LE FASI DELLA RICERCA

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1 LE FASI DELLA RICERCA 3 Prolungamento del processo di fermentazione in condizioni semiliquide (Di Cagno et al., 2002; Di Cagno et al., 2004); 4 Estensione della biotecnologia a varie materie prime (De Angelis e Di Cagno, 2010); 24 ore

2 Di Cagno et al., Proteolysis by sourdough lactic acid bacteria: effects on wheat flour protein fractions and gliadin peptides involved in human cereal intolerance. Applied and Environmental Microbiology, 68: Di Cagno et al., Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Applied and Environmental Microbiology, 70: Di Cagno et al., Pasta made from durum wheat semolina fermented with selected lactobacilli as a tool for a potential decrease of the gluten intolerance. Journal of Agricultural and Food Chemistry: 53 (11): De Angelis et al., 2006a. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsible for celiac sprue. Biochimica et Biophysica Acta, 1762: De Angelis et al., 2006b. Fermentation by selected sourdough lactic acid bacteria to decrease the intolerance to rye and barley flours. Journal of Cereal Science, 43: Gobbetti et al., Sourdough lactobacilli and celiac disease. Food Microbiology, 24(2): Rizzello et al., Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: new perspectives for celiac disease. Applied and Environmental Microbiology, 73(14): Di Cagno et al., Different fecal microbiotas and volatile organic compounds in treated and untreated children with celiac disease. Applied and Environmental Microbiology, 75(12): De Angelis et al., Mechanism of degradation of immunogenic gluten epitopes from Triticum turgidum L. var. durum by sourdough lactobacilli and fungal proteases. Applied and Environmental Microbiology, 76(2): Di Cagno et al., Gluten-free sourdough wheat baked goods appear safe for young celiac patients: a pilot study. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition, 51(6): Greco et al., Safety for patients with celiac disease of baked goods made of wheat flour hydrolyzed during food processing. Clinical Gastroenterology and Hepatology, 9(1): Di Cagno et al., Duodenal and faecal microbiota of celiac children: molecular, phenotype and metabolome characterization. BMC Microbiology, 11, Rizzello CG et al., Use of fungal proteases and selected sourdough lactic acid bacteria for making wheat bread with an intermediate content of gluten. Food Microbiology, 37; Curiel JA et al., Manufacture and characterization of pasta made with wheat flour rendered gluten-free using fungal proteases and selected sourdough lactic acid bacteria. Journal of Cereal Science, 59;79-87.

3 Pool 1 (ca. log 9/ml) St 1 2 Lb. brevis 14G Lb. alimentarius 15M Lb. hilgardii 51B Lb. sanfranciscensis 7A Pool 2 + (ca. log 8/ml) ϖ -gliadins α, β, ϖ -gliadins Lb. sanfranciscensis E14 Lb. sanfranciscensis E21 Lb. sanfranciscensis 174 Lb. sanfranciscensis 13 Lb. sanfranciscensis A1 Lb. sanfranciscensis Proteasi fungine (200 ppm) (CAD) Alb.-Glob. Glutenins Gliadins hydrolized gliadins (SLP) Glutenins Water salt soluble St, European gliadin standard; 1, chemically acidified dough (CAD); 2, fermented dough (20% wheat flour) with pool 1, 2 and proteases (SLP) R5-ELISA SLP < 10 ppm

4 (A) (B) Mr ph 6 ph 11 ph 6 ph 11 kda Tipico profilo della gliadina St, Standard Europeo della gliadina 1, CAD 2, Lattobacilli selezionati e proteasi % Intensità (St) α, β, γ ω α β,γ (1) α β,γ ω (2) (2) Massa (m/z) (2) ω

5 CURVA TEMPORALE DEL PROGETTO DI RICERCA -Lactobacillus sanfranciscensis DPPMA12 (depositato presso il DSMZ in data 28 Novembre 2008 con N. DSM22063); Glutine residuo (ppm) -Lactobacillus plantarum DPPMA125 (depositato presso il DSMZ in data 28 Novembre 2008 con N. DSM22064). Brevetto Giuliani RM2008A Tempo (anni)

