SOSTANZE D ABUSO BASICHE

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1 SSTANZE D ABUS BASICHE in matrice cheratinica in GC-MS Cod. GC49010 (Morfina, Codeina, Diidrocodeina, 6-MAM, Etilmorfina, Cocaina, BEG, Cocaetilene, Amfetamina, Metamfetamina, MDA, MDMA, MDE, MBDB, Metadone, EDDP, Buprenorfina) Metodo di conferma in GC-MS INTRDUZINE Nei primi anni 80 iniziarono una serie di studi sulla possibilità di determinare sostanze d abuso nella matrice cheratinica e quindi utilizzare l analisi dei capelli come strumento per individuare l uso pregresso di tali sostanze. Una volta incorporate nel capello, sia dalla circolazione sistemica, che dal contributo del sudore e del sebo, le sostanze d abuso rimangono sequestrate nella matrice cheratinica in maniera stabile nel tempo in funzione della loro lipofilicità, del peso molecolare, della pka e dell ingombro sterico. L analisi delle sostanze d abuso in matrice cheratinica è un addendum ideale all analisi del sangue o delle urine in quanto fornisce informazioni riguardanti una finestra di tempo precedente a quella coperta dalle altre matrici biologiche e si riferisce ad uno spazio temporale più ampio (uno o più mesi) in funzione della lunghezza del capello. Considerando infatti una crescita media di 1 cm/mese, è possibile conoscere la storia del consumo passato analizzando il capello segmentato per cm o per frazioni o multipli di cm. E anche possibile evidenziare contaminazioni esterne effettuando l esame dei solventi di lavaggio confrontandoli con i risultati ottenuti dal capello digerito. La ricerca di sostanze d abuso nei capelli può essere utilizzata per provare un uso, un abuso e un misuso protratto nel tempo, per caratterizzarne l intensità e la sua storia e fornire quindi dati analitici con valore medico-legale. Per questo motivo la determinazione nei capelli può essere richiesta in caso di: morti correlate all uso di sostanze d abuso, valutazione della inidoneità alla guida, responsabilità criminali, affidamento custodia dei minori, esposizione prenatale a sostanze d abuso ed infine quale conferma di un consumo sporadico o di una dipendenza nei lavoratori con mansioni a rischio. I test immunochimici possono essere utilizzati come metodi iniziali al fine di analizzare in poco tempo un gran numero di campioni in maniera economica, efficace e standardizzata e di escludere i campioni che risultano negativi, ossia i campioni che non contengono la sostanza o la classe di sostanze oppure quelli in cui la concentrazione è al di sotto di un valore soglia (cut-off). 1

2 Le analisi di conferma sono definite come quelle analisi che servono a verificare le false positività dovute alla non specificità dei test di screening. Nel caso della matrice cheratinica, poiché non esistono veri e propri test di screening non si può parlare di vere e proprie analisi di conferma. La Society of Hair Testing (SHT) raccomanda l utilizzo di metodologie separative cromatografiche accoppiate alla rivelazione in spettrometria di massa per la determinazione di sostanze d abuso in matrice cheratinica a fini medico-legali e/o clinici. Tenendo inconsiderazione le linee guida della SHT, il presente metodo consente di determinare tutte le sostanze d abuso basiche (6-MAM, Morfina, Codeina, Etilmorfina, Diidrocodeina, Cocaina, BEG, Cocaetilene, Amfetamina, Metamfetamina, MDA, MDMA, MDE, MBDB, Metadone, Buprenorfina, EDDP) previa estrazione di tali molecole dalla matrice cheratinica (capelli o peli) e successiva estrazione in fase solida su colonna (SPE) degli analiti di interesse (per eliminare la presenza di interferenti della matrice complessa) e determinazione in Gas Cromatografia/spettrometria di massa (GC/MS). EUREKA srl LAB DIVISIN VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

