ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe Kit

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1 ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe Kit Z Z Per la rilevazione del gene umano HER2 e delle regioni alfa-satellite del cromosoma 17 mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH).... Dispositivo per uso diagnostico in vitro in base alle direttive EU 98/79/EC

2 Ultima versione: 1 marzo 2011 (5.0) Marchi di fabbrica: ZytoVision e ZytoLight sono marchi di fabbrica della ZytoVision GmbH.

3 Contenuto 1. Finalità d'uso Principio del metodo Informazioni su sicurezza e smaltimento Il ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe Kit Componenti Conservazione e validità Campioni Materiale supplementare necessario Informazioni importanti Protocollo ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe Kit Preparazione Pretrattamento (sparaffinatura/proteolisi) [1 giorno] Denaturazione e ibridazione [1 giorno] Post-ibridazione e rilevazione [2 giorno] Interpretazione dei risultati Bibliografia Problemi e possibili cause... 11

4 1. Finalità d'uso Il ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe Kit è designato per rilevare il gene umano HER2 e le sequenze alfa-satellite del cromosoma 17 su cellule o tessuti inclusi in paraffina e fissati in formalina attraverso ibridazione in situ fluorescente (FISH). L'interpretazione dei risultati deve essere effettuata da un patologo qualificato tenendo conto degli altri dati clinici e patologici del paziente nel contesto dell'anamnesi clinica. 2. Principio del metodo La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel campione in analisi e la sonda. Il ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe Kit utilizza la sonda ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe EmiUF. Tale sonda contiene polinucleotidi marcati con il fluorocromo verde (ZyGreen: eccitazione a 503 nm ed emissione a 528 nm, analogo a FITC) che riconoscono il gene HER2 e polinucleotidi marcati con il fluorocromo arancione (ZyOrange: eccitazione a 547 nm ed emissione a 572 nm, analogo a rodamina) che riconoscono le sequenze alfa-satellite centromeriche specifiche del cromosoma 17. La formazione dell'ibrido duplex con le sonde fluorescenti può essere visualizzata al microscopio a fluorescenza mediante appositi filtri

5 3. Informazioni su sicurezza e smaltimento Leggere attentamente le istruzioni prima dell'uso! Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza! Evitare contaminazioni incrociate e microbatteriche dei reagenti! Alcuni componenti del sistema contengono (a basse concentrazioni e volumi ridotti) sostanze nocive per la salute. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Adottare adeguate misure di sicurezza (utilizzo di guanti monouso, occhiali protettivi e indumenti da laboratorio)! In caso di contatto con i reagenti, risciacquare immediatamente la pelle con acqua corrente! Non mettere in bocca le pipette per le soluzioni! Smaltire i reagenti in base alle disposizioni locali! La scheda di sicurezza è disponibile su richiesta per l'utilizzatore professionista! - 2 -

6 4. Il ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe Kit 4.1 Componenti Il kit è costituito dai seguenti componenti: Codice Componenti Quantità 20 5 Contenitore PT1 Heat Pretreatment Solution Citric 500 ml 150 ml Flacone con tappo a vite (grande) ES1 Pepsin Solution 4 ml 1 ml Flacone contagocce con tappo bianco WB1 Wash Buffer SSC 500 ml 150 ml Flacone con tappo a vite (grande) PL8 ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe 0.2 ml 0.05 ml Provetta con tappo rosso WB2 25x Wash Buffer A 2x 50 ml 50 ml Flacone con tappo a vite (medio) MT1 DAPI/Antifade-Solution Provetta con tappo blu Manuale d'istruzioni 1 1 Z (20 reazioni): I componenti EbpNF, EmiUF e EjqNF sono sufficienti per 20 reazioni. Il componente Et_OF è sufficiente per 11x 3 contenitori per i lavaggi da 70 ml ciascuno. I componenti EmqNF e Et_NF sono sufficienti per 7 contenitori per i lavaggi da 70 ml ciascuno. Z (5 reazioni): I componenti EbpNF, EmiUF e EjqNF sono sufficienti per 5 reazioni. Il componente Et_OF è sufficiente per 5x 3 contenitori per i lavaggi da 70 ml ciascuno. I componenti EmqNF e Et_NF sono sufficienti per 2 contenitori per i lavaggi da 70 ml ciascuno. 4.2 Conservazione e validità Tutti i componenti del kit devono essere conservati ad una temperatura compresa tra 2 8 C tranne la sonda EmiUF e la DAPI/Antifade-Solution EjqNF che devono essere conservati al buio a C; è possibile conservare i reagenti a 2 8 C per un breve periodo. Osservando tali condizioni di conservazione, è possibile utilizzare il kit almeno fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta

7 4.3 Campioni Il ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe Kit è stato ottimizzato per l'utilizzo su cellule e tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina. L'impiego di materiale fissato od incluso diversamente (es. strisci di sangue o cellule fissate con metanolo-acido acetico glaciale) può richiedere modifiche del protocollo da parte dell'utilizzatore. I nostri esperti sono a disposizione per eventuali suggerimenti. Si consiglia di preparare il tessuto nel modo seguente: Fissazione in formalina neutra tamponata al 10% per 24 h a temperatura ambiente Per ottenere una fissazione ed un'inclusione in paraffina ottimali ed uniformi, la grandezza del campione non deve essere superiore a 0,5 cm 3. Procedimento standard e inclusione in paraffina Utilizzare paraffina di alta qualità. L'infiltrazione e l'inclusione devono avvenire ad una temperatura inferiore a 65 C. Preparare sezioni con spessore di 3-5 µm Utilizzare vetrini rivestiti di silano oppure altre sostanze (ad esempio Histo- Bond ), fissare per 2-16 h a C. 4.4 Materiale supplementare necessario I seguenti reagenti e materiali non sono contenuti nel kit: - Bagnetto termostatato (37 C, 98 C) - Xilene - Piastra riscaldante - Forno per ibridazione (stufa) - Contenitori da ml per i lavaggi (staining jars) - Camera umida - Pipette (10 µl, 30 µl) - Pistola per incollaggio con adesivo a caldo o mastice (Fixogum) - Etanolo 100%, denaturato - Acqua deionizzata o distillata - Carta assorbente - Vetrini coprioggetto (22 mm x 22 mm, 24 mm x 60 mm) - Microscopio a fluorescenza - 4 -

8 4.5 Informazioni importanti Occorre tenere presente che: Le sezioni non devono disidratarsi durante l'ibridazione ed i lavaggi! La sonda EmiUF e la DAPI/Antifade-Solution EjqNF non devono essere esposte alla luce, in particolare a luce intensa per lunghi periodi; se possibile, eseguire i passaggi al buio o in contenitori riparati dalla luce! Le temperature di denaturazione e lavaggio descritte nel protocollo devono essere utilizzate come guida. In base alla fissazione e al tempo di invecchiamento dei campioni, una variazione di tali temperature potrebbe produrre risultati migliori! Questo protocollo è stato designato per la simultanea co-denaturazione di sonda e campione; protocolli per la denaturazione individuale sono disponibili sulla nostra homepage (

9 5. Protocollo ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe Kit 5.1 Preparazione 1 giorno: Preparazione della scala di etanolo in doppio (soluzioni al 70%, 90% e 100% di etanolo): Diluire 7, 9 e 10 parti di 100% etanolo con 3, 1 e 0 parti di acqua deionizzata o distillata. Le soluzioni possono essere conservate in appositi contenitori e riutilizzate (2 giorno). Heat Pretreatment Solution Citric EmqNF: Portare a 98 C. Wash Buffer SSC Et_NF: Portare a temperatura ambiente. 2 giorno: Preparazione del tampone di lavaggio 1x Wash Buffer A: Diluire 1 parte di 25x Wash Buffer A Et_OF con 24 parti di acqua deionizzata o distillata. Riempire tre contenitori per i lavaggi con il tampone 1x Wash Buffer A e preriscaldare a 37 C. DAPI/Antifade-Solution EjqNF: Portare a temperatura ambiente prima dell'utilizzo e proteggere dalla luce. 5.2 Pretrat atta tament mento (sparaffinatura paraffinatura/p /proteol roteolisi) [1 giorno] N. Incubare I vetrini per 10 min a 70 C (es. su una piastra riscaldante) OK= PK= QK= Incubare 2x 10 min in xilene Incubare per 5 min ciascuno in 100%, 100%, 90% e 70% etanolo Lavare 2x 2 min in acqua deionizzata o distillata RK= Incubare per 15 min a 98 C nella soluzione Heat Pretreatment Solution Citric EmqNF preriscaldata Si consiglia di non inserire più di 6 vetrini per contenitore per i lavaggi. SK= Trasferire immediatamente i vetrini in acqua distillata o deionizzata, lavare 2x 2 min ed eliminare l'eccesso di liquido TK= Applicare (a gocce) la Pepsin Solution EbpNF sulla sezione e incubare per 10 min a 37 C in camaretta umida Il tempo di incubazione dipende dal tipo di campione e dal relativo tempo di fissazione. Come valore indicativo, si può considerare un'incubazione di 5-15 min - 6 -

10 per campioni di tessuto e 0-3 min per campioni di cellule. In generale, si consiglia di determinare il tempo di proteolisi ottimale eseguendo un test preventivo. UK= Lavare per 5 min in Wash Buffer SSC Et_NF e per 1 min in acqua deionizzata o distillata VK= Disidratare in 70%, 90% e 100% etanolo ciascuno per 1 min Asciugare all'aria. 5.3 Denaturazione e ibridazione idazione [1 giorno] NK= Pipettare 10 µl di ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe EmiUF su ogni campioni Un leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. Evitare l'eccessiva esposizione alla luce. OK= Evitare la formazione di bolle, coprire con un coprioggetto (22 mm x 22 mm). Sigillare il coprioggetto con adesivo o mastice PK= Denaturare a 75 C (±2 C) per 10 min, es. su una piastra riscaldante In base alla data e alla fissazione dei campioni, potrebbe essere necessario ottimizzare la temperatura di denaturazione (73-77 C). QK= Trasferire i vetrini in una camaretta umida e ibridizzare overnight a 37 C (es. in un fornetto) E' indispensabile mantenere umido il campione durante l'ibridazione

11 5.4 Post-ibridazione e rilevazione [2 giorno] NK= Rimuovere con cura il mastice o la colla OK Rimuovere il coprioggetto immergendo il vetrino in 1x Wash Buffer A a 37 C per 1-3 min PK= Lavare 2x 5 min in 1x Wash Buffer A a 37 C QK Il tampone 1x Wash Buffer A deve essere pre-riscaldato; se necessario verificare con un termometro. Incubare i vetrini in 70%, 90% e 100% etanolo (1 min per ciascuno) Asciugare all'aria al riparo dalla luce RK Pipettare 30 µl di DAPI/Antifade-Solution EjqNF sui campioni. Evitare la formazione di bolle, coprire con un coprioggetto (24 mm x 60 mm). Incubare al buio per 15 min L'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplifica l'operazione. Evitare l'eccessiva esposizione alla luce. SK= Rimuovere l'eccesso di DAPI/Antifade-Solution EjqNF premendo leggermente il vetrino con carta assorbente TK= Conservare i vetrini al buio. Per periodi più lunghi, conservare a 2-8 C UK= Osservare i campioni al microscopio a fluorescenza. Si richiedono set di filtri per le seguenti lunghezze d'onda: ZyGreen, verde (HER2): eccitazione a 503 nm ed emissione a 528 nm, analogo a FITC; ZyOrange, arancione (cromosoma 17): eccitazione a 547 nm ed emissione a 572 nm, analogo a rodamina

12 6. Interpretazione dei risultati Con l'utilizzo degli appositi set di filtri, i segnali di ibridazione del gene HER2 appaiono verdi; le sequenze alfa-satellite centromeriche del cromosoma 17 appaiono arancione. Normali cellule interfasiche (o cellule prive di aberrazioni del cromosoma 17) mostrano due segnali per HER2 e due per il cromosoma 17. Quando in una cellula un gene risulta amplificato, si vedranno un incremento di segnali specifici per quel determinato gene o un aggregato di segnali. I polinucleotidi contenuti nella sonda ZytoLight SPEC HER2/CEN 17 Dual Color Probe EmiUF che riconoscono le sequenze alfa-satellite centromeriche del cromosoma 17 agiscono da controllo interno dimostrando la corretta esecuzione dell'ibridazione e il mantenimento dell'integrità del DNA cellulare. Per valutare la specificità dei segnali, ogni ibridazione deve essere eseguita con i rispettivi controlli. Si consiglia di utilizzare almeno un campione di controllo di cui siano noti il numero di copie del cromosoma 17 e del gene HER2. Per non ottenere falsi risultati, es. amplificazione di geni, occorre prestare attenzione in modo da non considerare le cellule sovrapposte. A causa della decondensazione cromatinica, singoli segnali FISH potrebbero apparire come piccoli aggregati (clusters); di conseguenza, due o tre segnali di uguali dimensioni, separati da una distanza minore o uguale al diametro di uno stesso segnale, devono essere conteggiati come un segnale unico. Eventuali risultati negativi o aspecifici possono essere dovuti a molteplici fattori (vedere capitolo 8)

13 7. Bibliografia Alexandrov IA, et al. (1988) Chromosoma 96: Baselga J, et al. (1999) Semin Oncol 26: Coussens L, et al. (1985) Science 230: Hynes NE, Stern DF (1994) Biochim Biophys Acta 1198: Kievits T, et al. (1990) Cytogenet Cell Genet 53: Park JB, et al. (1989) Cancer Res 49: Popescu NC, et al. (1989) Genomics 4: Slamon DJ, et al. (1987) Science 235: Waye JS, Willard HF (1986) Nucleic Acids Res 14: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN

14 8. Problemi e possibili cause La mancata osservanza delle indicazioni contenute nelle istruzioni per l'uso può produrre risultati deboli o falsi negativi. Problema Crepe nel tessuto in seguito al trattamento con pepsina Possibile ile causa Formazione di precipitato Azion ione Lavare immediatamente i vetrini in acqua distillata o deionizzzata Segnale scarso o nullo Assenza di sequenze bersaglio Utilizzare controlli Colorazione irregolare e molto debole in alcune zone Segnali di cross-ibridazione, intensa colorazione di fondo Distacco delle sezioni dal vetrino Fissazione non ottimale delle cellule o dei tessuti Trattamento proteolitico non ottimale Temperatura di denaturazione non appropriata Temperatura di ibridazione non corretta Microscopio a fluorescenza male impostato Eccessiva esposizione alla luce durante l'esecuzione della metodica Eliminazione della paraffina non completa Ottimizzare i tempi di fissazione Ottimizzare il tempo di incubazione Verificare la temperatura, eventualmente aumentare o diminuire Verificare la temperatura Verificare le impostazioni e i set di filtri Eseguire l'ibridazione ed i lavaggi al buio Utilizzare soluzioni fresche; verificare i tempi dei passaggi per la sparaffinatura Eccessivo volume di sonda per area Distribuire la sonda a piccole gocce evitando di concentrare in unico punto Eccessivo trattamento proteolitico Disidratazione delle sezioni durante i passaggi di incubazione Temperatura dei lavaggi postibridazione troppo bassa Eccessivo pre-trattamento proteolitico Rivestimento dei vetrini inappropriato Ottimizzare I tempi di incubazione Impedire disidratazione Verificare la temperatura Diminuire i tempi di incubazione Utilizzare vetrini appropriati

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