OSSALATI URINARI in UV e/o in FLUORIMETRIA FAST Codice Z32610

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1 OSSALATI URINARI in UV e/o in FLUORIMETRIA FAST Codice Z32610 BIOCHIMICA Gli ossalati introdotti con la dieta vengono per la maggior parte eliminati immodificati con le urine. Se nella dieta è contenuta una elevata quantità di calcio, la quantità di ossalato assorbita dall intestino tende a diminuire poiché l ossalato viene precipitato come ossalato di calcio; la iperossaluria è quindi facilmente riscontrabile nei soggetti a dieta ricca di ossalati e povera di calcio quale può essere una dieta vegetariana che favorisce infatti la formazione di calcoli di ossalato di calcio. Altre condizioni nelle quali si può verificare un elevato assorbimento intestinale di ossalati sono costituite dalle sindromi di malassorbimento e da resezioni dell intestino tenue. Esiste anche una forma di iperossaluria primitiva, rara alterazione congenita del metabolismo caratterizzata dalla eliminazione con le urine di una elevata quantità di ossalato di calcio con conseguente formazione di calcoli di ossalato di calcio e da gravi alterazioni renali (nefrocalcinosi). Oltre che nel rene si possono formare depositi di ossalato di calcio anche in vari tessuti (ossalosi). La malattia si manifesta nei primi anni di vita con coliche renali ed ematuria dovuta alla formazione di calcoli e di depositi di ossalato di calcio a livello renale. Col progredire delle alterazioni si manifestano i segni della insufficienza renale cronica ed il malato muore non di rado prima dei 20 anni con un quadro di uremia. Nei soggetti affetti da iperossaluria primitiva la quantità di ossalati urinari nelle 24 ore aumenta sensibilmente raggiungendo punte di mg/24 ore. Il presente metodo consente di analizzare quantitativamente in HPLC l Acido Ossalico presente nelle urine come Ossalato. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 001 Ossalati urinari in UV e/o Fluorimetria - FAST Agosto

2 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: L Acido Ossalico, presente nelle urine come Ossalato, viene precipitato selettivamente con due reagenti specifici. Dopo un lavaggio con due soluzioni diverse, l Ossalato viene riportato in soluzione e derivatizzato. La soluzione così ottenuta, diluita con lo stabilizzante, viene iniettata direttamente in HPLC. Recupero del Metodo : > 93% Sensibilità del Metodo : Valori di riferimento : Range dinamico del metodo : CV%: Contenuto della confezione : Reagente A Soluzione Tampone, 1 x 100 ml Reagente B Soluzione Precipitante, 1 x 100 ml Reagente C Soluzione di Lavaggio 1, 1 x 200 ml Reagente D Soluzione di Lavaggio 2, 1 x 200 ml 0,1 mg/l 3,0 30,0 mg/24 h 0,1 600 mg/l 2,0% intra serie 2,4% inter serie Tutti i reagenti sono pronti all'uso, eccetto il Reagente G Sol. di Derivatizzazione, e stabili 3 anni a 2-8 C. La presenza di corpo di fondo è normale. Agitare prima dell uso. La presenza di corpo di fondo è normale. Agitare prima dell uso. Reagente E Soluzione Estraente, 1 x 50 ml Reagente F Soluzione Stabilizzante, 1 x 50 ml Reagente G Soluzione di Derivatizzazione, 4 x 30 mg Ogni flacone va ricostituito con 5 ml di Reagente L - Solubilizzante Reagente H Calibratore liofilo urinario, 2 x 5 ml Vedi Avvertenze Reagente I Soluzione Test Derivatizzata, 1 x 2 ml Reagente L Solubilizzante, 1 x 20 ml Reagente M Fase Mobile, 2 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Modalità per il prelievo : Fase preanalitica : Strumento HPLC isocratico con loop da 50 µl. Detector spettrofotometrico UV λ=320 nm Detector Fluorimetrico λ EX =320 nm λ EM =420 nm Autocampionatore. Raccolta urinaria delle 24 ore con aggiunta di 5 ml di HCl 2 N. Verificare che il campione abbia un ph circa uguale a 3; eventualmente correggerlo con HCl 2 M o NaOH 2 N Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Campione stabile 4 settimane a 2-8 C o 2 mesi a 20 C. 2