3 Principio del metodo : CARATTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare la Morfina, la Codeina, la Diidrocodeina, la 6-Monoacetilmorfina, l Etilmorfina, la Cocaina, la Beg, la Cocaetilene, il Metadone, l Amfetamina, la Metamfetamina, l MDMA, l MDA, l MDE, l MBDB, la Buprenorfina, l EDDP previa idrolisi della matrice cheratinica, estrazione SPE e lettura in GC-MS. Il metodo è stato validato secondo i criteri stabiliti a livello internazionale dalla FDA e dall ICH. ANALITA Accuratezza intra-giorno Precisione inter-giorno Accuratezza inter-giorno (Errore %) (CV%) (Errore %) Calibratore Calibratore Calibratore Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore AMFETAMINA 5,51 7,82 3,51 28,1 19,07 15,87 20,61 21,29 10,78 METAMFETAMINA 7,41 4,94 2,37 13,26 19,07 11,96 19,51 12,64 7,49 3,4-MDMA 22,27 11,79 4,96 16,5 15,46 9,39 26,33 16,42 10,88 3,4- MDA 5,17 6,2 4,13 21,63 14,83 8,13 28,55 13,16 12,76 3,4-MDE 18,07 5,54 1,88 28,05 5,81 11,44 28,59 4,58 6,93 BENZILECGNINA 11,48 47,4 46,97 14,21 10,74 8,91 11,46 14,3 16,74 CCAETILENE 25,64 3,52 6,49 28,23 7,2 8,4 26,84 6,5 6,77 CCAINA 22,48 6,5 1,84 16,46 11,51 3,73 17,57 7,88 3,07 MRFINA 14,43 35,8 39,38 23,91 16,64 10,07 24,09 22,75 17,53 6-MAM 26,35 16,83 13,05 31,37 13,68 11,88 34,85 12,48 10,54 ETILMRFINA 26,39 10,24 4,06 27,36 10,14 8,97 29,36 8,04 7,47 CDEINA 24,95 8,36 8,55 24,16 12,51 9,92 26,25 15,74 7,76 DIIDRCDEINA 14,45 3,98 9,75 27,26 11,42 10,57 25,75 6,57 9,06 METADNE 7,05 8,78 2,91 10,52 10,67 9,17 9,72 10,04 7,34 EDDP 24,52 27,91 7,26 17,7 14,79 20,63 21,07 27,32 12,33 BUPRENRFINA 36,18 19,84 29,62 51,99 48,11 25,87 22,41 18,4 13,91 ANALITA (Coefficiente di correlazione R2) + deviazione standard LD (ng/mg) LQ (ng/mg) AMFETAMINA 0,9990 ± 0,0011 0,07 0,1 METAMFETAMINA 0,9990 ± 0,0011 0,07 0,1 3,4-MDMA 0,9992 ± 0,0009 0,07 0,1 3,4- MDA 0,9997 ± 0,0002 0,08 0,1 3,4-MDE 0,9985 ± 0,0029 0,07 0,1 BENZILECGNINA 0,9997 ± 0,0006 0,05 0,1 CCAETILENE 0,9999 ± 0,0002 0,07 0,1 CCAINA 1,0000 ± 0,0000 0,05 0,1 MRFINA 0,9933 ± 0,0052 0,05 0,1 6-MAM 0,9985 ± 0,0021 0,08 0,1 ETILMRFINA 0,9969 ± 0,0023 0,05 0,1 CDEINA 0,9892 ± 0,0113 0,07 0,1 DIIDRCDEINA 0,9976 ± 0,0037 0,05 0,1 METADNE 0,9999 ± 0,0001 0,06 0,1 EDDP 0,9973 ± 0,0021 0,08 0,1 BUPRENRFINA 0,9982 ± 0,0024 0,02 0,04 3

4 ANALITA Recupero (%) Calibratore Inferiore Medio Superiore AMFETAMINA 70,43 104,19 90,16 METAMFETAMINA 111,89 98,25 85,11 3,4-MDMA 82,65 86, ,4- MDA 82,58 90,88 81,08 3,4-MDE 78,14 81,69 104,69 BENZILECGNINA 90,24 74,37 77,02 CCAETILENE 65,96 76,91 84,56 CCAINA 90,36 85,2 93,16 MRFINA 92,86 98,03 91,56 6-MAM 42,81 33,31 30,73 ETILMRFINA 85,55 74,03 77,4 CDEINA 56,28 59,9 50,71 DIIDRCDEINA 78,26 86,84 92,34 METADNE 78,08 68,71 83,87 EDDP 74,26 53,41 51,63 BUPRENRFINA 89,56 95,14 88,64 La tabella sottostante riporta, per ogni analita, le concentrazioni corrispondenti ai Calibratori i cui valori Inferiore, Medio e Superiore citati sopra fanno riferimento. ANALITA Concentrazione (ng/mg) Calibratore Inferiore Medio Superiore AMFETAMINA 0, METAMFETAMINA 0, ,4-MDMA 0, ,4- MDA 0, ,4-MDE 0, BENZILECGNINA 0, CCAETILENE 0, CCAINA 0, MRFINA 0, MAM 0, ETILMRFINA 0, CDEINA 0, DIIDRCDEINA 0, METADNE 0, EDDP 0, BUPRENRFINA 0,

