GLI ENZIMI. Gli enzimi sono (quasi sempre) molecole proteiche che catalizzano tutte le reazioni chimiche che avvengono negli organismi viventi.

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1 GLI ENZIMI Gli enzimi sono (quasi sempre) molecole proteiche che catalizzano tutte le reazioni chimiche che avvengono negli organismi viventi. - Sono catalizzatori biologici non vengono alterati dalla reazione che catalizzano ACCELERANO reazioni chimiche fino a volte!!! (efficienza catalitica) accelerazione da catalizzatori non enzimatici: Rendono più moderate le condizioni di reazione altrimenti drastiche per ph, temperatura, pressione

2 GLI ENZIMI. Possono legare altre molecole (cofattori) Agiscono abbassando l energia libera di attivazione Svolgono il loro ruolo con modalità differenti, ma in tutti i casi la catalisi procede attraverso la formazione di complessi tra l'enzima e i reagenti specificità di substrato substrati = reagenti su cui gli enzimi agiscono specificità di reazione (assenza di prodotti secondari) Possono essere regolati in funzione delle specifiche esigenze

3 Che cosa gli enzimi NON fanno: -NON cambiano l equilibrio di una reazione - NON rendono possibile una reazione termodinamicamente impossibile

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5 -Gli enzimi possono avere dimensioni variabili -Solo una piccola parte della molecola è coinvolta nella catalisi (sito catalitico o sito attivo), ma tutta la molecola è importante per la funzione -Alterazioni a siti distanti dal sito catalitico (anche in un solo aa!!!) possono ridurre o annullare l attività dell enzima Per svolgere la sua funzione l enzima DEVE legare il substrato Formazione di un complesso enzima-substrato (ES)

6 Nomenclatura degli enzimi * Nome del substrato su cui agiscono (o del tipo di reazione che catalizzano) + suffisso asi Es: - ureasi - Alcool deidrogenasi - glucosio 6-fosfato isomerasi - DNA ligasi - esochinasi * Altri come la tripsina e la chimotripsina sono conosciuti dai loro nomi storici.

7 REGOLE PER LA CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI La International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) stabilisce che gli enzimi vengono classificati in base al tipo di reazione chimica che catalizzano

8 NOMENCLATURA DEGLI ENZIMI Classificazione Tipo di reazione catalizzata 1. Ossidoreduttasi Reazioni di ossidoriduzione (deidrogenasi, ossidasi, perossidasi, reduttasi) 2. Trasferasi trasferimento di gruppi funzionali 3. Idrolasi idrolisi 4. Liasi lisi del substrato con formazione di doppi legami (reazioni di eliminazione) 5. Isomerasi isomerizzazione (nella reazione inversa -reazione di addizione - agiscono da sintasi) 6. Ligasi formazione di legami accoppiata all idrolisi di ATP (anche denominate sintetasi ) Gli enzimi sono classificati in accordo al tipo di reazione. Ci sono sei classi principali (con sottoclassi che definiscono il substrato o il legame coinvolto)

9 CLASSI DI ENZIMI

10 No. Classes ENZYME CLASSES AND SUBCLASSES (type of reaction catalyzed) 1 Oxidoreductases (oxidation-reduction reactions) dehydrogenases oxidases oxygenases reductases peroxidases catalases hydroxylases 2 Transferases (transfer of functional groups) transaldolases kinases 3 Hydrolases (hydrolysis reactions) transketolases acyl, methyl, phosphoryl transferases esterases glycosidases peptidases phosphatases phospholipases thiolases amidases ribonucleases 4 Lyases (formation of double bonds) decarboxylases aldolases hydratases dehydratases synthases lyases 5 Isomerases (isomerization reactions) racemases epimerases isomerases 6 Ligases (formation of covalent bonds) synthetases carboxylases

11 UN ESEMPIO DI NOMENCLATURA A ciascun enzima vengono assegnati due nomi e un numero di classificazione: -Nome corrente (es. esochinasi) -Nome sistematico (es: ATP glucosio fosfotransferasi) -Numero di classificazione (es: EC ) Enzyme Commission classe numero di serie sottoclasse sotto-sottoclasse

12 Numero di classificazione [ E C ] classe (reazione catalizzata): trasferasi 2 sottoclasse (substrato o legame coinvolto): fosfotrasferasi 7 trasferimento di un gruppo fosfato sotto-sottoclasse: un gruppo ossidrilico come accettore 1 numero di serie nell ambito della sotto-sottoclasse 1

13 Cofattori e coenzimi Alcuni enzimi esplicano la loro funzione catalitica utilizzando esclusivamente la reattività chimica dei loro residui aminoacidici. Molti enzimi richiedono invece la partecipazione di cofattori o coenzimi che non sono parte della struttura proteica. Cofattore una piccola molecola organica o inorganica (ioni metallici Fe2+, Cu2+, Mg2+, Zn2+) che contribuisce al mantenimento della struttura terziaria dell enzima ed è dunque necessaria per l attività enzimatica. Gli ioni metallici: se debolmente legati (K, Mg, o Ca) partecipano al legame del substrato (enzimi attivati da metallo). se strettamente legati (Fe, Zn, e Co) partecipano direttamente alla reazione (metalloenzimi). Se il cofattore viene rimosso, l enzima assume il nome di apoenzima ed è privo di attività.

14 COFATTORI ORGANICI (COENZIMI) I coenzimi sono molecole organiche. Agiscono come reagenti per il trasferimento di gruppi accettando o donando gruppi funzionali. Derivano spesso da precursori della dieta (vitamine) o da metaboliti. I coenzimi sono chimicamente modificati in seguito alla reazione enzimatica ovvero funzionano come cosubstrati.

15 Oloenzima (attivo) Enzima cofattore Enzima cofattore Apoenzima (inattivo) Il coenzima legato saldamente all enzima attraverso un legame covalente o un legame di coordinazione viene detto gruppo prostetico

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17 VITAMINE E COENZIMI

18 MOLTI COENZIMI SONO DERIVATI DALLE VITAMINE Coenzyme Reaction catalyzed Vitamin source Thiamine pyrophosphate Flavin adenine dinucleotide Nicotinamide adenine dinucleotide Aldehyde transfersdecarboxilation Oxidation-reduction reactions (electron transfers) Oxidation-reduction reactions (hydride transfers) Thiamine (Vitamin B 1 ) Riboflavin (Vitamin B 2 ) Nicotinamide (niacin) Coenzyme A Acyl transfers Pantothenic acid Pyridoxal phosphate Amino group transfers Pyridoxine (Vitamin B 6 ) Coenzyme B 12 Alkylation reactions Cobalamin (Vitamin B 12 ) Biocytin Carboxylation reactions Biotin Tetrahydrofolic acid One-carbon transfers Folic acid Lipoic acid Acyl transfers

19 Alcuni importanti coenzimi

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21 Coenzimi NAD + e NADP + Nicotinamide adenin dinucleotide (NAD+) e Nicotinamide adenin dinucleotide fosfato (NADP + ) Derivano dalla vitamina Niacina Svolgono un ruolo nelle reazioni di ossidoriduzione che implicano trasferimenti di due elettroni. NAD + NADH + H + Malato Malato Deidrogenasi Ossalacetato NAD + NADH + H +

22 Coenzimi FMN e FAD Flavin mononucleotide (FMN) e flavin adenine dinucleotide (FAD) Derivano dalla vitamina Riboflavina (B 2 ) Ruolo nelle reazioni di ossidoriduzione che implicano il trasferimento di uno o due elettroni FAD FADH 2 Succinato Succinato Deidrogenasi Fumarato FAD FADH 2

23 ISOENZIMI Gli isoenzimi sono forme distinte di un enzima che hanno la stessa attività catalitica e sono presenti in differenti tipi cellulari o compartimenti subcellulari. Differiscono in: Parametri cinetici; Specificità; ph ottimale; Caratteristiche di carica (pi); Sensibilità all inibizione; Sensibilità al calore (termostabilità). Sono distinguibili elettroforeticamente a causa di una o più sostituzioni amminoacidiche in porzioni non critiche della proteina.

24 Separazione elettroforetica di isoenzimi della lattico deidrogenasi estratti da tessuti diversi LDH 1 + LDH 2 LDH 3 LDH 4 LDH 5 Cuore Rene Fegato Muscolo Siero Origine Per la classificazione degli isoenzimi si inizia dalle specie che hanno la maggiore mobilità elettroforetica verso l anodo.

25 Isoenzimi lattico deidrogenasi LDH NADH + piruvato lattato + NAD LDH-1 (H4) miocardio, eritrociti, rene... LDH-2 (H3M) miocardio, eritrociti, rene, pancreas, polmoni.. LDH-3 (H2M2) polmoni, placenta, pancreas, muscolo scheletrico LDH-4 (HM3) muscolo scheletrico, polmone LDH-5 (M4) fegato, muscolo scheletrico... Differenze tra H M 1aa differenti K M e V max stabilità termica µ elettroforetica

26 Complessi multienzimatici I complessi multienzimatici sono gruppi di enzimi associati mediante legami non covalenti, che catalizzano due o più passaggi successivi lungo una via metabolica. Essi rappresentano un miglioramento dell efficienza catalitica da un punto di vista evolutivo. Migliore catalisi. Riduzione dei tempi di diffusione di un intermedio da un enzima all altro. Channelling del substrato. Permette di trasferire un intemedio di una via biosintetica direttamente ad un altra subunità evitando competizione. Sequestro di intermedi reattivi. Protezione di specie che sarebbero chimicamente instabili in soluzioni acquose. Servicing. Una subunità può trasferire un reagente a differenti altre subunità. Regolazione ed espressione coordinate.

27 COMPLESSO DELLA PIRUVATO DEIDROGENASI E1 piruvato deidrogenasi (24) E2 diidrolipoiltransacetilasi (24) E3 diidrolipoildeidrogenasi (12) In E.coli PM 4600 KDa;negli eucarioti (mitocondri) KDa

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29 Come funzionano gli enzimi??

30 Il meccanismo d azione degli enzimi può essere trattato da tre punti di vista: -analizzando i cambiamenti energetici che si verificano nel corso della reazione - esaminando il modo in cui il sito attivo favorisce la catalisi dal punto di vista chimico -Studiando la cinetica della reazione catalizzata

31 Cambiamenti energetici che si verificano durante una reazione G = H T S G = variazione dell energia libera. H = variazione dell entalpia S = variazione dell entropia. T= temperatura assoluta. G < 0 (reazione spontanea) G > 0 (reazione non spontanea) G = 0 (reazione in equilibrio) Per avere G < 0: 1) H < 0; S > 0 I due fattori vanno nella stessa direzione. 2) H < 0 ; S < 0 Il fattore entalpico deve prevalere sul quello entropico. 3) H > 0 ; S > 0 Il fattore entropico deve prevalere sul quello entalpico.

32 CENNI DI TERMODINAMICA CHIMICA A + B C + D Quando la reazione è all equilibrio G = 0 K e = [C] c [D] d [A] a [B] b Quando un sistema non è all equilibrio, la forza trainante che all equilibrio è la variazione di energia libera standard, G. lo spinge G = - RT ln [C] [D] [A] [B]

33 ..correlata alla costante di equilibrio dalla relazione: G = RT ln K e Il G di una reazione è un modo matematico alternativo di esprimere la costante di equilibrio, ma non dà informazioni sulla velocità di una reazione G o = variazione di energia libera in condizioni standard Concentrazione: 1 M di reagenti e prodotti Pressione: 1 Atm Temperatura : 298 K (25 C) ph 7

34 Per capire cosa determina la velocità di una reazione bisogna capire cosa accade durante la transizione da reagenti a prodotti

35 Teoria dello stato di transizione: Reazione non catalizzata La teoria dello stato di transizione non prende in considerazione i meccanismi di reazione, ma permette di correlare la velocità di una reazione con la differenza di energia libera di attivazione tra lo stato fondamentale e lo stato di transizione. Lo stato di transizione corrisponde ad una specie chimica instabile con legami non completamente formati e si situa, nel diagramma di reazione, nel picco a più alta energia libera. L energia di attivazione, G ±, rappresenta l energia libera supplementare che le molecole devono possedere per raggiungere lo stato di transizione.

36 La velocità della reazione dipende dal superamento della barriera energetica per il raggiungimento dello stato di transizione in una reazione non catalizzata solo un piccolo numero di molecole possiede energia sufficiente per raggiungere lo stato di transizione

37 Diagramma dell energia libera per una reazione semplice A B. Studio all equilibrio Differenza in energia libera tra lo stato iniziale e quello finale G A e G B rappresentano le energie libere medie per mole delle molecole di A e B. G rappresenta la variazione di energia libera standard della reazione Diagramma dell energia libera esteso a comprendere lo stato di transizione ( ± ) attraverso cui le molecole devono passare per andare da A a B e viceversa. G ± 1 indica l energia di attivazione per la transizione A B; G -1 ± indica l energia di attivazione per la transizione B A G è proprio la differenza tra le variazioni di energia libera dei due stati di attivazione. Una probabile via di transizione di un piranosio (come il glucosio) dalla forma a barca a quella a sedia. Lo stato energetico più elevato (stato di transizione) assomiglierà alla struttura a semisedia

38 Teoria dello stato di transizione Reazione catalizzata Reazione catalizzata Gli enzimi provocano una diminuzione dell energia libera di attivazione ( G # ) dello stato di transizione consentendo che una frazione più ampia di molecole reagenti disponga di sufficiente energia per raggiungere questo più basso stato di transizione. Il catalizzatore abbassa l energia libera dello stato di transizione (ovvero stabilizza lo stato di transizione della reazione catalizzata) in modo che si raggiunga l equilibrio più rapidamente senza alterare l equilibrio della reazione. L effettiva velocità con cui i reagenti sono convertiti in prodotti dipende dalla cinetica

39 Interazione E-S Stato di transizione formazione del prodotto rilascio del prodotto E + S <====> E S ====> E + P Legame di uno o più substrati Abbassamento dell energia dello stato di transizione Promozione dell evento catalitico

40 Come fanno gli enzimi ad abbassare l energia di attivazione?.. meccanismo???... EFFETTI DI LEGAME energia di legame stabilizzazione dello stato di transizione prossimità e tensione EFFETTI CHIMICI catalisi acido-base catalisi covalente

41 Due modelli per spiegare l interazione enzima-substrato MODELLO CHIAVE-SERRATURA. In questo modello il sito attivo dell enzima si adatta al substrato come una chiave in una serratura (Fisher, 1894). MODELLO DELL ADATTAMENTO INDOTTO. In questa elaborazione del modello precedente sia l enzima sia il substrato vengono distorti quando si legano tra loro. Il substrato viene forzato ad assumere una conformazione vicina allo stato di transizione; l enzima mantiene il substrato in tensione (Koshland, 1958)

42 Il cambio conformazionale indotto nell esochinasi L enzima induce la molecola del substrato ad adottare una conformazione simile allo stato di transizione

43 EFFETTI DI LEGAME: Energia di legame Energia di legame = energia che si libera dall interazione enzima-substrato Il numero di interazioni deboli è massimo allo stato di transizione - Massima energia liberata- Le interazioni deboli sono ottimali allo stato di transizione Abbassamento dell energia di attivazione Stabilizzazione dello stato di transizione Specificità di substrato

44 Importanza dello stato di transizione In alcuni casi un catalizzatore lega il substrato in una conformazione che è un intermedio obbligato della reazione, ma che possiede una energia minore grazie al favorevole stato energetico dovuto al legame con il catalizzatore. Il risultato è che due barriere più basse sostituiscono una singola barriera di valore elevato. Lo stato intermedio (di transizione) è uno stato semistabile della molecola Postulato di Hammond: se c e un intermedio instabile, lo stato di transizione gli rassomiglierà e quanto più lo stato di transizione assomiglia al prodotto, tanto più veloce è la reazione.

45 EFFETTI DI LEGAME: Energia di legame; prossimità e orientamento Fattori entropici ed entalpici nella catalisi Un enzima lega due reagenti assicurando un corretto orientamento reciproco, o una distanza opportuna e unendoli più saldamente nello stato di transizione

46 Gruppi funzionali vicini e nel corretto orientamento

47 Punti = elettroni non condivisi Frecce ricurve = movimento della coppia di elettroni (direzione: nucleofilo elettrofilo) Come leggere un meccanismo di reazione Se la freccia va da un atomo a un altro atomo: si forma un nuovo legame tra i due atomi.. Se la freccia va da un legame a un atomo: rottura del legame; gli elettroni compaiono come doppietto non condiviso (o carica negativa) sull atomo indicato dalla freccia Se la freccia va da un legame singolo a un altro legame singolo: si forma un doppio legame C C C C C C

48 GRUPPI NUCLEOFILI ED ELETTROFILI DI RILEVANZA BIOLOGICA

49 EFFETTI CHIMICI Catalisi acido-base il pka della catena laterale degli aa può variare in una proteina

50 Catalisi acido-base

51 EFFETTI CHIMICI Catalisi covalente (Ser, Cys, Glu, Asp, Tyr, His) H 2 O R1-COOH

52 EFFETTI CHIMICI Catalisi covalente Triade catalitica: Asp His - Ser His57: posiziona correttamente il gruppo OH della Ser e ne aumenta la nucleofilicità Asp102: posiziona correttamente His57 e ne aumenta la capacità di accettare protoni

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54 Triade catalitica: Asp His Ser presente anche in altre proteasi Es: tripsina (specificità: Lys, Arg) elastasi (specificità: amminoacidi con catene laterali piccole (es: Ala, Ser chimotripsina (specificità amminoacidi aromatici, idrofobici voluminosi) Che cosa conferisce specificità?...

55 ENZIMI CHE RICHIEDONO COFATTORI Catalisi da ioni metallici - orientamento del substrato nel sito attivo - stabilizzazione dello stato di transizione - ossidoriduzione

56 Enzimi che richiedono cofattori

57 MECCANISMI GENERALI DI CATALISI IMPIEGATI DAGLI ENZIMI: riepilogo Effetti di legame: 1. Effetti di vicinanza e orientamento 2. Legame preferenziale dell enzima allo stato di transizione rispetto a reagenti e prodotti Effetti chimici: 3. Catalisi acido-base (trasferimento di protoni da un acido o accettazione di protoni da una base) 4. Catalisi covalente (formazione transiente di un legame covalente tra l enzima e il substrato) 5. Catalisi da metalli (favoriscono il corretto orientamento dei substrati, mediano reazioni redox e stabilizzano/schermano cariche opposte)

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