3 PROCEDURA PREANALITICA Diluizione 1:10 del Reagente I Soluzione Test Derivatizzata In una provetta pipettare: 0,9 ml di Reagente M Fase Mobile 0,1 ml di Reagente I Soluzione Test Derivatizzata NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 10 µl di questa soluzione in HPLC per identificare il tempo di ritenzione dell Ossalato che deve essere simile a quello riportato in fig.1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questo Test così ottenuto non deve essere usato come calibratore PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Ricostituzione del Reagente G Sol. di Derivatizzazione Aggiungere al flacone contenente il Reagente G in polvere 5 ml di Reagente L - Solubilizzante. Una volta ricostituito il Reagente G è stabile circa 2 mesi a 2 8 C a riparo dalla luce. FASE 2 : In provette di plastica da centrifuga da 10 ml dispensare in sequenza: Calibratore Campione Campione 1,00 ml Reagente H Calibratore urinario 1,00 ml Reagente A Soluzione Tampone 1,00 ml 1,00 ml Reagente B Soluzione Precipitante 1,00 ml 1,00 ml Al vortex per 20 secondi Centrifugare a rpm per 2 minuti Aspirare e gettare tutto il surnatante FASE 3 : Lavare il precipitato aggiungendo in sequenza: 2 ml di Reagente C Sol.di Lavaggio 1 2 ml di Reagente D Sol.di Lavaggio 2 Al vortex per 20 secondi Centrifugare a rpm per 2 minuti Aspirare e gettare tutto il surnatante Release N 001 Ossalati urinari in UV e/o Fluorimetria - FAST Agosto

4 FASE 4 : Aggiungere al precipitato 0,5 ml di Reagente E Sol. Estraente 0,5 ml di Reagente F Sol. Stabilizzante Al vortex fino a quando tutto il precipitato non si è solubilizzato FASE 5 : Trasferire tutto il contenuto in provette di vetro da 10 ml con tappo a vite e setto in teflon ed aggiungere 0,2 ml di Reagente G Sol. di Derivatizzazione (dopo ricostituzione come indicato nella FASE 1) Al vortex per 10 secondi FASE 6 : Porre in stufa a 120 C per 16 ore e Raffreddare FASE 7 : Diluire il derivatizzato 1:40 con Acqua grado HPLC N.B.: il campione così preparato è stabile 3 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 10 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma Release N 001 Ossalati urinari in UV e/o Fluorimetria - FAST Agosto

5 OSSALATI URINARI Avvertenze REAGENTE H : CALIBRATORE URINARIO LIOFILO - Lotto n 004 OSSALATO Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. Aggiungere esattamente 5 ml di H 2 O e agitare delicatamente per 15 minuti fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Agitare sempre prima dell uso. Conservazione e stabilità : i Calibratori liofili sono stabili 36 mesi dalla data di preparazione se conservati a 2 8 C. Almeno 12 ore a T Ambiente, 7 giorni se conservati a 2 8 C ed 1 mese a -20 C una volta ricostituiti. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 2 x 5 ml Precauzioni : questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. 55,0 mg/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN 320 nm 0,001 AUFS PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO λ EX λ EM GAIN 320 nm 420 nm MEDIUM PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase POROSHELL 120 EC-C18 4,6 x 50 mm, 2,7 µ, è tassativo l uso dei Prefiltri Javelin (1 x 10 pz.) cod. S CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase POROSHELL 120 EC-C18 4,6 x 50 mm, 2,7 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Acetonitrile o Metanolo ( 20:80 v/v ) al flusso di 1 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Filtrare la fase mobile con pompa da vuoto e filtro idoneo da 0,22 µ. Condizionare la colonna con 15 ml di una soluzione di H 2 O : Acetonitrile o Metanolo ( 20:80 v/v ) al flusso di 1 ml/minuto e scaricare. Condizionare ulteriormente per 15 minuti anche a ricircolo di fase. E possibile effettuare analisi a ricircolo di fase, purchè si abbia l accortezza di filtrare la stessa Fase Mobile con filtro da 0,22 µ prima di ogni seduta analitica. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O : Acetonitrile o Metanolo ( 80:20 v/v ) al flusso di 1 ml/minuto e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Acetonitrile o Metanolo ( 20:80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 15 ml di H 2 O : Acetonitrile o Metanolo ( 20:80 v/v ) al flusso di 1 ml/minuto prima di condizionarla con la Fase Mobile. Si raccomanda di eseguire il lavaggio della colonna alla fine di ogni seduta analitica. LOOP 50 µl Flusso di lavoro consigliato 1 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 110 bar 5

6 ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z32216 Calibratore urinario per Citrati/Ossalati 4 x 5 ml Z32217 Controllo urinario per Citrati/Ossalati Livello 1 5 x 5 ml Z32218 Controllo urinario per Citrati/Ossalati Livello 2 5 x 5 ml Z32219 Controllo urinario per Citrati/Ossalati Livelli 1 e 2 2 x 5 x 5 ml Z Colonna Analitica Poroshell 120 EC-C18 (50 x 4,6mm 2,7 um) 1 PZ S Prefiltri Javelin 1 x 10 PZ S29057U Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 100 PZ 6

7 OSSALATI URINARI (Cromatogrammi di Riferimento FLD=Fluorimetria; VWD=UV) Fig. 1 : Soluzione Test Fig. 2 : Calibratore urinario R.T. 2.2 Ossalato R.T. 2.2 Ossalato 55 mg/l 7

8 OSSALATI URINARI (Cromatogrammi di Riferimento FLD=Fluorimetria; VWD=UV) Fig. 3 : Controllo alto Fig. 4 : Campione di urina R.T. 2.2 Ossalato 108 mg/l R.T. 2.2 Ossalato 31 mg/l 8