5 Valore di cut-off : ppiacei, Amfetamine, Cocaina, Metadone: BEG, Buprenorfina: 0.2 ng/mg 0.05 ng/mg Rif. Gazzetta Ufficiale n ott 2008 Contenuto della Confezione (50 test) : Reagente A Soluzione Diluente, 2 x 10 ml Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Reagente B Soluzione Tampone, 1 x 100 ml Reagente C Soluzione Condizionamento 1 e Lavaggio 3, 1 x 250 ml Reagente D Soluzione Condizionamento 2, 1 x 100 ml Reagente E Soluzione Eluente, 1 x 100 ml Reagente F Soluzione Lavaggio 1, 1 x 100 ml Reagente G Soluzione Lavaggio 2, 1 x 100 ml Reagente H Soluzione di Derivatizzazione 1 per Amfetamine, 1 x 5 ml Reagente I Soluzione di Derivatizzazione 2 per Amfetamine, 1 x 5 ml Reagente L Soluzione Test Amfetamine, 1 x 1 ml Vedi Avvertenze - Per il prelievo del Reagente M, utilizzare la siringa Hamilton da 100 ul Cod. Z81000 Vedi Avvertenze - Per il prelievo del Reagente M, utilizzare la siringa Hamilton da 50 ul Cod. Z80500 Vedi Avvertenze Reagente N Soluzione Test ppiacei, Metadone, Cocaina, Buprenorfina e metaboliti 1 x 0,5 ml Reagente M Soluzione Derivatizzante, 3 x 1 ml (3 ampolle da 1 ml) Reagente Soluzione Standard Interno per Sostanze Basiche, 1 x 2 ml Reagente P Soluzione Standard Interno per Amfetamine, 1 x 2 ml Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze - Per il prelievo del Reagente M, utilizzare la siringa Hamilton da 100 ul Cod.Z81000 Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Reagente Q Soluzione Estraente, 1 x 50 ml Reagente R Soluzione Lavaggio del capello, 1 x 250 ml Reagente S - Capello bianco, 1 x 1500 mg Reagente T1 Sol. Standard Chimico 1, 1 x 400 µl Reagente T2 Sol. Standard Chimico 2, 1 x 400 µl Reagente T3 Sol. Standard Chimico 3, 1 x 400 µl Reagente U Standard Chimico per MBDB, 1 x 5 ml Colonnine Clean-up, 50 pz Non fornito nel kit. Prodotto vendibile a parte, codice Z

6 Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Modalità di prelievo dei capelli : Modalità di prelievo del pelo : Strumento GC-MS Computer gestionale Autocampionatore Lunghezza raccomandata: 5 cm, partendo dal cuoio capelluto. Viene recisa una ciocca, non strappata (il bulbo non ha nessuno scopo al fine dei presenti accertamenti) nella regione del vertice posteriore del capo, di almeno 200 mg che viene suddivisa in 2 aliquote di simile peso (A e B) di ognuna delle quali viene fissata l estremità prossimale. Tali aliquote vengono inserite in contenitori separati non trasparenti recanti tappi a chiusura ermetica e sigillati con nastro inamovibile e conservati a temperatura ambiente. Il taglio del capello deve essere eseguito con forbici pulite con una piccola quantità di alcol e ben asciutte. E necessario tagliare 200 mg di peli dalla regione pubica; i peli così raccolti vengono suddivisi in due aliquote (A e B). 6

7 PRCEDURA PREANALITICA per tutte le sostanze d abuso basiche ad ECCEZINE delle AMFETAMINE: FASE 1 : In una provetta di vetro con tappo a vite in teflon pipettare : 50 µl di Reagente N Soluzione Test ppiacei, Metadone, Cocaina, Buprenorfina e metaboliti FASE 2 : Portare a secco con l ausilio di un flusso di elio o di azoto (in questo step la Temperatura di lavoro deve essere < 40 C ) FASE 3 : Riprendere con 70 µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante utilizzando l apposita siringa Hamilton da 100 µl (cod. Z81000) FASE 4 : Porre in stufa a 70 C per 20 minuti Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Al vortex per 20 secondi Raffreddare a Temperatura ambiente Aprire la provetta di vetro FASE 5 : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume per autocampionatore NTA: Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 1 µl di questa soluzione appena preparata nel Gas Cromatografo per identificare il tempo di ritenzione e lo spettro di massa di tutte le sostanze basiche che devono essere simili a quelli riportati nelle Figure sottostanti. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PRCEDURA PREANALITICA per le AMFETAMINE: FASE 1 : In una provetta di vetro con tappo in teflon a vite pipettare : 100 µl di Reagente L Soluzione Test Amfetamine FASE 2 : Portare a secco con l ausilio di un flusso elio o azoto (in questo step la Temperatura di lavoro deve essere < 40 C) FASE 3 : Riprendere con 100 µl di Reagente H - Soluzione di Derivatizzazione 1 per Amfetamine utilizzando l apposita siringa Hamilton da 100 µl (cod. Z81000) Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Al vortex per 20 secondi FASE 4: Porre in stufa a 80 C per 5 minuti Raffreddare a Temperatura ambiente Aprire la provetta di vetro Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

8 FASE 5 : Aggiungere 30 µl di Reagente I - Soluzione di Derivatizzazione 2 per Amfetamine utilizzando l apposita siringa Hamilton da 50 µl (cod. Z80500) FASE 6: Porre in stufa a 80 C per 5 minuti Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Al vortex per 20 secondi Raffreddare a Temperatura ambiente Aprire la provetta di vetro FASE 7 : Trasferire tutto il campione in vials di vetro con riduttore di volume per autocampionatore NTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 1 µl di questa soluzione appena preparata nel Gas Cromatografo per identificare il tempo di ritenzione e lo spettro di massa delle amfetamine che devono essere simili a quelli riportati nelle Fig. sottostanti. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. N.B.: si consiglia di utilizzare siringhe differenti per i Reagenti di derivatizzazione H/I e per il Reagente M. Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

