La replicazione del DNA

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2 La replicazione del DNA

3 Mappa del cromosoma di E. coli in cui sono indicate le posizioni dei geni che codificano proteine importanti per il metabolismo del DNA

4 L esperimento di Meselson e Stahl (1957): la replicazione del DNA è semiconservativa.

5 E possibile visualizzare il DNA marcato con 14 N e 15 N separato con centrifugazione in un gradiente di densità di cloruro di cesio. Fotografia dopo irradiazione con luce ultravioletta.

6 e quantizzarlo (analisi densitometrica)

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8 John Cairns, mediante marcatura con trizio ( 3 H) dimostrò che entrambe le catene vengono replicate contemporaneamente (la catena nuova è in rosso).

9 La replicazione dei cromosomi batterici è bidirezionale Replicazione bidirezionale Forcelle di replicazione Origine Replicazione unidirezionale Entrambe le estremità delle anse hanno forcelle di replicazione Origine

10 E possibile visualizzare il DNA parzialmente denaturato Le anse di replicazione iniziano sempre in un punto preciso, chiamato origine.

11 La sintesi del DNA avviene in direzione 5 3 ed è discontinua. Catena veloce Catena lenta Le catene di DNA a livello della forcella di replicazione

12 Enzimi che degradano il DNA Gli enzimi che degradano specificamente il DNA sono chiamati nucleasi o Dnasi. Le esonucleasi degradano il DNA a partire da un estremit estremità della molecola. Alcuni enzimi possono operare solo in direzione 5 3, 5, altri in direzione 3 5,, rimuovendo rispettivamente i nucleotidi a partire dall estremit estremità 5 o dall estremit estremità 3 di una catena di acido nucleico a doppia elica. Le endonucleasi agiscono sulla porzione interna degli acidi nucleici, degradandoli in frammenti sempre più piccoli. Alcune importanti endonucleasi (es.: endonucleasi di restrizione) effettuano tagli solo in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche.

13 Il DNA viene sintetizzato dalle DNA polimerasi Arthur Kornberg nel 1955 purificò e caratterizzò la prima DNA polimerasi di E. coli. Questo enzima a singola catena polipeptidica è ora chiamato DNA polimerasi I. I In seguito si è scoperto che E. coli contiene almeno altre quattro DNA polimerasi

14 La DNA polimerasi catalizza la formazione dei ponti fosfodiestere La reazione di allungamento della catena, catalizzata dalla DNA polimerasi, procede attraverso un attacco nucleofilico del gruppo ossidrilico terminale 3 -OH3 del primer sull atomo di fosforo più interno (gruppo fosforico α) di un deossiribonucleoside trifosfato.

15 Nuovo deossinucleoside 5 -trifosfato da aggiungere Catena nascente di DNA (primer) Catena stampo di DNA Deossiribosio (dnmp) n + dntp (dnmp) n+1 + PP i DNA DNA allungato di un nucleotide

16 Per vedere questa immagine occorre QuickTime e un decompressore Animation.

17 Il DNA viene sintetizzato dalle DNA polimerasi Tutte le DNA polimerasi necessitano di uno stampo. Tutte le DNA polimerasi necessitano di una molecola di innesco o primer. Il numero medio di nucleotidi aggiunti prima che la polimerasi si dissoci determina la sua processività.. Le diverse DNA polimerasi sono caratterizzate da processività molto variabili.

18 Il frammento di Klenow della DNA polimerasi I Sono note le strutture tridimensionali di molte DNA polimerasi. La prima struttura determinata è stata quella del cosidetto frammento di Klenow della DNA polimerasi I di E. coli. Questo frammento comprende le due parti principali dell enzima, enzima, l unitl unità con attività polimerasica e l unitl unità con attività esonucleasica 3 5.