6 Proteolisi durante la lievitazione naturale Enzimi esogeni gliadine LMW glutenine y-hmw glutenine x-hmw glutenine Prodotti di degradazione peptide Ψredox - ph Proteolisi primaria PepQ + alkaline - acid Enzimi endogeni DtpT Opp PepX PepP PepO PepN H + Amminoacidi Proteolisi secondaria

7 APPROCCI TERAPEUTICI FUTURI PER LA PATOLOGIA CELIACA Target Peptidi del glutine Zonulina Agente terapeutico Prolyl endopeptidasi (PEP) Antagonista del recettore della zonulina (AT-1001) Interleuchina 15 Peptidi del glutine Transglutamminasi tissutale Anticorpo anti-interleuchina-15 Lattobacilli del lievito naturale Inibitore della transglutamminasi tissutale HLA-DQ2/DQ8 Cellule dendritiche DQ2/DQ8 Vaccino Interferon-γ Cellule T Cellule T (Tr) Molecole di adesione Anticorpo anti-interferon-γ (fontolizumab) Anticorpo Anti CD3 (visilizumab) Anticorpo anti-cd24 (cm-t412) Anticorpo anti-cd25 (daclizumab) Interleuchina-10 umana ricombinante (Tenovil) Anticorpo anti-integrina α4 (natalizumab) anti-integrina α4/β7 (MLN-02) Antagonista α4 (T-0047)

8 TEST IN VITRO 24 ore Glutine Prolammine idrolizzate Impasto di farina di frumento fermentato con batteri lattici «PT- DIGEST» Digestione enzimatica in vitro Test in vitro su diversi modelli cellulari Impasto di farina di frumento acidificato chimicamente (lievito di birra)-controllo Glutine Prolammine non idrolizzate

9 In cellule IEC-6 (cellule epiteliali intestinali di ratto) esposte a In prolammine cellule epiteliali non idrolizzate intestinali Evidente Riduzione Rispetto Balb/c estratte si al riduzione da assiste dell espressione trattamento un impasto all attenuazione dell attività con della acidificato della proteina prolammine della Caspasi chimicamente permeabilità FAS non (il 3 in cui idrolizzate cellule aumento (controllo), intestinale è da responsabile estratte epiteliali parte In cellule prolammine delle da intestinali un cellule dell atrofia impasto epiteliali idrolizzate trattate Caco-2 acidificato dei intestinali dal con villi) pool in chimicamente esposte gliadine biopsie a Balb/c batteri pre-digerite prolammine pazienti (A), biopsie si assiste lattici aduna e dalle nell impasto celiaci idrolizzate riduzione proteasi digiunali esposte dal fermentato pool a di di prolammine batteri pazienti del rilascio fungine, di inducono i batteri lattici celiaci idrolizzate e zonulina da una lattici dalle parte esposte dal proteasi selezionati pool a di fungine prolammine batteri delle riorganizzazione (De Angelis (LAB lattici PT cellule trattate con meno et idrolizzate e al., rye) dalle 2006a); gliadine dal proteasi rispetto pool alle di fungine batteri prolammine (B) lattici rispetto e non dalle pre-digerite pronunciata nell impasto dell F-actina proteasi prolammine idrolizzate fungine estratte non (B) idrolizzate da non un hanno impasto fermentato intracellulare con i batteri (De Angelis lattici et al., indotto estratte acidificato un da chimicamente aumento un impasto delle acidificato (PT rye) selezionati 2006a). (De Angelis et al., 2006a); (De infiltrazioni chimicamente Angelis et dei al., (A) 2006b). linfociti (De Angelis et al., intraepiteliali 2006b). CD3 + (De Angelis et al., 2006a). RILASCIO DI ZONULINA TEST IN VITRO ESPRESSIONE PROTEINA FAS INFILTRAZIONE LINFOCITI CD3+ RIORGANIZZAZIONE VITALITA CELLULAREF-ACTINA PERMEABILITA INTESTINALE ATTIVITA DELLA CASPASI 3 Aumento della vitalità cellulare in cellule epiteliali intestinali Caco- 2 trattate con gliadine idrolizzate nell impasto fermentato con i batteri lattici selezionati (De Angelis et al., 2006b).

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