9 PRCEDURA ANALITICA: A) PREPARAZINE dei Campioni incogniti FASE 1 : Lavare i capelli/peli integri dentro una provetta di vetro da 10 ml con 2 ml di Reagente R Soluzione Lavaggio del capello Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Vortexare per 1 minuto Centrifugare a rpm per 5 minuti Aprire la provetta di vetro FASE 2 : Portare a secco il solvente con l ausilio di un leggero flusso di elio o di azoto ponendo attenzione a far rimanere il capello/pelo sul fondo della provetta. In alternativa prelevare, con una pinza pulita con Acetone (non fornito nel kit), il capello/pelo dalla provetta ed appoggiarlo su carta assorbente finché non è completamente asciutto. In questo ultimo caso la carta assorbente va cambiata per ogni campione. Ripetere le Fasi 1 e 2 per due volte consecutive FASE 3 : Tagliare i capelli/peli, lavati ed asciugati, in segmenti di 1-2 cm con forbici pulite con Acetone (non fornito nel kit) FASE 4 : Pesare un aliquota di campione, compresa tra 20 e 50 mg a seconda della disponibilità del campione, in una provetta di vetro in pyrex con tappo a vite pulita e precedentemente denominata. Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

10 B) PREPARAZINE dei CALIBRATRI SU 5 LIVELLI Preparazione degli Standard Chimici per gli arricchimenti successivi: Preparare 6 provette di vetro, denominarle 1 A; 1 B; 2 A; 2 B; 3 A; 3 B e diluirvi ogni singolo Standard Chimico (T1-T2-T3) con Reagente A Soluzione Diluente come riportato nella tab. sotto: Provette 1 A 1 B 2 A 2 B 3 A 3 B Reagente T1 Sol. Standard Chimico 1 Reagente T2 Sol. Standard Chimico 2 Reagente T3 Sol. Standard Chimico 3 Reagente A Sol. Diluente 30 µl // // 120 µl 10 µl // // 490 µl // 30 µl // 120 µl // 1 µl // 490 µl // // 30 µl 120 µl // // 1 µl 490 µl Chiudere le provette con il tappo Vortexare per 1 minuto Preparare 5 provette di vetro da 10 ml denominate C0-C1-C2-C3-C4. Aggiungere in ciascuna provetta (C0-C1-C2-C3-C4) gli standard chimici appena preparati (1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B) facendo riferimento alla tabella riportata sotto: Calibratore C0 Calibratore C1 Calibratore C2 Calibratore C3 Calibratore C4 50 µl di Reagente A Sol. Diluente 25 µl di 1 B 50 µl di 1 B 25 µl di 1 A 50 µl di 1 A 50 µl di Reagente A Sol. diluente 25 µl l di 2 B 50 µl di 2 B 25 µl di 2 A 50 µl di 2 A 50 µl di Reagente A Sol. diluente 10 µl di 3 B 25 µl di 3 B 50 µl di 3 B 25 µl di 3 A Portare a secco ogni calibratore appena preparato con l ausilio di un flusso elio o azoto (in questo step la Temperatura di lavoro deve essere < 40 C). Aggiungere ad ogni provetta dei calibratori C0-C1-C2-C3-CA appena portate a secco, 50 mg di Reagente S Capello bianco (fornito nel kit). Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

11 A questo punto i Calibratori su 5 punti sono pronti e le concentrazioni da utilizzare per la curva di calibrazione saranno: Analita Calibratore C0 Calibratore C1 Calibratore C2 Calibratore C3 Calibratore C4 Buprenorfina Morfina, Codeina, Diidrocodeina, 6- MAM, Etilmorfina, Cocaina, Beg, Cocaetilene, Amfetamina, Metamfetamina, MDA, MDE, MDMA, Metadone, EDDP 0 ng/mg 0.2 ng/mg 0.5 ng/mg 1 ng/mg 5 ng/mg 0 ng/mg 0.5 ng/mg 1 ng/mg 5 ng/mg 10 ng/mg Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

12 C) PREPARAZINE DEGLI STANDARD INTERNI Il Reagente Sol Standard interno per Sostanze Basiche ed il Reagente P Sol. Standard interno per Amfetamine forniti nel kit vanno diluiti 1:10 con acqua prima di ogni utilizzo, nella quantità necessaria per l intera seduta analitica. ES. per una seduta analitica con 20 campioni incogniti e 5 calibratori sono necessari 625 µl di ogni Standard Interno diluito (Reagente -diluito e Reagente P-diluito). Pertanto si prelevano 62.5 µl di Reagente Sol Standard interno per Sostanze Basiche e 62.5 µl di Reagente P Sol. Standard interno per Amfetamine e si diluiscono rispettivamente con µl di H 2 in due provette di vetro. Al vortex per almeno 10 sec. Le soluzioni sono ora pronte per l uso. Il Reagente Sol Standard interno per Sostanze Basiche ed il Reagente P Sol. Standard interno per Amfetamine non diluiti e non utilizzati si richiudono ermeticamente e si conserva la quantità residua in congelatore a -20 C. Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

