Diagnosi di infezione da virus Dengue: il ruolo del laboratorio

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1 Diagnosi di infezione da virus Dengue: il ruolo del laboratorio Licia Bordi Laboratorio Virologia Famiglia: Flaviviridae Genere: Flavivirus FLAVIVIRUS Dengue West Nile Encefalite Giapponese Febbre Gialla Zika Usutu Foresta di Kyasanur Alkhurma Omsk Encefalite trasmessa da zecca (TBE)

2 Dengue Virus (DENV) 4 sierotipi antigenicamente differenti Denv- Denv-2 Denv-3 Denv-4 Genoma: ssrna(+)

3 DENV è trasmesso all uomo attraverso la puntura di una zanzara infetta. Una volta che l'insetto viene infettato da uno dei virus della dengue, lo rimane per tutta la vita ed è in grado di trasmetterlo dopo 8-0 giorni d' incubazione. Ciclo di trasmissione 2 4 DENV è iniettato in circolo durante il pasto di sangue, con spillover nell epidermide e nel derma (infezione cellule dendritiche e cheratinociti). Le cellule infette migrano nei linfonodi e l infezione è diffusa attraverso il sistema linfatico 33 Sindromi Cliniche da Dengue : Classificazione WHO Ampio spettro di manifestazioni cliniche Il periodo di incubazione è di 2-7 giorni. Febbre Dengue Dengue severa Infezione secondaria da sierotipo differente febbre mal di testa dolori muscolari e articolari rash cutaneo dolore retro-orbitale Sanguinamenti locali di varia entità; petecchie Sindrome emorragica Grave compromissione degli organi Sindrome da Shock

4 Negli ultimi 50 anni, l incidenza è aumentata di circa 30 volte

5 Casi di Dengue riscontrati all INMI L. Spallanzani nel in viaggiatori provenienti da zone endemiche Dei 30 casi con PCR positiva, 0 erano Den-( ), 6 Den-2 ( ), 6 Den-3 ( ), 3 Den-4 ( ), 5 non caratterizzati Dengue in Promed, ultimi 6 mesi del 204: 678 allerte

6 Diagnosi di infezione da DENV Metodi diretti Ricerca di RNA virale Ricerca di antigeni virali Isolamento virale Metodi indiretti ELISA Immunofluorescenza indiretta (IFA) Test di microneutralizzazione METODI DIRETTI : Isolamento Virale (BSL3) C6/36 e AP6 (cellule di zanzara): Sono le linee cellulari più permissive per la crescita del virus; non si osserva però Effetto Citopatico (CPE) per cui la presenza di virus viene evidenziata mediante RT- PCR sul terreno di coltura prelevato 6gg dopo l infezione oppure mediante anticorpi monoclonali sierotipo-specifici) Vero E6 e LLC-MK2(cellule di rene di scimmia): meno permissive; ma una volta isolato il virus, si osserva un chiaro CPE Inoculo intracranico nel topo neonato Su quali campioni biologici? Sangue intero Siero o plasma urine Tessuti (fegato, milza e altri tessuti) Vero E6 Mock Vero E6 CPE

7 METODI DIRETTI 2: Rilevazione dell antigene Saggi basati sulla rilevazione NS: glicoproteina altamente conservata prodotta sia in forma associata alla membrana che in forma solubile fortemente immunogenica; stimola anticorpi con attività fissante il complemento presente in elevate concentrazioni nel siero di pazienti infetti in fase acuta molto precocemente (-9gg dopo comparsa sintomi) Saggi ELISA Test rapidi immunocromatografici Su quali campioni biologici? Siero o plasma Sangue intero Pos Neg Comparazione di tre saggi commerciali per la cattura dell antigene NS Pannello di 450 sieri di cui 220 positivi al Dengue e 230 negativi pan-e rileva con > efficienza Den-2; Platelia il Den-; STRIP ha la stessa efficienza di rilevazione per Den- e-2 ; tutti e tre i test rilevano con < efficienza Den-3 Si osserva per alcuni kit cross-reattività con altri virus (vedi tabella) PLoS Negl Trop Dis. 200 Jul 6;4(7):e738