19 Tutte le DNA polimerasi hanno proprietà strutturali simili Le DNA polimerasi sono notevolmente simili nella loro forma generale. I domini dita e pollice si avvolgono intorno al DNA e lo tengono in posizione in modo che possa attraversare il sito attivo dell enzima, enzima, costituito principalmente da residui del dominio palmo. Tutte le polimerasi catalizzano lo stesso tipo di reazione, che dipende dalla presenza di ioni metallici. Oltre al dominio con attività polimerasica, il frammento di Klenow comprende un dominio con attività esonucleasica in direzione 3 5 3

20 Alla reazione di polimerizzazione partecipano due ioni metallici Come tutti gli enzimi i cui substrati sono nucleosidi trifosfato, le DNA polimerasi richiedono ioni metallici (generalmente Mg 2+ ) per il loro funzionamento. Uno ione metallico lega i deossinucleosidi trifosfato (dntp) e il gruppo ossidrilico in posizione 3 3 del primer. Entrambi gli ioni metallici interagiscono con il gruppo carbossilico di due residui di aspartato del dominio palmo della polimerasi,, che contribuiscono a mantenere gli ioni nella giusta posizione. Lo ione metallico legato al primer attiva il gruppo ossidrilico 3, 3, facilitando l attacco l nucleofilo al gruppo fosforico α del dntp. I due ioni metallici stabilizzano la carica negativa che si accumula nello stato di transizione pentacoordinato. Lo ione metallico inizialmente legato al dntp stabilizza la carica negativa sul pirofosfato che viene prodotto.

21 La replicazione del DNA deve procedere con un grado elevato di precisione. In E. coli viene commesso un errore ogni nucleotidi aggiunti. Nel caso del cromosoma di E. coli, lungo circa 4,6 x 10 6 coppie di basi, questo significa un errore ogni replicazioni. Durante la polimerizzazione, la distinzione tra nucleotidi corretti e sbagliati consiste non solo nei legami idrogeno che conducono ad un corretto to appaiamento tra basi complementari, ma anche nel riconoscimento della geometria delle coppie di basi A=T e G C.

22 Contributo della geometria delle coppie di basi alla replicazione fedele del DNA Le coppie standard A=T e G C hanno una geometria molto simile

23 La geometria di coppie di basi sbagliate le esclude dal sito attivo perché la DNA polimerasi I ha un sito attivo in cui tali coppie non possono entrare.

24 Selettività di forma Il legame di un nucleoside trifosfato (NTP) alla DNA polimerasi, induce un cambio conformazionale che genera una tasca dove possono alloggiare il nucleotide e il suo complementare sul filamento stampo. Questo cambiamento conformazionale può avvenire solo se il nucleotide da d aggiungere corrisponde a quello complementare sul filamento stampo secondo l appaiamento di Watson e Crick.

25 Le DNA polimerasi formano due legami idrogeno con le coppie di basi b presenti nel solco minore Tra i meccanismi che contribuiscono ad aumentare la fedeltà della replicazione del DNA da parte delle DNA polimerasi vi sono i legami idrogeno formati da alcuni residui dell enzima enzima con il lato della scanalatura minore che si trova in contatto con il sito attivo. Nella scanalatura minore gli accettori di legami idrogeno si trovano sempre nelle stesse posizioni in tutti gli appaiamenti di basi del tipo Watson e Crick ck. Questi legami idrogeno che si stabiliscono tra l enzima l ed il substrato agiscono come righello graduato che misura se nel sito attivo si viene a trovare un appaiamento paiamento di basi con una corretta disposizione spaziale.

26 Accurati studi in vitro hanno dimostrato che le DNA polimerasi inseriscono un nucleotide sbagliato ogni Spesso tali errori accadono perché i nucleotidi si presentano per breve tempo in una forma tautomerica insolita che permette la formazione di legami idrogeno con una base normalmente non complementare. L attività esonucleasica 3 5 (proofreading o di correzione delle bozze) delle DNA polimerasi serve a ridurre questa frequenza di errori.