13 D) DIGESTINE DELLE MLECLE DAL CAPELL/PEL FASE 5 : In ogni tubo precedentemente preparato (FASE A e FASE B) dispensare: Reagente diluito - (Sol. Std interno x Sostanze BASICHE diluito come indicato nella FASE C) Reagente P diluito - (Sol. Std interno x Amfetamine diluito come indicato nella FASE C) Reagente Q - Sol. Estraente Calibratore C0 (preparato nella Fase B) Calibratore C1 (preparato nella Fase B) Calibratore C2 (preparato nella Fase B) Calibratore C3 (preparato nella Fase B) Calibratore C4 (preparato nella Fase B) Controlli Campioni (preparati nella Fase A) 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl Chiudere ermeticamente le provette con il tappo Agitare delicatamente senza capovolgere le provette per 10 secondi FASE 6 : Porre in stufa a 45 C per 18 ore Raffreddare a Temperatura ambiente. Aprire la provetta di vetro FASE 7 : Aggiungere ad ogni provetta 2 ml di Reagente B - Sol. Tampone Controllare che il ph sia = con cartine indicatrici di ph (immergere la punta di una pipetta pasteur o di un puntale nel tubo; utilizzare una pipetta diversa per ogni tubo). Nel caso eventuale che il ph non sia corretto, si possono effettuare delle correzioni con circa 170 µl di Idrossido di Potassio 0.1 M e circa 30 µl di Idrossido di Potassio 2 M miscelando e ricontrollando il ph dopo ogni aggiunta. Eventualmente correggerlo aggiungendo altri µl di Idrossido di Potassio 0.1 M. Chiudere le provette e vortexare per 1 minuto Centifugare a rpm per 5 minuti Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

14 E) ESTRAZINE DEGLI ANALITI FASE 8 : Condizionamento delle colonnine SPE Preparare un numero di colonnine corrispondenti alla somma dei calibratori, controlli e campioni incogniti Aggiungere 1,5 ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento 1 e Lavaggio 3 Far passare in colonnina e scartare l eluato senza portare a secco la colonnina Aggiungere 2 ml di Reagente D Soluzione di Condizionamento 2 Far passare in colonnina e scartare l eluato senza portare a secco la colonnina FASE 9 : Aggiungere tutto il surnatante dei calibratori, controlli e campioni incogniti, preparati nelle fasi 5-7, nelle colonnine condizionate e scaricare ad un flusso di 1 ml/ minuto (goccia a goccia) anche con l ausilio di un vuoto moderato. FASE 10 : Lavaggio delle colonne SPE Lavare con 2 ml di Reagente F Soluzione di Lavaggio 1 Far passare in colonnina e scartare l eluato Lavare con 2 ml di Reagente G Soluzione di Lavaggio 2 Far passare in colonnina e scartare l eluato Lavare con 2 ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento 1 e Lavaggio 3 Far passare in colonnina e scartare l eluato portando a secco con un leggero flusso d aria Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

15 F) ELUIZINE e DERIVATIZZAZINE DEGLI ANALITI Eluire rigorosamente in provette di vetro in pyrex con tappo SI DISTINGUN 3 CASI: 1) Nel caso in cui il campione è risultato positivo allo screening solamente per la classe delle Amfetamine: Eluire con 1 ml di Reagente E Soluzione Eluente Portare a secco con un leggero flusso d aria Raccogliere l eluato su provette in pyrex con tappo a vite Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso di elio o di azoto (in questo step la Temperatura di lavoro deve essere < 40 C) Derivatizzazione: Aggiungere in ogni provetta 100 µl di Reagente H Soluzione di Derivatizzazione 1 per Amfetamine utilizzando l apposita siringa Hamilton da 100 µl (cod. Z81000) Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Porre in stufa a 80 C x 5 min Raffreddare a temperatura ambiente Aprire la provetta di vetro Aggiungere 30 µl di Reagente I Soluzione di Derivatizzazione 2 per Amfetamine utilizzando l apposita siringa Hamilton da 50 µl (cod. Z80500) Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Porre in stufa a 80 C x 5 min Raffreddare a temperatura ambiente Aprire la provetta di vetro Iniezione: Trasferire il derivatizzato nelle vial con riduttore di volume ed iniettare 1 µl nel Gascromatografo. 2) Nel caso in cui il campione è risultato positivo allo screening solamente per la classe degli ppiacei, Metadone, Cocaina, Buprenorfina: Eluire con 1 ml di Reagente E Soluzione Eluente Portare a secco con un leggero flusso d aria Raccogliere l eluato su provette in pyrex con tappo a vite Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso di elio o di azoto (in questo step la Temperatura di lavoro deve essere < 40 C) Derivatizzazione: Aggiungere in ogni provetta 70 µl di Reagente M Soluzione Derivatizzante utilizzando l apposita siringa Hamilton da 100 µl (cod. Z81000) Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