8 Comparazione di tre saggi commerciali per la cattura dell antigene NS Sieri positivi all isolamento virale sono rilevati meglio da tutti e tre i test rispetto ai positivi in PCR STRIP ha una maggiore efficienza nel rilevare sia infezioni primarie che secondarie; Platelia rileva meglio infezioni primarie rispetto alle secondarie; pan-e ha la minore efficienza di rilevazione per entrambi le infezioni L utilizzo di kit basati sulla rilevazione dell antigene NS in combinazione con IgM MAC-ELISA potrebbe essere ottimale PLoS Negl Trop Dis. 200 Jul 6;4(7):e738 METODI DIRETTI 3: Rilevazione dell antigene o dell RNA Immunoistochimica: Gli antigeni possono essere visualizzati in sezioni di tessuto usando anticorpi monoclonali marcati Fegato: depositi granulari cell di Kupffer e endotelio (Fig A) Macrofagi alveolari (Fig B) Polmoni: lume vascolare monociti ed endotelio (Fig C) Milza: citoplasma di macrofagi e cellule binucleate (Fig. E) Polpa bianca, tessuti linfoidi,simil-immunoblasti e similcentroblasti (Fig.G) Linfociti periferici(fig. I) Ibridazione in situ: l RNA virale può essere visualizzato in sezioni di tessuto usando riboprobes antisenso marcati Polpa rossa splenica: citoplasma dei macrofagi (Fig.D) e cellule binucleate (Fig.F) Polpa bianca simil- centroblasti e simil-immunoblasti e (Fig. H) Linfociti periferici e linfociti (Fig. J) Su quali campioni biologici? Sezioni di tessuto (autopsia o biopsia) congelate o in paraffina JID 2004:89 (5 April) 4

9 METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell RNA mediante PCR Real-Time PCR (3 UTR) Journal of Clinical Virology 45 (2009) 6-66 Modificata RT-PCR one step o nested di famiglia (NS5) e sequenziamento I Round II Round Vector Borne Zoonotic Dis ;7(4): Modificata

10 METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell RNA mediante PCR Su quali campioni biologici? Siero: la carica virale è molto alta nei primi giorni dopo l inizio della sintomatologia e si riscontra fino a 5-7 giorni

11 METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell RNA mediante PCR Su quali campioni biologici? Siero: la carica virale è molto alta nei primi giorni dopo l inizio della sintomatologia e si riscontra fino a 5-7 giorni Urine: La carica virale è più bassa rispetto al siero ma il virus permane fino a circa 4 giorni Saliva: La carica virale è più bassa rispetto al siero ma il virus è stato riscontrato anche dopo 8 giorni dalla comparsa dei sintomi N:B: Urine e saliva possono essere utili nei casi in cui non si riscontra più il virus nel sangue e anche laddove fosse difficile prelevare il sangue (es bambini con sindrome emorragica) METODI INDIRETTI: saggi sierologici La risposta immunitaria all infezione da Dengue consiste nella produzione di Immunoglobuline (IgM, IgG, IgA) specifiche, principalmente dirette verso la proteina E Poiché la proteina E contiene determinanti antigenici comuni a tutti i flavivirus, si osserva una marcata cross-reattività tra i membri della famiglia flavivirus Durante una infezione primaria la risposta IgM è generalmente ad alti titoli e più specifica rispetto alla secondaria La risposta delle IgG è a titoli più alti in una infezione secondaria rispetto alla primaria E difficile, se non impossibile, usare la sierologia per identificare il sierotipo in seguito ad infezione primaria recente, poiché gli anticorpi prodotti sono cross-reattivi con gli altri sierotipi Gli anticorpi che si formano in seguito ad infezione secondaria non solo sono crossreattivi tre i differenti sierotipi, ma sono fortemente cross-reattivi anche con altri flavivirus

