Monitoring angiogenesis in tissue engineering through time-lapsed vascular imaging

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1 Diss. ETH No Monitoring angiogenesis in tissue engineering through time-lapsed vascular imaging A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by Laura Nebuloni MSc, Politecnico di Milano, Italy born 4 th December, 1984 citizen of Italy accepted on the recommendation of Prof. Dr. Ralph Müller, examiner Dr. Gisela Anna Kuhn, co-examiner Prof. Dr. Damien Lacroix, co-examiner 2013

2 Summary The complex network of blood vessels is responsible for carrying the necessary nutrients and oxygen to all cells of a living organism. When needed, new blood vessels can form through a process called angiogenesis or neovascularization. Under physiological conditions, this mechanism is under strict control of a number of factors, including the family of vascular endothelial growth factors (VEGF), angiopoietins (ANG) and fibroblast growth factors (FGFs). However, when the interaction between these factors is unbalanced, it could lead to either poor or excessive angiogenesis, which could result in the loss or even failure of tissues and organs. Several diseases are caused or characterized by pathological angiogenesis, such as tumors, Alzheimer s disease, atherosclerosis, diabetes, osteoporosis, obesity, and many more. Regenerative medicine or tissue engineering has nowadays emerged as a new field of science with the purpose of regenerating or reconstructing deaseased tissues. Tissue engineering strategies aim at replacing defective tissues with engineered substitutes. A major limitation of such tissue constructs is their limited or absent vascularization after implantation. Therefore, several approaches are currently being developed to induce angiogenesis in these biomaterials. High-resolution, three-dimensional, noninvasive imaging techniques are required to monitor this intrinsically time-dependent process. The available in vivo imaging modalities for the assessment of angiogenesis are based on Computed Tomography (CT), Magnetic Resonance Imaging (MRI), Positron Emission Tomography (PET), Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) and optical methods, which are lacking in resolution and/or spatial information. In vivo micro-computed tomography (micro-ct) demonstrated great abilities in imaging live biological processes. Therefore, it shows high potential for use in high-resolution time-lapsed vascular imaging and for the investigation of angiogenesis in vivo. The present thesis was developed to address the need of an adequate imaging method for angiogenesis. It was divided in the following aims: (i) development of an in vivo imaging method for time-lapsed quantification of the vasv

3 Summary cular network; (ii) monitoring of angiogenesis in applications of tissue engineering. In a first step, commercially available vascular contrast agents were tested in terms of imaging and pharmacokinetic properties. Only a nanoparticulated bloodpool formulation (Exitron T M nano 12000) provided all the necessary requirements for high-resolution in vivo micro-ct imaging: safety, strong blood enhancement, contrast stability, negligible extra-vascular leakage. A new method for time-lapsed vascular imaging was then developed using this contrast agent. The method allowed the quantification of the major and medium vessels of the network with standard morphometric analysis, and of the small vessels below resolution with a new approach based on a densitometric analysis of the contrast agent. The technique was found to be reproducible and robust. It also proved to be sensitive to vascular changes in an in vivo model for angiogenesis based on arterial occlusion. Correlations with histological analysis and with ex vivo ultra-high resolution micro-ct of vascular corrosion casts proved the accuracy of the method. The technique developed in the first aim of the thesis was then applied to monitor vascular ingrowth in an established model for tissue engineering. The model consisted of injecting a biomaterial based on fibrin gel, loaded with different concentrations of vascular endothelial growth factor (VEGF). Subsequently, the vascular density inside and outside the biomaterial was monitored with in vivo micro-ct over a period of 2 weeks. Different vascularization levels could be detected with this method and led to different degradation times of the biomaterial. In accordance with literature, high doses of VEGF led to the formation of aberrant vascular structures, while biomaterials that did not receive a minimum amount of VEGF did not show a significant integration within the surrounding tissues. In conclusion, this thesis revealed that in vivo micro-ct can be used to assess angiogenesis in a high-resolution, three-dimensional and non-invasive fashion. The results presented here underlined the finding that this novel imaging approach can provide useful information for the identification of correct biomaterial degradation properties and efficient pro-angiogenic strategies. vi

