Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie Agro- Industriali Università di Roma La Sapienza

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1 MICROBIOLOGIA GENERALE Prof. C. Mazzoni Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie Agro- Industriali Università di Roma La Sapienza Appunti della lezione 8 Diapositive della lezione 8 Paragrafo 5.3, capitolo 14

2 Colture Pure I microrganismi quando crescono su un terreno di laboratorio sono chiamati coltura. Una coltura pura è costituita da una popolazione di cellule derivate da un unica cellula madre. La coltura pura rappresenta una condizione artificiale per l accrescimento di batteri ed altri microrganismi ed è una condizione imposta ai microrganismi da manipolare in laboratorio. Metodi di isolamento di colture pure Piastra per striscio La popolazione microbica mista viene seminata sulla superficie dell agar, in vicinanza dei margini della piastra, per mezzo di un ansa di platino; il materiale depositato viene disteso mediante una serie di strisci non sovrapposti secondo varie tecniche (diap. 3 e figura 5.4 del libro). A questo punto le singole cellule batteriche passano dall ansa strofinata sulla superficie dell agar, sviluppandosi in colonie isolate. Piastra per diffusione 1. Il campione d origine viene diluito più volte, quindi piccole quantità del campione diluito vengono miscelate con agar a 45 C. Queste miscele vengono versate immediatamente su piastre sterili (diap. 4). Poiché alcuni dei microrganismi restano intrappolati al di sotto della superficie del terreno quando esso gelifica, la piastra presenterà colonie sia in superficie che sotto la superficie. 2. Nel centro di una piastra contenente agar si semina una piccola quantità di una miscela microbica diluita, composta da circa cellule; quindi, per mezzo di una spatolina sterile, si stende uniformemente il materiale sulla superficie del terreno (diap. 5). In tal modo dalle cellule disseminate si svilupperanno colonie isolate. Colture di arricchimento I metodi di piastramento sopra descritti risultano più efficaci per ottenere colture pure se vengono impiegati con terreni selettivi o differenziali. Es.1. Isolamento batteri sporigeni: poiché le spore sono molto resistenti al calore, si può esporre il campione ad una temperatura di circa 85 C per 5 prima di seminarlo su piastra. Il trattamento termico distruggerà la totalità, o la maggior parte delle forme asporigene e qualunque colonia che si svilupperà sarà probabilmente una specie sporigena. Es. 2 Isolamento batteri capaci di utilizzare una sostanza chimica complessa come l erbicida 2,3-acido diclorofenossiacetico. Se si inocula una campione di suolo direttamente in agar nutritizio, la probabilità di trovare batteri che utilizzano sostanze chimiche complesse sarà molto bassa. Infatti, sono presenti un numero di batteri a crescita rapida talmente elevato che i tipi desiderati saranno superati nell accrescimento. Si impiega perciò la tecnica della coltura di arricchimento, dove viene utilizzato un terreno contenente l erbicida come unica fonte di carbonio, oltre all azoto, fosforo, zolfo ed altri sali minerali. Aggiungendo al terreno così allestito un campione di suolo, si assisterà alla crescita dei soli batteri in grado di utilizzare l erbicida. Dopo l incubazione, un campione della coltura iniziale viene trasferito in un terreno selettivo fresco (diap. 6). Dopo una serie di passaggi di questo tipo, si otterrà una popolazione di batteri in grado di metabolizzare l erbicida. Questi potranno essere isolati in coltura pura tramite il piastramento in un terreno solido con la stessa composizione del terreno usato per l arricchimento. Isolamento di una singola cellula Un apparecchio speciale, micromanipolatore, usato insieme ad un microscopio, consente di prelevare un singolo microrganismo da un preparato a goccia pendente (diap. 7). Il micromanipolatore permette all operatore di controllare il movimento di una micropipetta o di una microsonda (un ago sottile che può essere una fibra ottica) nella goccia depositata su una piastra e trasferirla in un altro punto isolato della piastra o in un altro terreno.