12 METODI INDIRETTI : saggi basati sulla rilevazione di IgM La maggior parte dei saggi per la rilevazione delle IgM utilizza antigeni ricombinanti verso la proteina E dei 4 sierotipi Saggi ELISA per le IgM: I micro-pozzetti sono rivestiti da antigeni del virus. I campioni di siero, pretrattati con sostanza in grado di catturare le IgG, vengono incubati nei pozzetti e tutte le IgM presenti nel campione vanno a legarsi nei pozzetti con l antigene. Dopo lavaggio per rimuovere i legami aspecifici, un coniugato anti IgM viene dispensato e consente poi la rilevazione delle IgM Saggi ELISA a cattura per le IgM: I micro-pozzetti sono rivestiti da anticorpi anti-igm umane. Una volta diluiti, i campioni di siero e i controlli vengono incubati nei pozzetti e tutte le IgM presenti nel campione vanno a legarsi nei pozzetti agli anticorpi anti-umano (specifici per IgM). I reattivi aspecifici vengono allontanati mediante lavaggi. Gli antigeni del virus della dengue vengono poi aggiunti nei pozzetti e incubati, così che, se nel campione sono presenti IgM anti-dvf, gli antigeni di DVF andranno a legarsi a tali anticorpi specifici nei relativi pozzetti Test rapidi per IgM che sfruttano l immunocromatografia o le particelle agglutinanti (antigeni ricombinanti) 350 sieri testati da 9 laboratori Emerging Infectious Diseases Vol. 5, No. 3, March 2009

13 Sensibilità e specificità per i test ELISA Sensibilità e specificità per i test rapidi Le metodiche ELISA sembrano avere un miglior compromesso sensibilità/specificità rispetto ai test rapidi, che risultano molto variabili in termini di sensibilità Si sono riscontrati falsi positivi dovuti ad infezione con Malaria, infezione pregressa da Dengue,positività per fattore reumatoide Da tener presente che, poiché le IgM possono persistere anche per > 60 giorni, i saggi per le IgM non dovrebbero essere utilizzati come test di conferma in paesi dove la Dengue è endemica I test per IgM devono essere supportati da altre evidenze diagnostchei, in aggiunta alla clinica e alle informazioni epidemiologiche; è fonfdamentale dimostrare una sieroconversione utilizzando una coppia di sieri METODI INDIRETTI 2: saggi basati sulla rilevazione di IgG Dengue IgG ELISA indiretta Dengue IgG ELISA a cattura Ratio Result < 0.8 Negative 0.8 < Ratio <. borderline. positive 65 sieri: 40: campioni di donatori sani di Zanzibar 9: Campioni da 7 pazienti con diagnosi di Dengue effettuata all INMI : Campione da paziente negativo 2: Pazienti con AHFV o WNV 3: pazienti con IgM/IgG perebv/ CMV/ B9/ Rosolia/ Morbillo/ HAV Test N. positives (prevalence) Sensitivity Specificity VVP VPN IFA in house 75/65 (45.5%) 00% 00% 00% 00% Euroimmun DENV IgG indirect ELISA Panbio DENV IgG indirect ELISA Panbio DENV IgG capture ELISA Gold standard: IFA 98/65 (59.4%) 96% 7.% 73.5% 95.5% 09/65 (66.%) 98.7% 6.% 67.9% 98.2% 4/65(2.4%) 5.3% 00% 00% 55.9%

14 Gold standard:ifa Test N. positives Sensitivity IFA in house 7 00% Euroimmun DENV IgG indirect ELISA Panbio DENV IgG indirect ELISA Panbio DENV IgG capture ELISA 5 7.4% % 4.3% Sieri di 7 pazienti con diagnosi di Dengue confermata mediante PCR e IFA IgM e IgG analizzati con i tre metodi ELISA Pazienti con altre infezioni da Flavivirus DIAGNOSIS TEST IFA Euroimmune DENV Panbio DENV IgG Panbio DENV IgG IgG indirect ELISA indirect ELISA capture ELISA AHFV POS POS POS NEG WNV POS POS POS NEG TBE equivocal borderline POS NEG JEV equivocal POS POS NEG YFV vaccine equivocal NEG equivocal NEG Metodi indiretti 3: Test di Microneutralizzazione (BSL3) Diluizioni Seriali dei sieri sieri Piastra di Vero E6 /2 ora 37 C 00 TCID 50 /pozz aggiunta Virus.5x0 4 cell/pozz 3-4 giorni 37 C Titolazione CPE Non consente di discriminare tra differenti sierotipi di dengue Consente di fare diagnosi differenziale con altri flavivirus