4 Sommario La complessa rete di vasi sanguigni è responsabile dell apporto dei nutrienti e dell ossigeno a tutte le cellule di un organismo vivente. Quando necessario, nuovi vasi possono essere formati attraverso un processo chiamato angiogenesi o neovascolarizzazione. In condizioni fisiologiche, questo meccanismo è sotto stretto controllo di diversi fattori, che includono la famiglia del fattore di crescita dell endotelio vascolare (VEGF), angiopoietine (ANG) e i fattori di crescita dei fibroblasti (FGF). Tuttavia, quando l interazione tra questi fattori è sbilanciata, essa può portare ad angiogenesi carente o eccessiva, che può risultare nella perdita di tessuti e organi. Diverse malattie sono causate o caratterizzate da angiogenesi patologica, come ad esempio i tumori, il morbo di Alzheimer, l aterosclerosi, il diabete, l osteoporosi, l obesità e tante altre. La medicina rigenerativa o ingegneria dei tessuti sta ad oggi emergendo come un nuovo settore scientifico con l obiettivo di rigenerare o ricostruire tessuti malati. Le strategie di ingegneria tissutale mirano a rimpiazzare tessuti difettosi con sostituti ingegnerizzati. Una grossa limitazione di questi costrutti è la loro scarsa o assente vascolarizzazione seguente all impianto. Di conseguenza, diversi approcci sono attualmente in fase di sviluppo per indurre l angiogenesi in questi biomateriali. Per monitorare questo processo intrinsecamente tempo-dipendente, sono necessarie tecniche di imaging ad alta risoluzione, tridimensionali e non-invasive. Le modalità di imaging in vivo al momento disponibili sono basate su Tomografia Computerizzata (CT), Risonanza Magnetica (MRI), Tomografia a Emissione di Positroni (PET), Tomografia Computerizzata a Emissione di Singoli Fotoni (SPECT) o sistemi ottici, che presentano carenze in termini di risoluzione e/o informazione spaziale. L utilizzo in vivo della micro-tomografia computerizzata (micro-ct) ha dimostrato grandi capacità nell osservazione di processi biologici viventi. Di conseguenza, essa mostra un alto potenziale per l impiego nell imaging vascolare ad alta risoluzione e per il monitoraggio dell angiogenesi in vivo. La presente tesi è stata sviluppata per affrontare il bisogno di un adeguato metodo di imaging dell angiogenesi. Il lavoro è vii

5 Sommario stato diviso nei seguenti obiettivi: (i) sviluppo di un metodo di imaging in vivo per la quantificazione temporale della rete vascolare; (ii) monitoraggio dell angiogenesi in applicazioni di ingegneria dei tessuti. Nella prima parte della tesi, diversi agenti di contrasto vascolare disponibili sul mercato sono stati testati in termini di proprietà di visualizzazione e farmacocinetiche. Solo il mezzo di contrasto basato su nano-particelle (ExiTron T M nano 12000) ha fornito tutti i requisiti necessari per l imaging vascolare ad alta risoluzione con micro-ct: non-citotossicità, stabilità e alti livelli di contrasto, perdite extravascolari trascurabili. Un nuovo metodo per l imaging vascolare è stato successivamente sviluppato utilizzando questo mezzo di contrasto. Questo metodo ha permesso la quantificazione dei maggiori vasi sanguigni attraverso analisi standard di morfometria, e dei vasi più piccoli al di sotto della risoluzione attraverso un nuovo approccio basato sull analisi della densità. I risultati hanno mostrato che la tecnica è riproducibile e robusta. Hanno inoltre mostrato che il metodo è sensibile a cambiamenti vascolari in un modello in vivo per l angiogenesi basato sull occlusione arteriosa. Le correlazioni con l analisi istologica e con l analisi ex vivo ad altissima risoluzione di riproduzioni della rete vascolare hanno dimostrato l accuratezza del metodo. La tecnica sviluppata nella prima parte della tesi è stata poi applicata per monitorare la crescita vascolare in un noto modello di ingegneria dei tessuti. In questo modello un biomateriale (gel fibrinico) è stato iniettato in vivo, con diverse concentrazioni di fattore di crescita dell endotelio vascolare (VEGF). Successivamente, la densità vascolare all interno e all esterno del biomateriale è stata monitorata con micro-ct in vivo per un periodo di 2 settimane. Con il metodo sviluppato è stato possibile individuare diversi livelli di vascolarizzazione del biomateriale, che hanno portato a diversi livelli di degradazione. In accordo con la letteratura scientifica, alte dosi di VEGF hanno condotto alla formazione di strutture vascolari aberranti, mentre i biomateriali che non avevano ricevuto nessun fattore di crescita non hanno mostrato una integrazione significativa con i tessuti circostanti. In conclusione, questa tesi ha rivelato che la micro-ct in vivo può essere utilizzata per valutare l angiogenesi ad alta risoluzione, in tre dimensioni e in modo non-invasivo. I risultati hanno evidenziato che questo nuovo approccio può fornire informazioni preziose per l identificazione di adeguate proprietà dei biomateriali e di efficienti strategie pro-angiogeniche. viii