16 Porre in stufa a 70 C x 20 min Raffreddare a temperatura ambiente Aprire la provetta di vetro Iniezione: Trasferire il derivatizzato nelle vial con riduttore di volume ed iniettare 1 ul nel Gascromatografo. 3) Nel caso in cui il campione è risultato positivo allo screening sia per la classe delle Amfetamine sia per le altre classi di Sostanze d Abuso: Eluire con 1 ml di Reagente E Soluzione Eluente Portare a secco con un leggero flusso d aria Raccogliere l eluato su provette di vetro e vortexare per 10 secondi, poi dividere in due aliquote (500 µl µl) in due provette in pyrex con tappo a vite pulite. Portare a secco le due aliquote con l ausilio di un flusso di elio o di azoto (in questo step la Temperatura di lavoro deve essere < 40 C) Derivatizzazione aliquota amfetamine: Aggiungere, in ogni provetta dedicata all aliquota per le Amfetamine, 50 µl di Reagente H Soluzione di Derivatizzazione 1 per Amfetamine utilizzando l apposita siringa Hamilton da 100 µl (cod. Z81000) Porre in stufa a 80 C x 5 min Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Raffreddare a temperatura ambiente Aprire la provetta di vetro con il tappo Aggiungere 15 µl di Reagente I Soluzione di Derivatizzazione 2 per Amfetamine utilizzando l apposita siringa Hamilton da 50 µl (cod. Z80500) Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Porre in stufa a 80 C x 5 min Raffreddare a temperatura ambiente Aprire la provetta di vetro con il tappo Iniezione: Trasferire il derivatizzato nelle vial con riduttore di volume ed iniettare 1 µl nel Gascromatografo. Derivatizzazione aliquota altre classi di Sostanze d Abuso: Aggiungere, in ogni provetta dedicata all aliquota per le Sostanze basiche, 35 µl di Reagente M Soluzione Derivatizzante utilizzando l apposita siringa Hamilton da 100 µl (cod. Z81000) Porre in stufa a 70 C x 20 min Chiudere ermeticamente la provetta con il tappo Raffreddare a temperatura ambiente Aprire la provetta di vetro Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

17 Iniezione: Trasferire i derivatizzati nelle vial con riduttore di volume ed iniettare 1 µl nel Gascromatografo. NB: in questo modo la sensibilità analitica risulterà aumentata rispetto a quella ottenuta negli step 1 e 2 del punto F. CNSIDERAZINI GENERALI sul CALCL QUANTITATIV dei CAMPINI INCGNITI Il calcolo dei campioni incogniti viene eseguito in funzione dell equazione ottenuta per la curva di calibrazione dove si riporta sull asse delle ascisse la concentrazione in ng/mg e sull asse delle ordinate il rapporto tra le aree dell analita/standard interno. Per il calcolo della concentrazione in ng/mg capello/pelo nel caso dei campioni incogniti, si ricorda che una volta ottenuto il valore di concentrazione sulla retta, esso va moltiplicato per i mg di capello/pelo con cui si è costruita la retta di calibrazione (50 mg) e diviso per il peso effettivo del campione in esame (es. 20 mg qualora si sia pesata questa quantità di capello/pelo). Release N 003 Sostanze d Abuso in matrice cheratinica Gennaio

18 SSTANZE D ABUS in matrice cheratinica - Avvertenze REAGENTE N: SLUZINE TEST PPIACEI, METADNE, CCAINA, BUPRENRFINA E METABLITI Morfina Codeina 6-Monoacetilmorfina Etilmorfina Diidrocodeina Metadone BEG Cocaetilene Cocaina Buprenorfina EDDP Conservazione: Una volta aperta la vial, prelevarne il volume necessario, richiuderla con il reagente non utilizzato e conservare a -20 C. Circa ng/ml REAGENTE L: SLUZINE TEST AMFETAMINE Amfetamina Metamfetamina MDA MDMA MDE Conservazione: Una volta aperta la vial, prelevarne il volume necessario, richiuderla con il reagente non utilizzato e conservare a -20 C. Circa ng/ml REAGENTE T1: SLUZINE STANDARD CHIMIC 1 Amfetamina Metamfetamina MDA MDMA MDE Cocaina Cocaetilene Morfina Etilmorfina Codeina Diidrocodeina Metadone Conservazione: Una volta aperta la vial, prelevarne il volume necessario, richiuderla con il reagente non utilizzato e conservare a -20 C ng/ml REAGENTE T2: SLUZINE STANDARD CHIMIC 2 Benzoilecgonina 6-Monoacetilmorfina EDDP Conservazione: Una volta aperta la vial, prelevarne il volume necessario, richiuderla con il reagente non utilizzato e conservare a -20 C ng/ml REAGENTE T3: SLUZINE STANDARD CHIMIC 3 Buprenorfina Conservazione: Una volta aperta la vial, prelevarne il volume necessario, richiuderla con il reagente non utilizzato e conservare a -20 C ng/ml 18