15 Campione Negativo : non compaiono altre bande oltre a quella di controllo (C). Campione Positivo per le IgM Dengue: appare una banda violacea nella porzione posta subito sotto la banda di controllo (M) Campione Positivo per le IgG Dengue: appare una banda violacea nella porzione posta più distalmente rispetto alla banda di controllo (G) Campione Positivo per le IgG e le IgM Dengue: appaiono 2 bande violacee in corrispondenza delle posizioni (G) ed (M) N.B. Il risultato positivo non esclude la presenza di altri virus, né identifica il sierotipo specifico. In caso di negatività non si può escludere che la concentrazione degli antigeni del virus nel campione sia inferiore al limite di rilevazione del test. METODI INDIRETTI 4: (BSL3) Immunofluorescenza con vetrini home-made Allestimento di vetrini per IFA mediante infezione di colture cellulari di C6/36 e di Vero E6 Risultati: Vetrini C6/36: poco idonei a causa di un alta fluorescenza di fondo, dovuta verosimilmente alla presenza nei sieri umani di anticorpi diretti contro le cellule di insetto controllo Negativo Vetrini Vero E6: non presentano fluorescenza di fondo, consentendo una più nitida lettura dei risultati Campione Positivo

16 METODI INDIRETTI 5: Immunofluorescenza con vetrini commerciali per flavivirus L utilizzo L di vetrini a mosaico in grado di vedere i 4 sierotipi di Dengue e altri Flavivirus (TBE,YF,WN,JE) ha un valore aggiunto: In alcuni casi mette in luce la presenza di anticorpi specifici per altri flavivirus in assenza di anticorpi per dengue (es: YF) In altri casi la forte creoss-reattività delle IgG per tutti i flavivirus in presenza di IgM cross-reattive può essere un campanello di allarme A recent experience at INMI Symptoms: 2 days later, during the flight to Italy, he developed high fever, shaking chills, anorexia, malaise, nausea and vomiting, Over the following 5 days the symptoms worsened and he was admitted to hospital (May 0) Travel history and retrospective reconstruction of possible exposure: Frequent traveler; (vaccinated against yellow fever in 998). April 29 he visited the camel market of Shalatin; tick bite on a foot, followed by a small papular lesion and (48 hours after the bite) blurred vision Laboratory results: Aetiology: not defined leukopenia (white blood cells: 2250/mmc), thrombocytopenia (platelets: 67000/mmc); increased liver enzymes (AST 469, ALT 406 U/L) d Discharged days after hospitalization, in good general condition despite persistence of asthenia

17 Samples were referred to the Virology Lab at INMI with request for Dengue and WNV serology for retrospective diagnosis Collection date Sample type WNV Serology Dengue Serology May 0 th (Day 0 post exposure) Serum IgG: :640 IgM: :20 IgG: :640 IgM: :20 May 27th Serum IgG: :640 IgM: :20 IgG: :640 IgM: :20 Sequence analysis of NS5 Mosquito-borne Flaviviruses Tick-borne Flaviviruses

18 Diagnosi sierologica infezione primaria ELISA / IFA IgM: 5 giorni dalla comparsa dei sintomi (80% casi) IgG: 7 giorni dopo la comparsa dei sintomi RT-PCR / real-time RT-PCR RNA virale nel siero fino a 5-7 giorni dalla comparsa dei sintomi RNA virale nellle urine e nella saliva fino a 4 giorni dalla comparsa dei sintomi Identificazione del sierotipo Ricerca Antigene NS 9/0 giorni dalla comparsa dei sintomi Diagnosi sierologica infezione secondaria ELISA / IFA IgM hanno titoli più bassi e durano meno. IgG presenti durante la fase viremica ed aumentano velocemente

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20 Handbook for Clinical Management of Dengue Who s next?