27 Attività esonucleasica 3 5 (proofreading)) della DNA polimerasi I

28 Attività esonucleasica 3 5 (proofreading)) della DNA polimerasi I

29 Correzione di bozze La catena polinucleotidica in formazione abbandona occasionalmente il sito polimerasico della DNA polimerasi I e si sposta verso il sito esonucleasico. Il meccanismo di correzione di bozze si basa sul fatto che l estremitl estremità di un filamento in corso di sintesi contenente un nucleotide erroneamente appaiato ha una maggiore probabilità di abbandonare il sito attivo della polimerasi e di avvicinarsi al sito esonucleasico.

30 Combinando l attivitl attività proofreading e la selezione delle basi, una DNA polimerasi commette circa 1 errore ogni coppie di basi. La maggiore precisione riscontrata nella replicazione del DNA di E.coli è dovuta all azione azione degli enzimi del riparo.

31 Nel 1969 John Cairns isolò un ceppo batterico in cui il gene della DNA polimerasi I era mutato e l enzima l prodotto era inattivo. Il ceppo, sebbene più sensibile all azione azione di agenti che danneggiano il DNA, era vitale!

32 Escherichia coli possiede almeno cinque DNA polimerasi. La DNA polimerasi II ha una funzione altamente specializzata nel riparo del DNA. La DNA polimerasi III è il più importante enzima della replicazione di E. coli. Le DNA polimerasi IV e V,, isolate nel 1999, sono coinvolte in un particolare processo di riparazione, la riparazione soggetta ad errori o risposta SOS.

33 DNA polimerasi I La DNA polimerasi I ha una serie di funzioni di pulizia durante la replicazione,, la ricombinazione e il riparo. La DNA polimerasi I è l unica DNA polimerasi di E. coli provvista di attività esonucleasica 5 3. Quando la regione contenente l attivitl attività esonucleasica 5 3 della DNA polimerasi I viene rimossa mediante un blando trattamento con proteasi,, il frammento rimanente (Mr( = ) mantiene l attivitl attività polimerasica e di proofreading e viene chiamato frammento di Klenow.

34 Il frammento di Klenow della DNA polimerasi I

35 Nick translation,, una attività di cui è dotata solo la DNA polimerasi I L attività 5 3 esonucleasica della DNA polimerasi I è in grado di degradare una catena di RNA o di DNA legata allo stampo e di sostituire simultaneamente la catena degradata con l attivitl attività polimerasica.

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37 DNA polimerasi III La DNA polimerasi III è molto più complessa della DNA polimerasi I. La sua struttura multimerica comprende 10 diverse subunità ed ha una massa di circa 900 kd. Le attività di polimerizzazione e di proofreading risiedono in due subunità diverse, le subunità α e ε rispettivamente. La subunità θ associata con α e ε forma il nucleo della polimerasi,, in grado di sintetizzare il DNA anche se con bassa processività (numero di nucleotidi aggiunti prima che l enzima l si dissoci). Due nuclei αεθ si organizzano a costituire un dimero asimmetrico.

38 Struttura proposta per l oloenzima l della DNA polimerasi III

39 L oloenzima è organizzato come un dimero per permettere di replicare entrambi i filamenti del DNA parentale. L oloenzima è asimmetrico perché la catena veloce e quella lenta sono sintetizzati con modalità differenti. Una subunità τ 2 è associata con una parte dell enzima; enzima; una subunità γ 2 e le subunità (δδ δδ χψ) 2 sono dall altra altra parte. Un complesso αεθ è associato con ciascuna delle due regioni.

40 La processività è conferita dalle subunità β 2 e τ 2. Le due subunità β della DNA polimerasi III di E. coli formano una struttura a forma di ciambella che avvolge il DNA e agisce come una pinza. Ciascuno dei dimeri di subunità β si associa con un core cataliticamente attivo e scivola lungo il DNA con il procedere della replicazione. La pinza formata dalle subunità β aumenta la processività della polimerasi fino a volte perché evita la dissociazione dell enzima. enzima.

