Identificazione dei microrganismi: dalle tecniche tradizionali alle tecnologie molecolari più avanzate

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1 Identificazione dei microrganismi: dalle tecniche tradizionali alle tecnologie molecolari più avanzate Nicoletta Corbo Laboratorio di Microbiologia e Virologia Azienda Ospedaliera della Provincia di Lecco

2 Louis Pasteur 1864 dimostra scientificamente che i microrganismi sono incapaci di generarsi spontaneamente in un ambiente precedentemente sterilizzato e riparato da contaminazioni esterne Robert Koch 1881 mette a punto un sistema scientifico per studiare i batteri, basato sui terreni di coltura batterici e sviluppa il concetto di coltura pura Hans Christian Gram 1884 mette a punto il metodo della colorazione di Gram, che permette di colorare i batteri per renderli più facilmente visibili e distinguibili al microscopio ottico Alexander Fleming 1929 scopre la penicillina, il capostipite dei moderni antibiotici

3 Dal Fenotipo al Genotipo

4 Fenotipo l'insieme di tutte le caratteristiche osservabili di un organismo vivente, quindi la sua morfologia, il suo sviluppo, le sue proprietà biochimiche e fisiologiche comprensive del comportamento Genotipo la costituzione genetica di un organismo vivente

5 Valutazione delle caratteristiche fenotipiche dei batteri mediante osservazione della morfologia delle colonie

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8 L utilizzo di test biochimici costituisce, insieme all analisi delle caratteristiche Morfologiche: forma colorazione di Gram aspetto delle colonie Fisiologiche: ph temperatura di crescita atmosfera parametri importanti per giungere a riconoscere e distinguere una specie microbica

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10 Identificazione batterica Valutazione delle caratteristiche fenotipiche dei batteri mediante test biochimici effettuati direttamente sulle colonie batteriche isolate

11 Saggio della catalasi Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti. Depositare sul vetrino una goccia di H2O2 al 3%. Stemperare il materiale microbico nella goccia di H2O2. Positività del saggio: formazione di effervescenza dovuta alla liberazione di ossigeno che indica la presenza della catalasi nella coltura saggiata.

12 Saggio dell ossidasi Prelevare una colonia in esame cresciuta su substrato nutritivo agarizzato e stemperarla su carta da filtro (Whatman n 1). Aggiungere alcune gocce di reattivo Positività del saggio: la coltura microbica assume, al massimo entro 10 minuti una colorazione violacea a contatto con il reattivo. La reazione è dovuta all enzima citocromo a3 ossidasi (componente del sistema di trasporto degli elettroni) che riduce il Tetrametil-p-fenilendiammina idrocloride a un composto di colore viola.

13 In passato veniva studiato il metabolismo batterico attraverso l utilizzo di macrometodi verifica dell avvenuta reazione biochimica in provetta, facendo crescere il microrganismo a contatto con il substrato

14 Identificazione Batterica l inoculo della coltura da saggiare viene inoculato in substrati che contengono composti su cui agiscono gli enzimi implicati nello specifico processo metabolico. In genere, il risultato dell attività enzimatica, è accompagnato da modificazioni cromatiche del substrato

15 Successivamente si sono sviluppati sistemi basati sul micro-metodo rappresentato dalle gallerie biochimiche

16 Identificazione delle specie batteriche: probabilità di una corretta identificazione

17 Analisi dei profili metabolici dei ceppi batterici isolati Trasformazione in un codice numerico

18 Profilo metabolico Profilo numerico

19 Le gallerie biochimiche API sono dei sistemi semiautomatici che permettono l identificazione dei batteri

20 Il sistema si basa su gallerie costituite da differenti cupole, ognuna delle quali viene inoculata con la sospensione batterica, permettendo di studiare più attività enzimatiche in poco spazio. Dopo un periodo di incubazione, la cui durata varia a seconda delle diverse gallerie, è possibile procedere all identificazione per mezzo di un lettore automatico che misura la crescita in ogni cupola

21 Tra i sistemi automatici in uso, il sistema automatico VITEK (biomérieux), è uno degli strumenti più comunemente usati per l identificazione batterica

22 Il sistema evidenzia la crescita batterica e le alterazioni metaboliche dei micro-pozzetti di una card di plastica sottile, utilizzando una tecnologia basata sulla fluorescenza

23 Durante questo processo, il software compara la serie di reazioni del test alla serie di reazioni previste per ciascun microrganismo viene così calcolata la probabilità percentuale che si riferisce al grado di concordanza tra i due gruppi di reazioni