3 Crescita in colture miste In diversi ambienti naturali si svolgono processi microbiologici di grande utilità per l uomo dovuti a più specie presenti contemporaneamente e che si alternano nel tempo l una rispetto all altra. In questo caso si ha un susseguirsi di popolazioni microbiche: crescerà per prima quella che si troverà in condizioni ottimali; esaurita la fonte nutrizionale (con conseguente variazione delle condizioni fisiche ed ambientali) la popolazione che si è sviluppata per prima smetterà di crescere mentre inizierà a svilupparsi la seconda. Le colture miste possono essere spontanee e non richiedere un inoculo di colture pure, oppure possono essere artificiali e l inoculo viene effettuato con due o più colture pure. Es. 1) La crescita di una forma aerobia crescendo consuma l O 2 disciolto nel terreno e crea le condizioni di anaerobiosi adatte alla crescita di clostridi. Es. 2) La crescita di una muffa in grado di idrolizzare l amido seguita da una fermentazione dei prodotti ottenuti da parte di un lievito. Es. 3) La crescita di un virus ha bisogno del suo ospite. Mantenimento e conservazione delle colture Allo studio delle colture pure è associato il problema di mantenerle per vari intervalli di tempo in una condizione vitale. La maggior parte dei laboratori di batteriologia mantiene una grande collezione di queste colture, chiamata spesso collezione di colture stock. Questi organismi sono necessari per i corsi di laboratori e per il lavoro di ricerca o come agenti di prova per particolari procedimenti. Per questi e per altri scopi è estremamente importante disporre di colture pure di batteri correttamente identificate. Ogni laboratorio naturalmente, manterrà una collezione di colture secondo le sue necessità e i suoi principali interessi, sia d insegnamento sia di ricerca. La maggior parte delle industrie che operano nel settore biologico mantiene grandi collezioni di colture, le quali sono usate per selezionare nuovi agenti chemioterapici potenzialmente efficaci, come colture di riferimento per studi tassonomici, come agenti di saggio per antibiotici e vitamine, e come colture di riferimento citate nei brevetti industriali. Metodi di conservazione Vaste ricerche sono state eseguite per sviluppare migliori condizioni per la conservazione dei batteri. Poiché non tutte le specie reagiscono in maniera analoga a una particolare condizione o ad un particolare processo, ciò che è stato appreso per una coltura non può essere applicabile ad un altra. E essenziale che il metodo di conservazione e mantenimento preservi tutte le caratteristiche della specie quali erano nel momento della conservazione. Inoltre, occorre tenere presenti alcune ragioni pratiche quali la quantità di lavoro richiesto e la quantità di spazio necessario per le colture. Alcune delle tecniche usate sono le seguenti: Trasferimento periodico in terreni freschi Le colture possono essere mantenute in provette di terreno dove sono state coltivate mediante periodici trasferimenti in terreni freschi. Gli intervalli di tempo a cui sono eseguiti i trasferimenti variano da organismo a organismo. Molti dei batteri eterotrofi più comuni rimangono vitali per parecchie settimane o per parecchi mesi su un terreno quale l agar nutritizio. Quando si adotta questo procedimento per mantenere una collezione di colture, si devono accertare in anticipo tre cose: il terreno corretto da usare per ciascuna specie, la temperatura corretta per l immagazzinamento delle colture e l intervallo di tempo a cui si devono eseguire i trasferimenti.