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43 La replicazione del DNA richiede numerosi enzimi e fattori proteici ici. L intero complesso è detto replisoma. Le elicasi si muovono lungo il DNA e separano le catene usando l energia dell ATP. Le topoisomerasi risolovono la tensione topologica nella struttura ad elica del DNA che si genera con la separazione delle catene. Le proteine che legano il DNA a singolo filamento stabilizzano le catene separate. Le primasi sintetizzano i primer (generalmente brevi frammenti di RNA). La DNA polimerasi I rimuove i primer e li sostituisce con DNA. Le DNA ligasi riparano le interruzioni dei legami fosfodiesterici che rimangono dopo l azione l della DNA polimerasi I.

44 La replicazione del DNA Inizio Allungamento Termine

45 oric, origine della replicazione di E.coli (245 bp)

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47 Modello dell inizio della replicazione all origine di E. coli, oric DnaA si lega alle 4 sequenze ripetute di 9 coppie di basi Attraverso una reazione che richiede ATP ed è facilitata dalla proteina HU, la proteina DnaA riconosce e denatura le 3 sequenze ripetute di 13 bp,, ricche in A=T. DNA girasi (TopoII) SSB Facilitano il disavvolgimento da parte di DnaB La proteina DnaB si lega a questa regione denaturata con una reazione che richiede DnaC. Due esameri di DnaB,, che funzionano come elicasi, disavvolgono il DNA in entrambe le direzioni, creando due potenziali forcelle di replicazione

48 Modello dell inizio della replicazione all origine di E. coli, oric L origine della replicazione è influenzata dalla metilazione del DNA da parte della metilasi Dam (5 -GA m TC-3 ) La regione oric dell elica neosintetizzata è emimetilata ed interagisce con la membrana plasmatica. DNA girasi (TopoII) SSB Facilitano il disavvolgimento da parte di DnaB La regione oric deve essere nuovamente metilata dalla Dam metilasi prima che possa legare nuovamente DnaA e iniziare la replicazione.

49 Allungamento (catena veloce) La sintesi della catena veloce incomincia con la sintesi da parte di una primasi (DnaG)) di un breve primer di RNA (da 10 a 60 nucleotidi) all origine della replicazione. I deossiribonucleotidi vengono poi aggiunti al primer da parte della DNA polimerasi III. Una volta iniziata, la sintesi della catena veloce procede in modo continuo, avanzando di pari passo con la forcella di replicazione.

50 Allungamento (catena lenta) La sintesi della catena lenta viene compiuta tramite corti frammenti di Okazaki. Inizialmente il primer è sintetizzato dalla primasi. Come nella sintesi della catena veloce, la DNA polimerasi III si lega al primer e aggiunge deossiribonucleotidi. La complessità della replicazione sta nel coordinamento della sintesi delle due catene: entrambe le catene sono prodotte contemporaneamente da un singolo dimero asimmetrico della DNA polimerasi III. Il DNA della catena lenta si piega ad anello, di modo che i due percorsi di polimerizzazione possano procedere insieme.

51 Sintesi dei frammenti di Okazaki (DnaG)

52 Sia la catena veloce che la catena lenta sono prodotte da un singolo dimero asimmetrico di DNA polimerasi III (γ 2 δδ χψ)

53 Sia la catena veloce che la catena lenta sono prodotte da un singolo dimero asimmetrico di DNA polimerasi III

55 Quando il frammento di Okazaki neosintetizzato è completo, il primer viene rimosso dalla DNA polimerasi I e rimpiazzato da DNA. L interruzione che rimane viene ricucita dalla DNA ligasi. Catena lenta

56 La DNA ligasi catalizza la formazione di un legame fosfodiesterico tra l ossidrile l all estremit estremità 3 di una catena di DNA e il fosfato all estremit estremità 5 di un altra catena. Il fosfato deve essere attivato tramite adenilazione. lisina

57 Meccanismo di azione della DNA ligasi

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59 Le due forcelle di replicazione del cromosoma circolare di E. coli si incontrano in una regione terminale contenente copie multiple di una sequenza di 20 coppie di basi detta Ter ( termine ) Origine Forcella in senso antiorario Forcella in senso orario Trappola per la forcella in senso orario Trappola per la forcella in senso antiorario La proteina Tus (terminus utilization substance) lega la sequenza Ter Quando una delle due forcelle di replicazione incontra un complesso funzionale Tus-Ter, si ferma; l altra forcella si ferma quando incontra la prima forcella già ferma.

