, ma ha un decorso più benigno. Una caratteristica che la differenzia è il valore di alfafetoproteina sierica (facilmente dosabile con un prelievo di sangue), che è aumentata nell A-T e normale nella AOA1. Infine, metteremo a punto il test molecolare per l Aprassia Oculomotoria tipo 2 (AOA2), in cui è coinvolto il gene della Senataxina (SETX). Anche in questo caso la clinica può in alcuni pazienti essere confusa con A-T, anche se la malattia di solito insorge dopo la pubertà. In particolare, quest ultima patologia condivide con l Atassia Teleangiectasia non solo segni clinici quali l atassia cerebellare, le teleangiectasie, la disartria, il nistagmo, la neuropatia periferica, ma anche elevati livelli di alfa-feto proteina, uno dei marcatori biochimici che differenziano l A-T dalle altre atassie cerebellari recessive. Per questo motivo in molti casi diventa difficile discriminare dal punto di vista diagnostico le due malattie e nel caso di pazienti negativi per A-T, ma con alfa-fetoproteina elevata, potrebbe risultare utile indagare sulla AOA2. Dal momento che il gene della SETX è composto da 24 esoni e quindi sarebbe piuttosto lungo eseguire un analisi del gene per tutti i soggetti A-T negativi, pensiamo di mettere a punto un indagine che sfrutta la sequenza del cdna dei pazienti.

6 Riassunto, risultati attesi e prospettive. I dati presentati confermano che l impiego e il miglioramento di diverse metodiche per l analisi delle mutazioni nel gene ATM ha permesso non solo di identificare nuove mutazioni, ma anche di caratterizzare grosse delezioni genomiche nel gene stesso, fino ad ora poco descritte proprio perchè difficili da individuare. Il miglioramento delle tecniche diagnostiche comprenderà anche lo studio dei pazienti A-T negativi, con particolare riferimento alle aprassie oculomotorie. Tali malattie presentano infatti diverse caratteristiche non solo cliniche ma anche biochimiche che rendono spesso difficile la diagnosi differenziale dei pazienti affetti da questi due tipi di atassie cerebellari. Pubblicazioni e Presentazioni a Congresso del gruppo proponente nel nel campo delle atassie ereditarie: Articoli 1. Brussino A, Gellera C, Saluto A, Mariotti C, Arduino C, Castellotti B, Camerlingo M, De Angelis V, Orsi L, Tosca P, Migone N, Taroni F, Brusco A. FMR1 gene premutation is a frequent genetic cause of late-onset sporadic cerebellar ataxia. Neurology 64: , 2005 (nel 2003 I.F , 3/135 Clinical Neurology). 2. Cutinho G, Xie J, Du L, Brusco A, Krainer AR, Gatti RA. Functional significance of a deep intronic mutation in ATM gene and evidence for a newly identified exon 28a. Hum Mutat 25: , 2005 (genetics & heredity I.F /115, nel 2003). 3. Cagnoli C, Stevanin G, Michielotto C, Gerbino Promis G, Brussino A, Pappi P, Durr A, Dragone E, Viemont M, Gellera C, Brice A, Migone N, Brusco A. Large pathogenic expansions in the SCA2 and SCA7 genes can be detected by fluorescent repeat-primed pcr assay. J Mol Diagn : , 2006 (nel 2004 I.F , 13/65 Pathology) 4. Cagnoli C, Mariotti C, Taroni F, Seri M, Brussino A, Michielotto C, Grisoli M, Di Bella D, Migone N, Gellera C, DiDonato S, Brusco A. SCA28, a novel form of autosomal dominant cerebellar ataxia on chromosome 18p11.22-q11.2. Brain : (clinical neurology I.F , 2/140 nel 2004) 5. Cavalieri S, Funaro A, Porcedda P, Turinetto V, Migone N, Gatti R, Brusco A. ATM Mutations In Italian Families With Ataxia Telangiectasia Include Two Distinct Large Genomic Deletions. Human Mutation 2006 Oct;27(10): 1061 (IF: in 2004,

7 genetics and heredity 12/120). Congressi 1. Brusco A, Cagnoli C, A, Mariotti C, Gellera C, Seri M, Brussino A, Michielotto C, Fancellu R, Di Bella D, Taroni F, Migone N, Di Donato S. Identification of the gene responsible for a novel form of autosomal dominant spinocerebellar ataxia. XII Convention Telethon, 6-8 marzo 2005 Salsomaggiore Terme. Abstract Mariotti C, Brusco A, Cagnoli C, A, Gellera C, Michielotto C, Fancellu R, Di Bella D, Migone N, Taroni F, Di Donato S. A novel form of dominant cerebellar ataxia characterized by slow progression and ophthalmoparesis. XV meeting of the European Neurological Society, June, 2005, Vienna, Austria. Published on Journal of Neurology, 252, suppl 2, Saluto A, Brussino A, Tassone F, Arduino C, Cagnoli C, Hagerman P, Migone N, Brusco A. An enhanced PCR assay to detect pre- and full mutation alleles of the FMR1 gene. VIII Congresso nazionale SIGU, Domus de Maria (CA), Settembre Cavalieri S, Funaro A, Porcedda P, Turinetto V, Pappi P, Migone N, Gatti R, Brusco A. Genomic rearrangements within the ATM gene account for ~10% of mutations in Italian A-T patients International workshop on Ataxia-Telangiectasia (A-T) and ATM, Banff (Canada), 8-12 September Cavalieri S, Funaro A, Porcedda P, Turinetto V, Pappi P, Migone N, Gatti RA, Brusco A. Novel Genomic rearrangements of ATM gene identified in Ataxia Telangiectasia Italian patients. 56th American Society of Human Genetics 2006 meeting, New Orleans (USA) 9-13 October Cagnoli C, Brussino A, Di Gregorio E, Dragone E, Ferrone M, Padovan S, Migone N, Brusco A. POLG1 gene mutations are not a common cause of sporadic ataxia in Italy. 56th American Society of Human Genetics 2006 meeting, New Orleans (USA) 9-13 October Fondi richiesti. Per lo svolgimento del progetto si richiede il finanziamento di euro che verrà utilizzato a parziale copertura del rinnovo di un assegno di ricerca a favore della Dott.ssa Simona Cavalieri.