4 Conservazione delle colture mediante ricoprimento con olio minerale Si possono conservare con successo molti batteri ricoprendo con olio minerale sterile la coltura sviluppatasi su agar solidificato a becco di clarino. L olio deve coprire completamente l agar; perché ciò avvenga sicuramente, il livello dell olio dovrebbe essere circa di un cm al di sopra della superficie inclinata dell agar. Il mantenimento della vitalità di una coltura sottoposta a questo trattamento varia da specie a specie, ma è di solito questione di anni: alcune specie sono state conservate in maniera soddisfacente per anni. Questo metodo di mantenimento ha l eccezionale vantaggio che si può rimuovere una parte della coltura sviluppatasi sotto l olio con un ago di platino, inocularla in un terreno fresco e conservare ancora la coltura iniziale. Per la sua semplicità questo metodo è particolarmente attraente. Terreno minimo, acqua distillata o acqua e agar Una volta lavate, le colture sono conservate in un refrigeratore; queste colture possono rimanere vitali per tre o cinque mesi o anche più a lungo. Conservazione delle colture mediante essiccazione rapida dello stato di congelamento (liofilizzazione) La liofilizzazione è il procedimento più efficace per la conservazione delle colture. Infatti, molte specie di batteri conservate con questa tecnica sono rimaste vitali e invariate per più di venti anni. In questo processo, le cellule vengono essiccate rapidamente, mentre sono congelate, mediante le seguenti operazioni. La sospensione di cellule è collocata in piccole fiale, che vengono poi immerse in una miscela di ghiaccio secco e alcol (-78 C). Le fiale vengono subito collegate in un impianto per alto vuoto e, quando l essiccazione è completa, vengono sigillate singolarmente sotto vuoto. I notevoli vantaggi di questa tecnica sono la sopravvivenza a lungo termine, una minore possibilità di variazione dei caratteri della coltura e la piccolezza dei recipienti di immagazzinamento (fiale). Centinaia di colture liofilizzate possono essere immagazzinate in un piccolo volume. Immagazzinamento a bassissime temperature La facile reperibilità dell azoto liquido (- 196 C) ha offerto al microbiologo un altro mezzo per mantenere le colture. In questo procedimento le cellule sono congelate insieme ad un agente protettivo (glicerina o dimetilsolfossido). I campioni congelati sono conservati in refrigeratori ad azoto liquido. Il mantenimento delle colture con azoto liquido si è rivelato molto soddisfacente: tutte le colture che possono essere mantenute in maniera soddisfacente mediante liofilizzazione possono essere mantenute altrettanto bene con l azoto liquido. Inoltre, il processo di congelamento in azoto liquido si è dimostrato efficace con molti campioni che non possono essere mantenuti mediante liofilizzazione.

5 Collezioni nazionali di colture In tutto il mondo esistono parecchie organizzazioni la cui funzione principale è mantenere colture pure autentiche sia di batteri sia di altri microrganismi (lieviti, muffe, alghe protozoi, virus) e di cellule animali. La prima collezione nota di colture tipo, la collezione Kral, fu istituita a Praga intorno al L American Type Culture Collection (ATCC) è a Rockville, nel Maryland. In Francia una collezione di colture batteriche è mantenuta nell istituto Pasteur a Parigi; La British National Collection of Type Cultures è a Londra; la Japanese Type Culture Collection è nell istituto Nagao di Tokyo. Esse sono soltanto alcune delle grandi collezioni nazionali che sono mantenute in vari paesi. L ATCC comprende più di ceppi di batteri, funghi, alghe, protozoi, linee di cellule animali e virus. Più di mezzo milione di ampolle di campioni liofilizzati o congelati sono immagazzinate in refrigeratori meccanici a -60 C in camere fredde a 5 C o in refrigeratori a azoto liquido a -196 C. Oltre colture sono distribuite annualmente a scienziati e docenti negli Stati Uniti e all estero. Molte altre collezioni sono mantenute in varie parti del mondo per soddisfare varie necessità. Per esempio, negli Stati Uniti la Northern Utilization Research and Delevopment Division (USDA), a Peoria (Illinois), mantiene una collezione di lieviti, muffe e batteri che sono impiegati soprattutto nelle fermentazioni; il Quartermaster Research and Development Center dell U.S. Army a Natick (Massachusetts), mantiene una collezione di colture soprattutto dei tipi associati ai processi di deterioramento. Inoltre a Losanna esiste il centro internazionale per l informazione e la distribuzione delle colture tipo finanziato dall UNESCO, che fornisce un servizio d informazioni e servendosi del suo catalogo delle collezioni mantenute in tutto il mondo, tenta di localizzare qualunque coltura venga richiesta. Nel 1966 la International Association of Microbiological Societies istituì una sezione di collezioni di colture allo scopo di migliorare la collaborazione e lo scambio di informazioni tra le collezioni di colture del mondo. Le collezioni di colture svolgono un ruolo indispensabile per i microbiologi mettendo a loro disposizione una grande varietà di specie e di ceppi.