24 VANTAGGI DELL AUTOMAZIONE Identificazione in 2-18 ore, con riduzione dei tempi di lavoro

25 VANTAGGI DELL AUTOMAZIONE Identificazione più accurara a livello di specie (prove biochimiche più numerose)

26 VANTAGGI DELL AUTOMAZIONE Refertazione automatizzata Archivio dati Elaborazione dati: epidemiologia

27 Spettrometro di massa, permette l identificazione rapida di microrganismi, basato sulla tecnologia MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight) La spettrometria di massa MALDI-TOF MS è una tecnica analitica che consente di misurare in maniera estremamente accurata il peso molecolare di macromolecole di interesse biologico e di determinare la loro identità in base al rapporto massa/carica (m/z)

28 Si basa sull analisi delle proteine ribosomiali contenute nel campione. Nello spettro di massa, diagramma che riporta l abbondanza degli ioni rilevati in funzione del rapporto massa/carica, ogni picco corrisponde ad una proteina ribosomiale e ciascuno spettro è tipico di un microrganismo

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30 MALDI-TOF ID microbica rapida (pochi minuti) Il sistema è costituito da Sorgente (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Analizzatore (Time Of Flight) PC Fornisce accurate informazioni su struttura e peso molecolare di biomolecole: peptidi proteine oligonucleotidi carboidrati polimeri sintetici

31 MALDI-TOF MS at a glance Rilevamento Rilevatore di ioni m z = 2eU L² t² Separazione Accelerazione Ionizzazione Campo libero elettrodo Zona di accelerazione m: massa z: carica U: accelerazione L: durata t: tempo e: carica elementare La pulsazione laser colpisce la matrice e Desorbimento Matrice & analita Bersaglio le molecole del composto: ionizzazione per trasferimento di carica

32 L identificazione microbica viene raggiunta tramite l ottenimento di spettri, analizzati con l ausilio del database presente nello strumento che utilizziamo, VITEK MS I picchi di questi spettri vengono confrontati con il profilo tipico di una specie, genere o famiglia di microrganismo, per dare una identificazione microbica

33 IDENTIFICAZIONE RAPIDA Trasferimento del campione in provetta Centrifugazione (3500 rpm per 10 min) Semina su piastra Incubazione (3 ore) Identificazione VITEK MS

34 Il gold standard per l identificazione batterica è il sequenziamento dell rrna 16S L analisi della sequenza dell rrna 16S, tramite il confronto con i database di sequenze disponibili on-line, permette di assegnare una precisa identificazione al microrganismo in esame: se due organismi hanno 16S rrna con più del 97% delle basi omologhe, appartengono alla stessa specie

35 Il sequenziamento, tuttavia, è un metodo non applicabile alla routine nei laboratori di Microbiologia Clinica sia per la quantità di campioni da analizzare, sia per i costi di esecuzione

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41 The Most Compelling Test Menu Offering. Available Now Tests MRSA Surveillance SA Nasal Complete C. diff & C. diff/epi vana for VRE MRSA/SA SSTI MRSA/SA Blood Culture EV Flu MTB/RIF CT/NG GBS & GBS Lim Broth Factor II&V 19 Tests Norovirus Carba-R MRSA Surveillance-Next Gen Flu/RSV CW Flu/RSV Trichomonas 33 Tests SA Nasal Complete-Next Gen Pertussis Gastro Panel HSV 1/2 Typing Vaginitis CW Vaginitis CW CT/NG HPV (Cervical CA) HIV Quant HCV Quant HBV Quant BCR-ABL Ultra Breast CA Stratifier Bladder CA Monitor Bladder CA Symptomatic 39 Tests Group A/C Strep Meningitis/Encephalitis GBS Ultra CW GBS Ultra CW Group A/C Strep CW HPV (Cervical CA) Breast CA Signature 16 Tests MRSA Surveillance SA Nasal Complete C. diff/epi vana/vanb for VRE MRSA/SA SSTI MRSA/SA Blood Culture Norovirus (NEW!) EV Flu MTB/RIF CT & CT/NG GBS Factor II&V BCR-ABL Monitor HPV (Cervical CA) (NEW!) 24 Tests Carba-R Trichomonas MRSA Gen 3 Flu/RSV HIV Quant HIV Qualitative HCV Quant BCR-ABL Ultra Bladder CA Monitor/Symptom 33 Tests SA Nasal Complete-Next Gen Group A/C Strep Meningitis/Encephalitis Pertussis Gastro Panel HSV 1/2 Typing Vaginitis GBS Ultra HBV Quant Breast CA Stratifier Breast CA Signature 36 Tests Pancreatic CA Monitor EBV / NPC Screen EBV / NPC Monitor = US Tests = International Tests Notes: Targeted Test Menu Subject to Revision; CW = CLIA-Waived Tests in Italics Represent Product Improvements and are Excluded from Total Test Counts

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