19 REAGENTE H: SLUZINE DERIVATIZZANTE 1 PER AMFETAMINE Una volta aperta un ampolla trasferire tutto il contenuto, 1 ml, in una vial di vetro. Chiudere bene il tappo e conservare a 2-8 C. REAGENTE I: SLUZINE DERIVATIZZANTE 2 PER AMFETAMINE Una volta aperta un ampolla trasferire tutto il contenuto, 1 ml, in una vial di vetro. Chiudere bene il tappo e conservare a 2-8 C. REAGENTE M: SLUZINE DERIVATIZZANTE Una volta aperta un ampolla trasferire tutto il contenuto, 1 ml, in una vial di vetro. Chiudere bene il tappo e conservare a 2-8 C. REAGENTE : SLUZINE STANDARD INTERN PER SSTANZE BASICHE Nalorfina Conservazione: il reagente va stoccato a 20 C ng/ml REAGENTE P: SLUZINE STANDARD INTERN PER AMFETAMINE MDPA Conservazione: il reagente va stoccato a 20 C ng/ml CNDIZINI DETECTR DI MASSA (4000) : (tali condizioni possono essere variate in funzione dello strumento utilizzato) Range di Massa m/z Temperatura della Massa: 180 C; Temperatura Transfer Line: 270 C; Temperatura Manifold: 80 C Filamento on: 5 minuti CNDIZINI DEL GAS-CRMATGRAF : (tali condizioni possono essere variate in funzione dello strumento utilizzato) Colonna VF-5ms o Rxi-5Sil MS 30 m x 0,25 mm, 0,25 µm (dopo averla condizionata seguendo le indicazioni del fornitore) Temperatura iniettore 280 C Rapporto di Splittaggio Inizio: N split 20 0 min: FF 1 min: N split min: N split 20 NB: Il rapporto di splittaggio può essere variato a seconda dello strumento utilizzato Programmata Termica: 120 C x 3,25 minuti C a 20 C/min 250 C x 1 minuto, C a 40 C/min 300 x 3 minuti (corsa 15 minuti) Flusso Gas Elio 1 ml/min Gas CNDIZINAMENT DELLA CLNNA VF-5 MS o Rxi-5Sil MS Seguire le prescrizioni del costruttore. PULIZIA DELLA CLNNA VF-5 MS o Rxi-5Sil MS Qualora le performance analitiche subiscano rilevanti modifiche (es. scarsa sensibilità o presenza di interferenti nei cromatogrammi), è necessario effettuare la pulizia della colonna come riportato secondo le indicazioni del fornitore. 19

20 LAVAGGI DELL AUTCAMPINATRE Lavare la siringa prima di ogni iniezione con ACETNE. PARAMETRI CMPUTER GESTINALE SECND LE SPECIFICHE DEL SFTWARE GESTINALE ACCESSRI E CNSUMABILI CDICE DESCRIZINE CNFEZINE GC49016 Calibratore in matrice cheratinica per Sostanze d Abuso 1 CF Z43120 Standard Chimico per MBDB 2 x 5 ml Controllo in matrice cheratinica per Sostanze d Abuso GC CF Livello 1 Controllo in matrice cheratinica per Sostanze d Abuso 1 CF GC49018 Livello 2 Controllo in matrice cheratinica per Sostanze d Abuso Livelli 1 CF GC e 2 S29057U Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 100 Pz S24717 Riduttori di volume per vials da 2 ml 1 x 100 Pz Z1636/26 Provette in Pyrex da 10 ml con tappo SWL 1 x 40 Pz SCP8944 Colonna VF-5MS (30 m x 0,25 mm - 0,25 µm) 1 Pz S13623 Colonna Rxi-5Sil MS (30 m x 0,25 mm 0,25 um) 1 Pz Z81000 Siringa Hamilton da 100 ul 1 Pz Z80500 Siringa Hamilton da 50 ul 1 Pz 20

21 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) MCou t 60: Tpp-Amf-Coc-Metad5200+ISnalo-MDPA1000M- 100MS 30MBT SMS TIC Filt d 6 MD E 9.4 TM 18 S min TFA AM PH ET AMI NE TM6.0 S 59 TFA min ME TA MP HE TA MIN E TM6.9 S 72 TFA min 2 MD A 8.4 TM 68 S min TFA MD MA TM9.1 S 87 TFA min MD PA TM9.7 S 58 TFA min minut Fig. 1 : Soluzione Test Sostanze d Abuso basiche Fig. 2 : Soluzione Test Amfetamine R.T EDDP R.T. 6.0 Amfetamina R.T Metadone R.T. 7.0 Metamfetamina R.T Cocaina R.T. 8.4 MDA R.T Benzoilecgonina R.T. 9.2 MDMA R.T Cocaetilene R.T. 9.4 MDE R.T Diidrocodeina R.T. 9.7 Standard Interno per Amfetamine R.T Codeina R.T Etilmorfina R.T Morfina R.T Monoacetilmorfina R.T Standard Interno per Sostanze basiche 21