60 Termine della replicazione del cromosoma di E. coli. A replicazione avvenuta, i due cromosomi figli rimangono intersecati come catenanes, e non possono separarsi perché entrambi sono chiusi covalentemente. Forcella in senso antiorario Forcella in senso orario Fine della replicazione Cromosomi Intersecati (catenanes) Cromosomi separati DNA topoisomerasi IV In E. coli,, la separazione dei catenanes richiede l azione l dell enzima enzima topoisomerasi IV,, che separa i due cromosomi intersecati rompendo temporaneamente entrambe le catene di uno dei cromosomi e permettendo all altro altro di passare attraverso l interruzione.

61 La replicazione del DNA negli eucarioti. Nel lievito le origini della replicazione sono sequenze di circa 150 coppie di basi dette replicatori (o ARS, autonomously replicating sequences) L inizio della replicazione in tutti gli eucarioti richiede una proteina multimerica, ORC (origin recognition complex), che si lega a numerose sequenze contenute nel replicatore. ORC interagisce ed è regolata da varie altre proteine coinvolte nel controllo del ciclo cellulare eucariotico. Come i batteri anche le cellule eucariotiche possiedono vari tipi di DNA polimerasi. La replicazione dei cromosomi nucleari è effettuata dalla DNA polimerasi α, dalla DNA polimerasi δ e dalla DNA polimerasi ε.

62 La replicazionedna polimerasi α La DNA polimerasi α è un enzima multimerico. Una delle subunità ha attività primasica; ; la subunità maggiore contiene l attività polimerasica. La DNA polimerasi α non è dotata di attività 3 5 esonucleasica di proofreading e probabilmente funziona per la sintesi dei primer per i frammenti di Okazaki.

63 DNA polimerasi δ La DNA polimerasi δ è costituita da due subunità. La DNA polimerasi δ è dotata di attività 3 5 esonucleasica di proofreading e probabilmente è responsabile della sintesi della catena veloce e della catena lenta agendo come un complesso analogo alla DNA polimerasi III batterica. La DNA polimerasi δ è associata a una proteina chiamata antigene nucleare della cellula proliferante (PCNA), che sembra avere una funzione analoga a quella della subunità β della DNA polimerasi III di E. coli formando una sorta di pinza circolare che aumenta la processività dell enzima. enzima.

64 La DNA polimerasi ε è probabilmente coinvolta nella rimozione dei primer dei frammenti di Okazaki (come DNA pol I di E. coli) ) e nel riparo del DNA. La proteina di replicazione A (RPA) è una proteina che lega il DNA a singola elica e svolge una funzione analoga a quella della proteina SSB di E. coli. Il fattore di replicazione C (RFC)) interagisce con PCNA e facilita l assemblaggio dei complessi replicativi attivi.

65 I telomeri sono strutture caratteristiche alle estremità dei cromosomi lineari Mentre i genomi di quasi tutti i procarioti sono circolari, i cromosomi degli esseri umani e di altri eucarioti sono lineari. E difficile replicare interamente le estremità di un DNA lineare, perché le polimerasi agiscono solo in direzione Dopo la rimozione del primer di RNA la catena ritardata avrà quindi una estremità 5 incompleta. Ogni ciclo di replicazione accorcerà ulteriormente il cromosoma. Soluzione del problema: Le sequenze che si trovano all estremit estremità dei cromosomi, dette telomeri,, hanno caratteristiche di sequenza e strutturali particolari. Il DNA telomerico contiene centinaia di ripetizioni in fila di una sequenza di sei nucleotidi ricca in G su uno dei due filamenti (nell uomo AGGGTT). Il filamento ricco in G è leggermente più lungo dell altro. Speciali enzimi, le telomerasi,, sono necessari per la sintesi dei telomeri.

66 Formazione dei telomeri I telomeri sono replicati dalla telomerasi. La telomerasi è una trascrittasi inversa specializzata che contiene il proprio stampo di RNA.