22 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) kcounts Ionization ff 390:530 Buprenorfina.SMS Ions: Filtered 10 BP (999=10) in MAINLIB Pyrrolidine, 1,5-dimethyl-3,3-diphenyl-2-ethylidene- CAS No , C20H23N, MW BUPRENRFINA-TMS min 75% N % minutes m/z Fig. 3 : Soluzione Test Buprenorfina Fig. 4 : Spettro di Massa dell EDDP R.T Buprenorfina INI MLECLARI:

23 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) 10. BP 72.0 (999=10) in MAINLIB Methadone(reduced) CAS No , C21H29N, MW BP 82.0 (999=10) in MAINLIB Cocaine CAS No , C17H21N4, MW 303 N 7.5% N 75% H H H % % m/z m/z Fig. 5 : Spettro di Massa del Metadone Fig. 6 : Spettro di Massa della Cocaina INI MLECLARI: INI MLECLARI:

24 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) BP 82.0 (999=10) in MAINLIB Benzoylecgonine-TMS C19H27N4Si, MW361 6 BP (999=10) in MAINLIB Dihydrocodeine TMS derivative C21H31N3Si, MW N Si 5 N Si m/z m/z Fig. 7 : Spettro di Massa della Benzoilecgonina Fig. 8 : Spettro di Massa della Diidrocodeina INI MLECLARI: INI MLECLARI:

25 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) 4 BP 73.0 (999=10) in MAINLIB Morphinan-6-ol, 7,8-didehydro-4,5-epoxy-3-methoxy-17-methyl-6-(trimethylsilyl)- CAS No , C21H29N3Si, MW BP 73.0 (999=10) 17 in EUREKA ETILMRFINA-TMS N % Si % m/z m/z Fig. 9 : Spettro di Massa della Codeina Fig. 10 : Spettro di Massa dell Etilmorfina INI MLECLARI: INI MLECLARI:

26 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) BP 73.0 (999=10) in MAINLIB Morphinan, 7,8-didehydro-4,5-epoxy-17-methyl-3,6-bis[(trimethylsilyl)oxy]-, (5. CAS No , C23H35N3Si2, MW BP (999=10) 9 in EUREKA MAM-TMS Si % Si N % m/z m/z Fig. 11 : Spettro di Massa della Morfina Fig. 12 : Spettro di Massa della 6-Monoacetilmorfina INI MLECLARI: INI MLECLARI:

27 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) 10 BP (999=10) in MAINLIB Nalorphine, o,o'-bis(trimethylsilyl)- C25H39N3Si2, MW BP (999=10) 41 in EUREKA AMPHETAMINE TMS TFA Si % N 75% Si % % m/z m/z Fig. 13 : Spettro di Massa dello Std interno per Sostanze basiche Fig. 14 : Spettro di Massa dell Amfetamina INI MLECLARI: INI MLECLARI:

28 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) 10 BP (999=10) 42 in EUREKA METAMPHETAMINE TMS TFA 10 BP (999=10) 43 in EUREKA MDA TMS TFA 75% 75% % 25% m/z m/z Fig. 15 : Spettro di Massa della Metamfetamina Fig. 16 : Spettro di Massa dell MDA INI MLECLARI: INI MLECLARI:

29 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) 10 BP (999=10) 45 in EUREKA MDMA TMS TFA 10 BP (999=10) 46 in EUREKA MDE TMS TFA % 75% % % m/z m/z Fig. 17 : Spettro di Massa dell MDMA Fig. 18 : Spettro di Massa dell MDE INI MLECLARI: INI MLECLARI:

30 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) 10 BP (999=10) 48 in EUREKA MDPA TMS TFA 10 BP (999=10) in MAINLIB 8-Azabicyclo[3.2.1]octane-2-carboxylic acid, 3-(benzoyloxy)-8-methyl-, ethyl es CAS No , C18H23N4, MW N 75% % % % m/z m/z Fig. 19 : Spettro di Massa dello Std interno per Amfetamine Fig. 20 : Spettro di Massa della Cocaetilene INI MLECLARI: INI MLECLARI:

31 SSTANZE D ABUS IN MATRICE CHERATINICA (Cromatogrammi/Spettri di riferimento) 10 Spectrum1A BP: (139272=10), buprenorfina.sms min, Scan: 1635, 390:530, Ion: 939 us, RIC: , EBC 75% % m/z Fig. 21 : Spettro di Massa della Buprenorfina INI MLECLARI: